细胞回收装置的制作方法

1.本发明涉及主要以生命科学研究为目的而使用的细胞回收装置。


背景技术：

2.由于下一代测序技术的出现，可分析细胞的各种信息，结果发现，与以往的概念不同，由单细胞增殖的细胞结集即使是同一细胞，其性状也会随着时间的推移而在细胞间产生很大的差异。例如，虽然是相同的癌细胞种类，但存在某种浓度的抗癌剂有效的细胞和无效的细胞。因此，如果不在各个细胞水平下进行分析，就不可能有效地进行抗体药物开发、再生医学领域、糖尿病、变态反应、阿尔茨海默病等疾病的阐明，现状是单细胞分析技术正变得不可或缺。
3.随着生命科学研究的这种变化，出现了各种各样的分离单细胞的装置(以下，称为“细胞分离装置”)，大的趋势是可分类为手动操作型的、每单位时间的细胞处理数低的低端产品和自动处理型的、每单位时间的细胞处理数高的高端产品。但是，后者的产品占据其中大半。
4.作为高端产品的特征，如以下的专利文献的实例所示，存在将重点放在通过图像自动检测目标细胞上的产品、为了容易且可靠地进行目标细胞的回收而将重点放在细胞容器的设计上的产品等。因此，可基于细胞的荧光信号等，几乎全自动地在短时间内分离数千个这种规模的细胞。
5.另一方面，作为低端产品的特征，基本结构是将用于使用者直接目视确认细胞的显微镜图像的显示器、用于手动搜寻目标细胞的位置调整装置和用于物理抽吸目标细胞的微小玻璃管组合而成的。虽然无法在短时间内分离大量的细胞，但具有使用者可对细胞一边确认一边分离的优点。
6.现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2016-000007号公报，专利文献2：日本特开2017-108738号公报，专利文献3：日本特开2014-132897号公报。


技术实现要素：

7.发明所要解决的课题在上述高端产品中，虽然可在短时间内回收大量的细胞，但无法保证回收的细胞是想要的细胞。在低端产品中，由于用户一边观察显微镜图像一边确认而进行分离，所以用户可分离目标细胞的比例增大。但是，为了以判断是否为目标细胞所需要的倍率进行观察，需要将透镜的倍率提高到20倍左右，另一方面，为了搜索细胞，需要以低倍率扩大视野，因此存在必须频繁变更透镜倍率的麻烦。此外，在旋转显微镜的转换器(revolver)以将放大倍率从低倍率变更为高倍率的情况下，视野多少会发生偏移，因此在低倍率下的观察中发
现的细胞必须在高倍率下再次搜寻的情况也不在少数。
8.本发明的目的在于，提供可不旋转转换器而一键式地切换观察不同放大倍率的显微镜图像的细胞回收装置。
9.解决课题的手段本技术发明人经过锐意研究，结果想到，通过在将要观察的细胞容纳在透明容器中的同时，设置从细胞的上方观察的光学系统和从细胞的下方观察的光学系统，预先设定使这两个光学系统的放大倍率不同，并且，使这两个光学系统的光轴一致，由此可一键式地切换观察不同放大倍率的显微镜图像，从而完成了本发明。
10.即，本发明提供以下内容。
11.(1) 细胞回收装置，其是具备对容纳在透明容器中的细胞进行放大观察的光学系统的细胞回收装置，其中，所述光学系统具备对所述细胞从该细胞的上方观察的第1光学系统和从该细胞的下方观察的第2光学系统，所述第1光学系统与所述第2光学系统的放大倍率不同，并且，所述第1光学系统和所述第2光学系统的光轴一致。
12.(2) 根据(1)所述的细胞回收装置，其中，所述第1光学系统的放大倍率比所述第2光学系统的放大倍率低。
13.(3) 根据(2)所述的细胞回收装置，其中，所述第1光学系统的放大倍率为4倍~10倍，所述第2光学系统的放大倍率为20倍~40倍。
14.(4) 根据(1)~(3)中任一项所述的细胞回收装置，其中，所述第1光学系统具备第1光源，所述第2光学系统具备第2光源，利用所述第1光源可通过所述第1光学系统和所述第2光学系统进行观察，利用所述第2光源可通过所述第2光学系统和所述第1光学系统进行观察。
15.(5) 根据(4)所述的细胞回收装置，其中，所述第1光源与所述第2光源的种类不同。
