一种油莎豆茎叶和油菜秸秆混合青贮的方法

1.本发明涉及农产品加工技术领域中，一种油莎豆茎叶和油菜秸秆混合青贮的方法。


背景技术：

2.油莎豆(又称虎坚果，汕莎草)，属莎草科一年生植物，适应性极强。它是一种优质、高产、综合利用价值很高的油、粮多用新型作物。叶子针形细而长，株高1米左右，生长旺盛，分蘖力强，地下结块茎。产量高，一般亩产鲜豆1000kg，油莎草3000-5000kg，种1亩油莎豆相当于7-10亩油菜。其茎叶部分粗蛋白含量》10％dm，与全株玉米或燕麦相当，是一种非常有潜力的优良饲草原料。油莎豆茎叶的干物质含量约为20％，由于水分偏高不利于青贮。油莎豆茎叶营养丰富，含粗脂肪7.6％～8.9％、糖10.6％，粗蛋白9.8％和粗纤维19.3％，仅作为补充的生物燃料无法充分利用其营养价值，造成资源的浪费。进一步开发茎叶饲用化利用方式，可扩大油莎豆经济效益，促进油莎豆产业快速发展。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何对油莎豆茎叶进行青贮。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备油莎豆茎叶青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与复配菌剂混合，得到发酵前混合物，将所述发酵前混合物进行固体厌氧发酵，收集发酵产物，得到油莎豆青贮饲料；
5.所述青贮原料为由油莎豆茎叶与油菜秸秆组成的混合物，或为油莎豆茎叶自然萎凋得到的预处理油莎豆茎叶；
6.所述复配菌剂的活性成分为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)。
7.上述方法中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)可为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01
8.所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)可为布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205，所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为cgmcc no.16534的菌株。
9.上述方法所述复配菌剂中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)的配比可为1:1。
10.所述复配菌剂还可含有糖蜜。
11.在本发明的一个实施例中，所述复配菌剂由糖蜜、所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)和生理盐水组成，其中，糖蜜、所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)的含量为0.05g/g、8.5
×
108cfu/g、8.5
×
108cfu/g。
12.上述方法所述发酵前混合物中油莎豆茎叶与油菜秸秆的质量比可为4:1。所述自
然萎凋可于通风阴凉处进行。所述自然萎凋的时间可为18-24h。
13.所述青贮原料还可利用水调整其干物质含量，所述青贮原料中干物质含量可为60％。
14.所述油莎豆茎叶和所述油菜秸秆均可为小于2cm的小段。
15.上述方法所述发酵前混合物中，糖蜜、所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)的含量可为0.0005g/g、8.5
×
106cfu/g、8.5
×
106cfu/g。
16.上述方法中，所述发酵可在20～25℃进行。
17.所述发酵时间可为30-90天。进一步，所述发酵时间为60天。
18.所述发酵可在真空、密封、避光条件下进行，具体可在密封的聚乙烯袋中进行。
19.利用所述制备油莎豆青贮饲料的方法制备得到的油莎豆青贮饲料，也属于本发明的保护范围。
20.所述复配菌剂，也属于本发明的保护范围。
21.本发明还提供了复合乳酸菌制剂，所述复合乳酸菌制剂的活性成分为所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)。
22.所述复合乳酸菌制剂中所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)的活菌数之比为1:1。
23.本发明还提供了布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.16534。
24.本发明还提供了一种菌剂，其活性成分为所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205。
25.本发明还提供了用于制备油莎豆青贮饲料的组合物，其由所述复配菌剂与所述青贮原料组成。
26.所述制备油莎豆青贮饲料的方法，或所述油莎豆青贮饲料，或所述复配菌剂，或所述复合乳酸菌制剂，或所述酶制剂，或所述布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205或，所述菌剂，或所述组合物在制备动物饲料中的应用，也属于本发明的保护范围。
27.所述动物可为反刍动物。
28.本发明通过添加复配菌剂发酵预处理的油莎豆茎叶，发酵后的油莎豆茎叶同时具有低ph值、乳酸菌数量多、无霉变、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量低的特点，可作为饲料使用，能够提高养殖户的经济效益。
29.生物材料保藏说明
