吡咯并嘧啶类衍生物及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及一种取代的吡咯并嘧啶类衍生物、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为sos1抑制剂的用途。


背景技术：

2.ras基因广泛存在于各种真核生物如哺乳类、果蝇、真菌、线虫及酵母中，在各种生命体系中具有重要的生理功能，哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是h-ras、k-ras和n-ras，各种ras基因具有相似的结构，均由四个外显子组成，分布于全长约30kb的dna上。它们的编码产物为相对分子质量21kda的单体球状蛋白质。ras蛋白的激活和非激活状态对细胞生长、分化、增殖和凋亡等生命进程有着重大的影响。该蛋白是一种膜结合的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，具有弱的gtp酶活性，在正常生理活动中，通过gtp酶活化蛋白(gaps)和鸟嘌呤核苷酸交换因子(gefs)调节ras的活性状态，当ras蛋白与gtp结合形成ras-gtp时为激活状态，gtp酶活化蛋白可以使ras-gtp去磷酸化转变成ras-gdp，进而失活；失活的ras-gdp在鸟嘌呤核苷酸交换因子作用下又转变成有活性的ras-gtp，从而激活raf/mer/erk和pi3k/akt/mtor等一系列下游通路。
3.ras基因同时也与人类的各种疾病密切相关，尤其在癌症方面，ras是经常出现突变的致癌基因，其中kras亚型基因突变占到ras基因突变总数的86％，约90％的胰腺癌，30％-40％的结肠癌、15-20％的肺癌中均出现不同程度的kras基因突变。鉴于kras基因突变的普遍性，该靶点一直是药物研发工作者关注的方向。从直接作用于kras-g12c靶点的amg-510临床结果的公布开始，kras抑制剂的研究在国内外掀起一股热潮。
4.sos(son of sevenless homolog)蛋白最初是在果蝇研究中被发现，是由sos基因编码的鸟苷释放蛋白。人类有2种sos同源体，hsos1和hsos2，二者都是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族的成员，具有70％的同源性，尽管它们在结构和序列上高度相似，但各自的生理功能存在一定差异。hsos1蛋白大小为150kda，是由1333个氨基酸组成的多结构蛋白域，包含n端蛋白结构域(hd)、多个同源结构域、螺旋接头(hl)、ras交换序列(rem)和富含脯氨酸的c端结构域。hsos1上有2个与ras蛋白的结合位点，分别是催化位点和变构位点，催化位点结合ras-gdp复合物上的ras蛋白促进鸟嘌呤核苷酸交换，变构位点结合ras-gtp复合物上的ras蛋白进一步增强催化作用，进而参与并激活ras家族蛋白的信号转导。有研究表明，对sos1的抑制不仅能够对野生型kras细胞中的ras-raf-mek-erk通路产生完全抑制，在突变的kras细胞系中，也能导致磷酸-erk的活性降低50％。因此，对sos1的抑制也能够降低ras的活性，从而治疗由ras基因突变或ras蛋白过度激活导致的各种癌症，包括胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、胃癌、非小细胞肺癌等。
5.此外，癌症中亦牵涉sos1的改变。研究表明，sos1突变发现于胚胎性横纹肌肉瘤、塞尔托利细胞睾丸瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、神经纤维瘤、皮肤颗粒细胞瘤和肺腺癌中。同时，有研究已描述了在膀胱癌和前列腺癌中sos1的过表达。除了癌症之外，遗传性sos1突变也牵涉在ras病的发病机理中，所述ras病变如像努南综合征(ns)、心面皮肤综合征(cfc)和
ⅰ
型遗传性齿龈纤维瘤等。
6.sos1也是用于激活gtp酶rac1(ras相关的c3肉毒杆菌毒素底物1)的gef。与ras家族蛋白一样，rac1与多种人类癌症和其他疾病的发病机理有关。
7.市场上还未有选择性地针对于sos1的药物上市，但已经公布了一系列相关专利，其中包括bi公司的wo2018115380a1，wo2019122129a1，bayer公司的wo2019201848a1，revolution公司的wo2020180768a1，wo2020180770a1等，目前处于临床试验阶段的药物为bi-1701963。但这些对于抗肿瘤研究是远远不够的，仍有必要研究和开发新的选择性sos1激酶抑制剂，来解决未满足的医疗需求。


技术实现要素：

8.针对上述的技术问题，本发明提供一种通式(i)所示的一种取代的吡咯并嘧啶类化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：
[0009][0010]
其中：
[0011]
环a选自c
6-c
10
芳基、5-10元杂芳基、9-10元双环杂环基或9-10元稠合环；
[0012]
x、y各自独立地选自-crarb或c＝o；
[0013]
l选自键、-c(o)-、-c(o)nh(ch2)p-、-c(o)o-、-s(o)
2-、-s(o)-或-(ch2)q-；
[0014]
ra、rb各自独立地选自氢原子、卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
3-c6环烷基或c
6-c
10
芳基，其中所述的c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
3-c6环烷基或c
6-c
10
芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基或羟基的取代基所取代；
[0015]
r1相同或不同，各自独立地选自氢原子、烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0016]
r2选自
[0017]
l1选自键或c
1-c6亚烷基，其中所述的亚烷基任选进一步被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基或羟基的取代基所取代；
[0018]
ra选自c
1-c6烷基或c