16.(6) 根据(1)~(5)中任一项所述的细胞回收装置，其中，具备细胞抽吸装置，所述细胞抽吸装置具备电渗流泵，该细胞抽吸装置在所述电渗流泵的前端侧具备抽吸细胞的毛细管，在所述电渗流泵的基端侧具备与所述细胞的培养液连通的虹吸管。
17.(7) 根据(6)所述的细胞回收装置，其中，具备载置有容纳所述细胞的所述容器的二维工作台，具备驱动所述第1光学系统和所述细胞抽吸装置的第1驱动系统和驱动所述二维工作台的第2驱动系统，所述第1驱动系统和所述第2驱动系统相互独立，并且，所述第1驱动系统的分辨率比所述第2驱动系统的分辨率小。
18.(8) 根据(1)~(7)中任一项所述的细胞回收装置用于回收单个细胞的用途。
19.(9) 单个细胞的回收方法，其中，包括从容纳在根据(1)~(7)中任一项所述的细胞回收装置的所述容器中的细胞中回收单个细胞。
20.发明的效果根据本发明的细胞回收装置，可一键式地切换观察不同放大倍率的显微镜图像。
附图说明
21.[图1] 图1是示出成为本发明的一个实施例的细胞回收装置的外观的示意性透视图。
具体实施方式
[0022]
本发明的细胞回收装置具备对容纳在透明容器中的细胞进行放大观察的光学系统(显微镜)。该光学系统具备对细胞从细胞的上方观察的第1光学系统和从细胞的下方观察的第2光学系统。第1光学系统与第2光学系统的放大倍率不同，并且，第1光学系统与第2光学系统的光轴一致。
[0023]
由于两个光学系统的光轴一致，所以通过该结构，可以不同的放大倍率从细胞的上方和下方同时且经常地观察细胞，可不进行如旋转转换器那样的操作，而一键式地切换以用监视器观察基于2种放大倍率的显微镜图像。由于不旋转转换器，所以不同的放大倍率下的观察图像的视野不会偏移。
[0024]
上述第1光学系统的放大倍率优选比上述第2光学系统的放大倍率低。这是因为，浸泡细胞的培养液的液面有时会摇晃，低倍率时这样的液面摇晃的影响较小。在从下方观察的第2光学系统中，由于从容器的底面侧观察细胞，所以不容易受到这样的液面摇晃的影响，因此也不会对高倍率下的观察造成障碍。通常，第1光学系统的放大倍率为4倍~10倍左右，第2光学系统的放大倍率为20倍~40倍左右，但也不一定限定于此。
[0025]
优选第1光学系统具备第1光源，第2光学系统具备第2光源。在这种情况下，由于两个光学系统的光轴一致，所以利用第1光源可通过第1光学系统和第2光学系统两者进行观察，利用第2光源可通过第2光学系统和第1光学系统进行观察。两个光源可以是相同的光源，但通过使用不同种类的光源，可进行使用不同种类光源的观察，因此是有利的。例如，可将第1光源设为白色光源进行通常的观察，将第2光源设为适合于荧光观察的蓝色光源。
[0026]
本发明的细胞回收装置优选具备细胞抽吸装置，所述细胞抽吸装置具备电渗流泵。细胞抽吸装置中，优选在电渗流泵的前端侧具备抽吸细胞的毛细管，在电渗流泵的基端侧具备与细胞的培养液连通的虹吸管。在这种情况下，在使用时，将虹吸管浸渍在细胞的培养液内，预先用培养液充满毛细管、电渗流泵和虹吸管内。由此，可使毛细管、电渗流泵和虹吸管整体的内部的液压均匀，不会受到液体的影响，仅通过对电渗流泵施加的电压即可使电渗流泵准确地工作，可进行具有重现性的精密的抽吸和排出动作。
[0027]
本发明的细胞回收装置中，优选具备载置有容纳细胞的上述容器的二维工作台，具备驱动第1光学系统和细胞抽吸装置的第1驱动系统和驱动二维工作台的第2驱动系统。而且，优选第1驱动系统和第2驱动系统相互独立，并且，上述第1驱动系统的分辨率比上述第2驱动系统的分辨率小。通过该结构，需要移动长距离的细胞抽吸装置(如后述的实施例所述，利用细胞抽吸装置抽吸的细胞被转移到如微孔板的孔那样的细胞容纳容器中)和低分辨率光学系统可利用低分辨率驱动系统迅速地移动，需要精密移动的二维工作台的移动可利用高分辨率驱动系统进行，从而可大幅提高细胞回收的操作效率。
[0028]
以下，基于实施例对本发明进行具体的说明。但是，本发明不限定于下述实施例。
实施例
[0029]