30.分类命名：布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)
31.菌株编号：nx205
32.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
33.保藏单位简称：cgmcc
34.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
35.保藏日期：2018-9-26
36.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.16534
附图说明
37.图1为混合青贮油莎豆茎叶发酵前后有机酸含量变化。
38.图2为混合青贮油莎豆茎叶发酵前后微生物菌群变化。ck1-6分别为对照组的六个重复，lm1-6为试验组的六个重复。
39.图3为混合青贮油莎豆茎叶发酵前后有机酸含量变化。
40.图4为萎凋青贮油莎豆茎叶发酵前后微生物菌群变化。wck1-6分别为对照组的六个重复，wlm1-6为试验组的六个重复。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
42.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
43.实施例1、油莎豆和油菜混合青贮饲料的制备
44.本实施例利用用于油莎豆和油菜混合青贮的复合乳酸菌制剂制备油莎豆和油菜混合青贮饲料，该复合乳酸菌制剂包含植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01(简称为植物乳杆菌wq-01)和布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205(简称为布氏乳杆菌nx205)。
45.其中，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01记载在中国专利申请202010258231.8(申请公布号cn 111534456 a)中。
46.布氏乳杆菌nx205为骆爱群从宁夏贺兰县甜高粱中分离得到的菌株nx205，其分离鉴定步骤如下：
47.1)用天平准确称取10.00g甜高粱样品，与90ml无菌水充分混合，摇床150rpm室温震荡30min，用四层纱布过滤得到浸出液，梯度稀释后用灭菌涂布棒均匀涂布于mrs固体培养基上，置于37℃，厌氧培养48h。
48.2)待mrs固体培养基长出菌落后，用灭菌的接种环挑取白色，光滑形凸起，边缘整齐的菌落，接种到3ml mrs液体培养基中，置于37℃，静置厌氧培养48h。
49.3)待mrs液体培养基中有菌体长出后，用1ml移液器将菌液转移至用灭过菌的离心管中，12000rpm离心3min后收集菌体，由北京睿博兴科生物技术有限公司提取基因组dna(细菌基因组dna快速提取试剂盒，博迈德，货号：dl111-02)作为模板，使用通用引物(27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，1492r：5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)对16s dna进行pcr扩增，以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。使用pcr产物纯化回收试剂盒(博迈德，货号：dh102-02)对pcr扩增产物进行纯化回收，再进行测序，菌株nx205的序列为序列表中序列1。
50.菌株nx205为杆状。使用ncbi对测序后的序列进行比对，菌株nx205鉴定为布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)，记为布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)nx205，该菌株已于2018年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号
为cgmcc no.16534。
51.一、复合青贮菌剂的制备
52.利用mrs液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号m8540-250g)培养植物乳杆菌wq-01，培养条件为37℃厌氧培养48小时，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到植物乳杆菌wq-01菌剂。
53.利用mrs液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号m8540-250g)培养布氏乳杆菌nx205，培养条件为37℃厌氧培养48小时，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到布氏乳杆菌nx205菌剂。
54.将植物乳杆菌wq-01菌剂、布氏乳杆菌nx205菌剂按照1:1的活菌比混合后，加入生理盐水，得到复合青贮菌剂。
55.二、复配菌剂的制备
56.将糖蜜与步骤一得到的复合青贮菌剂混合，得到复配菌剂，所得复配菌剂中糖蜜与植物乳杆菌wq-01、布氏乳杆菌nx205的含量为0.05g/g、8.5
×
108cfu/g、8.5
×
108cfu/g。
57.三、油莎豆和油菜混合青贮饲料的制备
58.将生育后期的油莎豆茎叶(即地上部分)和盛花期油菜秸秆切割(长度《2cm)后备用；将切割后的油莎豆茎叶与油菜秸秆按4:1的质量比均匀(混合青贮)或将切割后的油莎豆茎叶单独置于通风阴凉处自然萎凋24h(萎凋青贮)，而后用蒸馏水调整干物质含量在60％左右，得到预处理油莎豆茎叶。