1-c6环烷基，其中所述的烷基或环烷基任选进一步被一个或多
个卤素或羟基所取代；
[0019]
rb选自卤素、氰基、c
3-c6环烷基、5-6元杂环基、-or8或-nr9r
10
；其中所述的环烷基或杂环基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取；
[0020]
r3、r4各自独立地选自氢原子或c
1-c6烷基；并且，r3、r4中至少有一个为氢原子；其中所述的烷基任选进一步被一个或多个卤素或羟基取代；
[0021]
或者，r3、r4与其连接的原子共同形成一个c
3-c6环烷基；
[0022]
r5选自氢原子、卤素、硝基、氰基、c
1-c6烷基、c
3-c6环烷基、5-6元杂环基、-or8、-nr9r
10
或-c(o)nr9r
10
；其中所述的烷基、环烷基或杂环基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0023]
环b选自3-14元环烷基、3-14元杂环基、c
6-c
10
芳基、5-10元杂芳基或5-10元稠合环；
[0024]
r6选自氢原子、-l
2-rc、-c(o)-l
2-rc或-c(o)-rd；
[0025]
l2各自独立地选自-c
1-c6亚烷基，其中所述的亚烷基任选进一步被一个或多个re取代，re选自卤素、烷基、烷氧基或羟基；或者，连接于同一碳原子的两个re，与所连接的碳原子一起形成一个环烷基；优选为环丙基；
[0026]
rc各自独立地选自氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
或-s(o)rr8；其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0027]
rd选自氘代烷基、羟基烷基、环烷基、芳基或杂芳基；其中所述的烷基、环烷基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0028]
r7选自氢原子、烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个烷基、卤素、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-or8、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0029]
限制条件为：
[0030]
当r6选自氢原子时，x、y各自独立地选自-crarb且ra、rb中至少有一个选自c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基和c
3-c6环烷基；
[0031]
r8选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自氘原子、羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷
氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0032]
r9和r
10
各自独立地选自氢原子、羟基、卤素、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0033]
或者，r9和r
10
与它们相连接的原子一起形成一个4～8元杂环基，其中4～8元杂环基内含有一个或多个n、o或s(o)r，并且所述的4～8元杂环基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0034]r11
、r
12
和r
13
各自独立地选自氢原子、烷基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基或羧酸酯基的取代基所取代；
[0035]
r选自0、1或2；
[0036]
m选自1、2、3或4；
[0037]
p选自0或1；
[0038]
q选自1、2、3、4、5或6；
[0039]
n选自1、2或3；
[0040]
k选自0、1、2或3。
[0041]
本发明的优选方案，一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其为通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：
[0042][0043]
其中：环a、x、y、r1、r5、ra、rb、l、l1和m的定义如通式(i)中所述。
[0044]
本发明的优选方案，一种通式(i)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其为通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：
[0045][0046]
其中：环a、x、y、r1、r5、r6、r7、l、m、n和k的定义如通式(i)中所述。
[0047]
本发明的优选方案，一种通式(i)、(ii)或(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中选自以下结构：
[0048][0049]
其中：r1和m的定义如通式(i)中所述。
[0050]
本发明的优选方案，一种通式(i)、(ii)或(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中选自
[0051]
本发明的优选方案，一种通式(i)、(ii)或(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中l为-c(o)-。
[0052]
本发明的优选方案，一种通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中ra为甲基。
[0053]
本发明的优选方案，一种通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：
[0054]
l1选自c
1-c6亚烷基，优选为亚甲基或-(ch2)
2-；
[0055]
rb选自-or8或-nr9r
10
；
[0056]
r8、r9、r
10
各自独立地选自烷基，优选为甲基。
[0057]
本发明的优选方案，一种通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中l1为键；