图1是示出本发明的细胞回收装置的外观的图。在主板101上配置有细胞回收驱动系统x轴102，在其末端连结有成为使x轴旋转的动力源的细胞回收驱动系统x轴马达103。细胞回收驱动系统x轴102与x轴滑块104的螺孔嵌合，而且x轴滑块104的下部也嵌入x轴导向槽105中，因此通过细胞回收驱动系统x轴102旋转，x轴滑块104进行直进运动。在细胞回收
驱动系统x轴102的对向平行地配置有x轴导向杆(未图示)，x轴导向滑块106以与x轴滑块104成对的形式安装在x轴导向杆上，沿着导向杆进行直进运动。通过将这2个滑块连结，可更稳定地进行直进运动。x轴滑块104与x轴导向滑块106的连结使用细胞回收驱动系统y轴107。由此，可在y方向进行直进运动的y轴滑块108的控制与x轴的控制复合，从而可向xy两个方向自由移动。此外，在y轴滑块108的上表面连结细胞回收驱动系统z轴109，z轴滑块110相对于xy平面沿竖直方向进行直进运动。因此，z轴滑块110的位置可在三维上自由地控制。
[0030]
在z轴滑块110上安装有小板111，在该板上安装有低倍率光学系统镜筒112和电渗流泵导向件113，它们可与z轴滑块110一同上下移动。此外，在低倍率光学系统镜筒112的下方连接低倍率物镜114，在上方连接低倍率摄像机115。另外，在低倍率光学系统镜筒112的侧方连接低倍率用光源116，从而可通过同轴照明进行摄影。另一方面，在电渗流泵导向件113上连结用于抽吸细胞的电渗流泵117，可调整位置和角度。另外，对电渗流泵117供给电力的电源缆线118与控制箱119连接。在控制箱119内容纳有电压控制基板，根据来自控制计算机等的指示，可输出任意的电压。此外，摄像机、光源、各轴的驱动马达等也全部与控制箱119连接，根据需要分别进行控制。
[0031]
此外，在主板101上，在位于低倍率物镜114的基本位置下方的位置设置有细胞搜索用二维工作台120。细胞搜索用二维工作台120连接有可在x方向和y方向上驱动的精密轴和使这些轴旋转来进行位移的精密马达。精密轴的螺距为0.1mm~1mm左右，精密马达的旋转分辨率为1/1024~1/4096左右，因此可进行驱动分辨率为2微米以下的非常高精度的位置控制。精密马达也通过缆线与控制箱119连接，根据来自于控制计算机等的指示，可移动到任意的位置。如上所述，可高分辨率且宽范围地驱动的自动工作台非常昂贵，但在本发明中宽范围的驱动作为细胞回收驱动系统分离出来，所以细胞搜索用二维工作台120只要可驱动15毫米见方~35毫米见方左右即可。在细胞搜索用二维工作台120上，在位于低倍率物镜114的基本位置下方的位置还设置有细胞容器121。可利用各种容器作为细胞容器121，但为了防止因细胞悬浮液的蒸发引起的动作不稳定，底深且带有罩的皿型容器容易操作。在细胞容器罩122的中央设置有与细胞搜索用二维工作台120的驱动范围对应的形状的开口部，与电渗流泵117的前端连接的毛细管123穿过该开口部进入细胞容器121内部，进行细胞抽吸。此时所需要的电渗流泵117的上下移动通过细胞回收驱动系统z轴109的旋转来实施。
[0032]
需说明的是，在与电渗流泵117的毛细管侧相反一侧的末端部连接有虹吸管124，虹吸管124的前端穿过设置于细胞容器罩122边缘的孔浸渍在细胞悬浮液内。这是本技术发明人独创的结构。通过用液体充满包含毛细管123在内的电渗流泵117整体和虹吸管124，相同的水压作用于毛细管123的前端和电渗流泵117的末端，因此只要不对电渗流泵117施加电压，就完全不产生液流，可实现稳定的动作。在不使用这样的结构的情况下，由于电渗流泵117的末端部的液面位置因细胞悬浮液的抽吸和排出而变化，所以作用于毛细管123的水压也变化。由此，通过有别于电压的因素产生液流，因此特别是细胞的操作所需要的极微量液流的控制变得非常困难。
[0033]
在通过电渗流泵117的电压控制适当地抽吸细胞后，将电渗流泵117从细胞容器121中拉起，驱动细胞回收驱动系统x轴102和107细胞回收驱动系统y轴107，在设置于配置在主板101上的细胞回收容器125中的多个孔中，将毛细管123插入到目标位置并排出细胞。仅通过电压的控制即可高精度地实施细胞的抽吸和排出所需要的极微量液流的控制是电