59.将步骤二所得复配菌剂均匀喷洒到所得预处理油莎豆茎叶中，得到发酵前混合物，其中复配菌剂与预处理油莎豆茎叶的质量配比为1:100，搅拌均匀，取300g装入聚乙烯袋中，抽真空后避光青贮发酵60天，室内平均温度在20～25℃之间。
60.四、油莎豆和油菜混合青贮饲料的检测
61.取青贮发酵60天前后的样品由cvas饲料分析中国服务中心检测干物质含量(dm)；粗蛋白(cp)、中性洗涤纤维(ndf)、酸性洗涤纤维(adf)、酸性洗涤木质素(adl)和可溶性碳水化合物(wsc)的含量。检测方法依据https://chinese.foragelab.com/resources/lab-procedures所述。
62.青贮60天后取样，取10.0g样品用于dna提取，并利用使用illumina miseq平台进行测序。通过配对末端测序(2
×
300bp)对微生物dna进行分析。细菌16s rdna扩增子测序使用338f(actcctacg ggaggcagcag)和806r(ggactachvgggtwtctaat)通用引物。使用qiime质量控制过程获得高质量的序列，并使用uchime算法检测和删除嵌合序列。得到out表格，根据物种注释结果，采用最大值排序法，选取每组在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)上最大丰度排名靠前的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各组在不同分类水平上微生物组成以及相对丰度和比例。
63.五、结果分析
64.在混合青贮60天后，如表1和图1所示，试验组(lm)的粗蛋白含量(9.60
±
0.1％dm)显著高于对照组(ck，即混合青贮的预处理油莎豆茎叶)的粗蛋白含量(8.21
±
0.05％dm)，试验组(lm)的酸性洗涤纤维含量(41.82
±
2.51％dm)低于对照组(ck)的酸性洗涤纤维含量(43.95
±
0.17％dm)，试验组(lm)的中性洗涤纤维含量(61.78
±
1.93％dm)低于对照组(ck)的中性洗涤纤维含量(63.68
±
0.31％dm)，试验组(lm)的酸性洗涤木质素含量(8.62
±
0.84％dm)低于对照组(ck)的酸性洗涤木质素(8.95
±
0.75％dm)，试验组(lm)的可溶性碳水化合物含量(0.71
±
0.04％dm)显著高于对照组(ck)的可溶性碳水化合物含量(0.39
±
0.05％dm)，说明该发酵方式能够改善营养品质同时降低纤维素含量。试验组(lm)中乳酸(108.78
±
21.87g/kg dm)和乙酸(137.77
±
4.30g/kg dm)含量显著均高于对照组(ck)中的乳酸(0
±
0g/kg dm)和乙酸(15.29
±
0.68g/kg dm)含量，同时乙醇含量(10.94
±
1.05g/kg dm)显著低于对照组(ck)中的乙醇含量(17.13
±
1.31g/kg dm)。
65.如图2和表2所示，混合青贮后试验组(lm)中以乳杆菌属为主导菌群，占微生物菌群丰度的98.78％，肠杆菌属丰度较低，仅为微生物菌群丰度的0.27％。而在对照组(ck)中，丰度最高的是肠杆菌属，占据微生物菌群丰度的52.99％。混合青贮后微生物菌群的相对定量结果如表2所示。在混合青贮发酵中，添加复合菌剂有助于确保乳杆菌的主导地位，防止腐败菌的滋生。
66.在萎凋青贮60天后，如表1和图3所示，试验组(wlm)的粗蛋白含量(13.35
±
0.17％dm)显著高于对照组(wck)的粗蛋白含量(12.17
±
0.41％dm)，试验组(wlm)的酸性洗涤纤维含量(28.69
±
0.32％dm)低于对照组(wck)的酸性洗涤纤维含量(30.68
±
0.30％dm)，试验组(wlm)的中性洗涤纤维含量(51.70
±
1.88％dm)低于对照组(wck)的中性洗涤纤维含量(55.75
±
0.23％dm)，试验组(wlm)的酸性洗涤木质素含量(3.63
±
0.28％dm)低于对照组(wck)的酸性洗涤木质素含量(3.89
±
0.37％dm)，试验组(wlm)的可溶性碳水化合物含量(1.01
±
0.08％dm)高于对照组(wck)的可溶性碳水化合物含量(0.63
±
0.20％dm)。说明萎凋青贮发酵方式在提高营养品质的同时，还能够降低纤维素成分，进一步提高其饲用价值。试验组(wlm)中乳酸(150.27
±
3.51g/kg dm)和乙酸(216.77
±
1.27g/kg dm)含量均显著高于对照组(wck)中的乳酸(0
±
0g/kg dm)和乙酸(19.23
±
1.75g/kg dm)含量，同时乙醇含量(0
±
0g/kg dm)显著低于对照组(wck)中的乙醇含量(22.94
±
1.76g/kg dm)。
67.如图4、表3-4所示，同样的，在萎凋发酵后试验组(wlm)中以乳杆菌属为主导菌群，占微生物菌群丰度的96.21％，肠杆菌属丰度较低，仅为微生物菌群丰度的1.35％。而在对照组(wck)中，丰度最高的是肠杆菌属，占据微生物菌群丰度的42.45％。萎凋青贮后微生物菌群的相对定量结果如表3所示。萎凋青贮发酵中，添加复合菌剂有助于确保乳杆菌的主导地位，防止腐败菌的滋生。
68.表1油莎豆茎叶发酵前后营养成分变化
[0069][0070]
表1中，同一列中标有不同字母的数据间具有显著差异，标有相同字母的数据间不具有显著差异；％表示质量百分比。
[0071]
表2混合青贮油莎豆茎叶发酵前后微生物菌群相对丰度
[0072][0073][0074]
表3萎凋青贮油莎豆茎叶发酵前后微生物菌群相对丰度
[0075][0076]
表4萎凋青贮油莎豆茎叶发酵前后微生物菌群相对丰度
[0077][0078][0079]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。