[0058]
rb选自
[0059]
本发明的优选方案，一种通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：
[0060]
环b选自5-10元杂环基，优选为哌嗪基、哌啶基、吗啉基、四氢吡喃基、氮杂环丁烷基或吡咯烷基。
[0061]
本发明的优选方案，一种通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：
[0062]
r6选自-l
2-rc或-c(o)-l
2-rc；
[0063]
l2各自独立地选自亚甲基、-(ch2)
2-、
[0064]
rc各自独立地选自氰基、杂环基或-nr9r
10
；
[0065]
r9、r
10
独立地选自氢原子或c
1-c6烷基；r9、r
10
优选为甲基。
[0066]
本发明的优选方案，一种通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：
[0067]
r6选自-c(o)-rd；
[0068]
rd选自氘代烷基；
[0069]
rd优选为氘代甲基。
[0070]
本发明的优选方案，一种通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：
[0071]
r7选自c
1-c6烷基或c
1-c6烷氧基；
[0072]
r7优选为甲基或甲氧基。
[0073]
本发明的优选方案，一种通式(ii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中选自以下基团：
[0074][0075]
本发明的优选方案，一种通式(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中选自以下基团：
[0076][0077]
本发明的优选方案，一种通式(i)、(ii)或(iii)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中r5选自卤素、c
1-c6烷基或c
1-c6烷氧基，优选为氯、碘、甲基或甲氧基。
[0078]
在本发明的优选方案中，通式(i)所述的化合物选自：
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083][0084]
或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐。
[0085]
注：如果在画出的结构和给出的该结构的名称之间有差异，则画出的结构将给予更大的权重。
[0086]
更进一步，本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的通式(i)或(ii)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。
[0087]
本发明提供一种通式(i)、(ii)或(iii)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备sos1抑制剂中的用途。
[0088]
本发明还提供一种通式(i)、(ii)或(iii)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备治疗由sos1介导的疾病的药物中的用途，其中所述的由sos1介导的疾病优选为ras家族蛋白信号传导通路依赖性相关的癌症、sos1突变导致的癌症或sos1突变导致的遗传性疾病；其中所述的由sos1介导的疾病优选为肺癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、胃癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、神经纤维瘤、努南综合征、心面皮肤综合征、ⅰ型遗传性齿龈纤维瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、塞尔托利细胞睾丸瘤或皮肤颗粒细胞瘤。
[0089]
本发明进一步提供一种通式(i)、(ii)或(iii)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备治疗ras家族蛋白信号传导通路依赖性相关的癌症、sos1突变导致的癌症或sos1突变导致的遗传性疾病的药物中的用途。
[0090]
本发明提供一种通式(i)、(ii)或(iii)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备治疗肺癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、胃癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、神经纤维瘤、努南综合征、心面皮肤综合征、ⅰ型遗传性齿龈纤维瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、塞尔托利细胞睾丸瘤或皮肤颗粒细胞瘤的药物中的用
途。
[0091]
发明的详细说明
[0092]
除非有相反陈述，否则本发明在说明书和权利要求书中所使用的部分术语定义如下：
[0093]“键”是指标示的取代基不存在，该取代基的两端部分直接连接成键。
[0094]“烷基”当作一基团或一基团的一部分时是指包括c
1-c
20
直链或者带有支链的脂肪烃基团。优选为c
1-c
10
烷基，更优选为c
1-c6烷基。烷基基团的实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代或未取代的。
[0095]“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、稠环、桥环和螺环的碳环。优选为c
3-c
12
环烷基，更优选为c
3-c8环烷基，最优选为c
3-c6环烷基。单环环烷基的实施例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等，优选环丙基、环己烯基。环烷基可以是取代或未取代的。