渗流泵的特征。在结束细胞的排出后，再次将毛细管123返回到细胞容器中，进行下一个细胞的搜索。
[0034]
细胞的搜索也可仅通过与低倍率光学系统连接的低倍率摄像机115的图像来进行，但为了更准确地确认是用户要回收的细胞，利用高倍率光学系统可观察到细胞的形态或表面状态更佳。为了迅速地执行该操作，在本实施例的细胞回收装置中，在细胞容器121的底面侧配置有高倍率光学系统。高倍率光学系统与低倍率光学系统同样地由高倍率光学系统镜筒126、高倍率摄像机127、高倍率用光源128构成。高倍率摄像机127和高倍率用光源128与控制箱119连接，根据来自于控制计算机的指示，可立即进行图像的拍摄和显示。将高倍率光学系统配置于细胞容器的底面侧的原因是，通常高倍率透镜的景深较小，若从上方进行摄影，则容易受到液面变化的影响。低倍率物镜和高倍率物镜的倍率的组合设为5倍和20倍是一个实例，但组合可根据要回收的细胞的大小、形状来变更。无论哪种情况，通过将倍率限定为两种，都可形成图1所示的上下夹着细胞容器进行观察的结构。
[0035]
该方式的第一优点是，若预先调整使得两个光学系统的光轴一致，则可使视野的中心总是相同。因此，通过调整毛细管123的位置以便在视野的中心处抽吸细胞，可利用低倍率光学系统在广视野中高效地进行细胞搜索，使要回收的细胞移动到视野的中心，并立即切换为高倍率摄像机的图像进行细胞的详细确认。该方式的第二优点是这样的倍率切换不需要时间。若是通常的显微镜，则倍率的切换需要使物镜物理移动的操作，因此该操作无论如何也需要数秒。但若是本发明的细胞回收装置的方式，则倍率的切换仅通过利用软件进行摄像机的切换即可完成，因此可瞬间切换。若仅回收一个细胞，则该时间不产生太大的影响，但在96孔型的回收容器中一个一个地回收细胞那样的实验中，整体的处理时间会以数分钟为单位产生差异。由于存在想要使回收的细胞尽快移动到适合于培养或分析的环境中的情况，所以该时间的差异有时会对实验的精度产生大的影响。
[0036]
此外，作为第三优点，该方式还具有可切换用于细胞摄影的光源的特征。例如在用低倍率光学系统搜索细胞的情况下，低倍率用光源116通常采用用于确认细胞的明场像的白色光源，而高倍率用光源128采用用于检测细胞的荧光的蓝色光源等，也可将其用于低倍率下的细胞搜索。因为两个光学系统的光轴一致而使这成为可能，在想要从细胞结集中仅回收发出荧光的细胞那样的用途中是非常便利的。与此同样，在用高倍率光学系统详细地观察细胞的情况下，也可利用低倍率用光源116。通常，在观察细胞的明场像的情况下，与同轴照明相比，利用聚光的透过照明可得到更清晰的细胞图像，因此这样的照明方法更适合于目的。由于照明的切换也可经由控制箱119利用软件瞬间进行，所以也易于根据情况用两种照明进行相同倍率的摄影。作为这样的用途的一个实例，可列举出：首先利用灵敏度高的荧光进行细胞的搜索，接着切换为明场像以确认细胞实际存在，或防止不发荧光的细胞存在于附近而误抽吸，等等。这些用途在想要可靠地仅回收一个细胞的目的方面是极其重要的。
[0037]
在这样确定了应回收的细胞后，需要进行利用电渗流泵的抽吸和保持、向细胞回收容器的规定孔位置的移动、细胞向孔中的排出、向细胞搜索位置的返回这样的一系列操作。首先，关于细胞的抽吸、保持和排出，如上所述，电渗流泵的动作因利用虹吸管124而稳定化，因此可通过依次输出预先设定的电压而自动地实施。另外，关于向规定位置的移动，由于是可进行三维位置控制的结构，所以只要预先指定细胞回收容器的形状，则也可自动
地实施。因此，用户只要进行目标细胞的确认和指定即可，此后的回收操作可通过按一次按钮程度的操作容易且迅速地执行。
[0038]
控制箱119与pc (未图示，个人计算机)连接。在使用时，一边观察与该pc连接的监视器(未图示)，一边主要通过鼠标操作回收细胞。用户目视确认监视器上显示的细胞，若其为回收对象就点击该细胞，则软件转换监视器坐标(点击坐标)和机械坐标，自动地执行位移以使目标细胞来到“目标位置”。
[0039]
为了准确地转换监视器坐标和机械坐标，需要预先进行校准操作。具体而言，启动校准模式，点击位于画面左上方的细胞等的标记。接着，用箭头键等手动移动工作台，使得该标记尽可能来到右下方(初始位置的对角位置)，再一次点击标记。由此，从2次点击位置知晓监视器坐标的位移，工作台的位移量通过手动操作中发送多少移动指令来知晓，因此确定监视器坐标与机械坐标的转换所需要的系数。
[0040]“目标位置”指定相对于监视器中显示的毛细管的前端在多大程度的前面位置持有细胞，若过远，则抽吸力不起作用而无法抽吸，若过近，则会卡在毛细管壁的厚度形成的高低差上而仍然无法抽吸。这是由实验确定的，可知大约50μm左右的值为佳。目标位置通过如下来确定：预先将软件切换为目标位置指定模式，点击监视器中显示的毛细管前端50μm左右的位置。若确定了目标位置，则在监视器上显示“ ”记号。
[0041]
以上的事前设定基本上只要进行一次即可。设定后，用户点击要取的细胞，并目视确认细胞移动到“ ”记号的位置，若没有问题则点击“抽吸”按钮，对电渗流泵施加电压，从而抽吸细胞。如果确认抽吸也可没有问题地执行，则点击“排出到板”按钮，自动进行向板的孔移动并施加排出电压的行程。
[0042]
需说明的是，如上所述使用pc的控制或软件本身多用于公知的细胞回收装置，只要是本领域技术人员则可容易地实施。
[0043]
若总结上面已述的本实施例的细胞回收装置的特征，则如下。
[0044]
(1) 用于搜索细胞容器内的细胞的高分辨率驱动系统与用于将抽吸的细胞转移到回收容器的宽范围驱动系统分离。需说明的是，此处所谓的“分离”是在功能上可分离独立地驱动的意思，因此高分辨率驱动系统也可搭载在宽范围驱动系统之上。即，例如也可形成如下等结构：不将z轴和y轴单元连结，光学系统和细胞回收系统仅进行上下移动，取而代之，在将x轴和y轴组合而成的二维的宽范围驱动系统上安装板，进而在其上搭载高分辨率驱动系统。在这种情况下，首先通过宽范围驱动系统粗略地(意指与10μm左右的细胞尺寸相比是粗略的，但在20μm左右的分辨率下可以控制)进行细胞容器与回收容器之间的移动时，预先使细胞回收系统向上移动，从此处使细胞回收系统下降，进而对于所瞄准的细胞可通过高分辨率驱动系统进行微妙的位置调整。
[0045]
(2) 特征在于，抽吸和/或排出细胞的装置为电渗流泵，从与该电渗流泵的前端连接的细胞抽吸器具到与该电渗流泵的末端连接的管都用液体连续地充满，并且，在抽吸细胞的阶段中，它们都浸渍在细胞悬浮液的内部。需说明的是，与电渗流泵的末端连接的管所浸渍的位置希望在细胞搜索范围之外，只要是细胞悬浮液和液面共有的构造，则完全不存在细胞的区域亦可。
[0046]
(3) 特征在于，在细胞容器的上方配置有低倍率光学系统，在下方配置有高倍率光学系统，这些光学系统的光轴一致。此外，特征在于，利用从低倍率光学系统侧入射的照
明光可通过高倍率光学系统进行细胞的观察和摄影，且/或，利用从高倍率光学系统侧入射的照明光可通过低倍率光学系统进行细胞的观察和摄影。需说明的是，此处所谓的“低倍率”是指使用4倍~10倍左右的物镜，此处所谓的“高倍率”是指使用20倍~40倍左右的物镜。根据需要，也可使用倍率可变的透镜。
[0047]
符号说明101 主板，102 细胞回收驱动系统x轴，103 细胞回收驱动系统x轴马达，104 x轴滑块，105 x轴导向槽，106 x轴导向滑块，107 细胞回收驱动系统y轴，108 y轴滑块，109 细胞回收驱动系统z轴，110 z轴滑块，111 小板，112 低倍率光学系统镜筒，113 电渗流泵导向件，114 低倍率物镜，115 低倍率摄像机，116 低倍率用光源，117 电渗流泵，118 电源缆线，119 控制箱，120 细胞搜索用二维工作台，121 细胞容器，122 细胞容器罩，123 毛细管，124 虹吸管，125 细胞回收容器，126 高倍率光学系统镜筒，127 高倍率摄像机，128 高倍率用光源。