[0096]“螺环烷基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，环内可以含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺、双螺或多螺环烷基，优选为单螺和双螺环烷基，优选为4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元。“螺环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：螺[4.5]癸基、螺[4.4]壬基、螺[3.5]壬基、螺[2.4]庚基。
[0097]“稠环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构彼此共用一对碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。“稠环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：二环[3.1.0]己基、二环[3.2.0]庚-1-烯基、二环[3.2.0]庚基、十氢化萘基或十四氢菲基。
[0098]“桥环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。“桥环烷基”的非限制性实施例包括但不限于：(1s,4s)-二环[2.2.1]庚基、二环[3.2.1]辛基、(1s,5s)-二环[3.3.1]壬基、二环[2.2.2]辛基、(1r,5r)-二环[3.3.2]癸基。
[0099]“杂环基”、“杂环”或“杂环的”在本技术中可交换使用，都是指非芳香性杂环基，其中一个或多个成环的原子是杂原子，如氧、氮、硫原子等，包括单环、多环、稠环、桥环和螺环。优选具有5至7元单环或7至10元双环或三环，其可以包含1，2或3个选自氮、氧和/或硫中的原子。
[0100]“单环杂环基”的实例包括但不限于吗啉基、氧杂环丁烷基、硫代吗啉基、四氢呋喃
基、四氢吡喃基、1，1-二氧代-硫代吗啉基、哌啶基、2-氧代-哌啶基、吡咯烷基、2-氧代-吡咯烷基、哌嗪-2-酮基、哌嗪基、六氢嘧啶基、
[0101][0102]
单环杂环基可以是取代或未取代的。
[0103]“螺杂环基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个原子的多环基团，环内可以含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧或s(o)n(其中n选自0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。“螺杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：1,7-二氧杂螺[4.5]癸基、2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬基、7-氧杂螺[3.5]壬基、5-氧杂螺[2.4]庚基、
[0104][0105]
螺杂环基可以是取代或未取代的。
[0106]“稠杂环基”指含有两个或两个以上环状结构彼此共用一对原子的多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧或s(o)n(其中n选自0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。“稠杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：八氢吡咯并[3,4-c]吡咯基、八氢-1h-异吲哚基，3-氮杂二环[3.1.0]己基，八氢苯并[b][1,4]二噁英(dioxine)。
[0107]“桥杂环基”指5至14元，5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接的原子的多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧或s(o)n(其中n选自0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。“桥杂环基”的非限制性实施例包括但不限于：2-氮杂二环[2.2.1]庚基，2-氮杂二环[2.2.2]辛基、2-氮杂二环[3.3.2]癸基、
[0108][0109]
桥杂环基可以是取代或未取代的。
[0110]“芳基”是指含有一个或者两个环的碳环芳香系统，其中所述环可以以稠合的方式连接在一起。术语“芳基”包括单环或双环的芳基，比如苯基、萘基、四氢萘基的芳香基团。优选芳基为c
6-c
10
芳基，更优选芳基为苯基和萘基，最优选为苯基。芳基可以是取代或未取代的。
[0111]“杂芳基”是指芳香族5至6元单环或8至10元双环，其可以包含1至4个选自氮、氧和/或硫中的原子。“杂芳基”的实施例包括但不限于呋喃基，吡啶基，2-氧代-1，2-二氢吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，噻吩基，异噁唑基，噁唑基，噁二唑基，咪唑基，吡咯基，吡唑基，三唑基，四氮唑基，噻唑基，异噻唑基，1，2，3-噻二唑基，苯并间二氧杂环戊烯基，苯并噻吩基、苯并咪唑基，吲哚基，异吲哚基，1，3-二氧代-异吲哚基，喹啉基，吲唑基，苯并异噻唑基，苯并噁唑基、苯并异噁唑基、吡啶酮基、
[0112][0113][0114]
杂芳基可以是取代或未取代的。
[0115]“稠合环”是指两个或两个以上环状结构彼此共用一对原子的多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但至少一个环不具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中环原子选自0个、一个或多个选自氮、氧或s(o)r(其中r选自0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。稠合环优选包括双环或三环的稠合环，其中双环稠合环优选为芳基或杂芳基与单环杂环基或单环环烷基的稠合环。优选为7至14元，更优选为8至10元。“稠合环”的实施例包括但不限于：
[0116][0117][0118]
稠合环可以是取代或未取代的。
[0119]“烷氧基”是指(烷基-o-)的基团。其中，烷基见本文有关定义。c
1-c6的烷氧基为优先选择。其实例包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
[0120]“卤代烷基”是指烷基任选进一步被一个或多个卤素所取代的基团，其中烷基见本文有关定义。
[0121]“羟基烷基”是指烷基任选进一步被一个或多个羟基所取代的基团，其中烷基见本文有关定义。
[0122]“氘代烷基”是指烷基任选进一步被一个或多个氘原子所取代的基团，其中烷基见本文有关定义。
[0123]“羟基”指-oh基团。
[0124]“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
[0125]“氨基”指-nh2。
[0126]“氰基”指-cn。
[0127]“硝基”指-no2。
[0128]“苄基”指-ch
2-苯基。
[0129]“羧基”指-c(o)oh。
[0130]“羧酸酯基”指-c(o)o-烷基或-c(o)o-环烷基，其中烷基、环烷基的定义如上所述。
[0131]“dmso”指二甲基亚砜。
[0132]“boc”指叔丁氧基羰基。
[0133]“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
[0134]
本说明书所述的“取代”或“取代的”，如无特别指出，均是指基团可被一个或多个选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、疏基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氨基、卤代烷基、羟烷基、羧基、羧酸酯基、＝o、-c(o)r8、-c(o)or8、-nhc(o)r8、-nhc(o)or8、-nr9r
10
、-c(o)nr9r
10
、-ch2nhc(o)or8、-ch2nr9r
10
或-s(o)rr8的取代基所取代；
[0135]
r8选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自氘原子、羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0136]
r9和r
10
各自独立地选自氢原子、羟基、卤素、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0137]
或者，r9和r
10
与它们相连接的原子一起形成一个4～8元杂环基，其中4～8元杂环基内含有一个或多个n、o或s(o)r，并且所述的4～8元杂环基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氰基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、＝o、-c(o)r
11
、-c(o)or
11
、-oc(o)r
11
、-nr
12r13
、-c(o)nr
12r13
、-so2nr
12r13
或-nr
12
c(o)r
13
的取代基所取代；
[0138]r11
、r
12
和r
13
各自独立地选自氢原子、烷基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基或羧酸酯基的取代基所取代；
[0139]
r选自0、1或2；
[0140]
本发明化合物可以含有不对称中心或手性中心，因此以不同的立体异构体形式存
在。所预期的是，本发明化合物的所有立体异构体形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)和几何(构象)异构体及它们的混合物，如外消旋体混合物，均在本发明的范围内。
[0141]
除非另外指出，本发明描述的结构还包括此结构的所有异构体(如，非对映异构体、对映异构体和阻转异构体和几何(构象)异构体形式；例如，各不对称中心的r和s构型，(z)和(e)双键异构体，以及(z)和(e)构象异构体。因此本发明化合物的单个立体异构体以及对映体混合物、非对映异构体混合物和几何(构象)异构体混合物均在本发明范围内。
[0142]“可药用的盐”是指上述化合物能保持原有生物活性并且适合于医药用途的某些盐类。式(i)所表示的化合物的可药用的盐可以为金属盐、与合适的酸形成的胺盐。
[0143]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0144]
本发明化合物的合成方法
[0145]
为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0146]
本发明提供了一种通式(i)化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐的制备方法，所述方法包括：
[0147][0148]
通式(iiia)化合物与通式(iiib)化合物进行缩合反应后，任选进一步进行脱保护反应得到的通式(iiic)化合物，通式(iiic)化合物与一个或多个r
6-x2进行取代反应；任选进一步进行硝基还原反应得到通式(iii)化合物；
[0149]
其中：
[0150]
x1、x2为离去基团，优选为羟基或卤素；
[0151]
环a、x、y、r1、r5、r6、r7、l、m、n或k的定义如通式(iii)中所述。
具体实施方式
[0152]
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
[0153]
实施例
[0154]
实施例给出了式(i)所表示的代表性化合物的制备及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。1h nmr图谱是用bruker仪器(400mhz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。1h nmr的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝变宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为hz。
[0155]
质谱是用lc/ms仪测定得到，离子化方式可为esi或apci。
[0156]
薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法(tlc)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
[0157]
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
[0158]
在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用，除非另有指明，市售厂家包括但不限于上海皓鸿生物医药科技有限公司，上海韶远试剂有限公司，上海毕得医药科技有限公司，萨恩化学技术(上海)有限公司和上海凌凯医药科技有限公司等。
[0159]
cd3od：氘代甲醇。
[0160]
cdcl3：氘代氯仿。
[0161]
dmso-d6：氘代二甲基亚砜。
[0162]
氮气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氮气气球。
[0163]
实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
[0164]
对化合物进行纯化，采用柱层析和薄层色谱法的洗脱剂体系，其中该体系选自：a：石油醚和乙酸乙酯体系；b：二氯甲烷和甲醇体系；c：二氯甲烷和乙酸乙酯体系，d：二氯甲烷和乙醇体系，其中溶剂的体积比根据化合物的极性不同而不同，也可以加入少量的酸性或碱性试剂进行条件，如醋酸或三乙胺等。
[0165]
室温：20℃～30℃。
[0166]
实施例1
[0167]
(4-(((r)-1-(3-amino-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-2-chloro-5,7-dihydro-6h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)(4-methoxy-1-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)piperidin-4-yl)methanone
[0168]
(4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-氯-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基-1-((四氢呋喃-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲酮
[0169][0170]
[0171]
第一步
[0172]
tert-butyl(r)-2-chloro-4-((1-(3-nitro-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-5,7-dihydro-6h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidine-6-carboxylate
[0173]
(r)-2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯
[0174]
将2,4-二氯-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯1a(500mg,1.72mmol,根据公开专利wo 2021058018a1制备)，(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙-1-胺1b(524.61mg,2.24mmol,根据公开专利wo 2021105960制备)和n,n-二异丙基乙胺(1.11g,8.62mmol)依次加入到1,4-二氧六环(15ml)中，升温至100℃下持续搅拌24小时。以乙酸乙酯(30ml)萃取，有机相以饱和氯化钠溶液(30ml
×
2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物用薄层色谱法(展开剂：a体系)纯化，得到(r)-2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯1c(600mg,1.23mmol)，产率：71.37％。
[0175]
ms m/z(esi)：488.9[m h]

[0176]
第二步
[0177]
(r)-2-chloro-n-(1-(3-nitro-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)-6,7-dihydro-5h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine
[0178]
(r)-2-氯-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-4-胺
[0179]
将(r)-2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯1c(500mg,1.02mmol)和浓盐酸(186.84mg,5.12mmol)依次加入到1,4-二氧六环(10ml)中，室温条件下持续搅拌4小时。直接浓缩，得到(r)-2-氯-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-4-胺1d(380mg,0.98mmol)，产率：95.62％。
[0180]
ms m/z(esi)：388.3[m h]

[0181]
第三步
[0182]
tert-butyl(r)-4-(2-chloro-4-((1-(3-nitro-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-6,7-dihydro-5h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidine-6-carbonyl)-4-methoxypiperidine-1-carboxylate
[0183]
(r)-4-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羰基)-4-甲氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯
[0184]
将(r)-2-氯-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-4-胺1d(400mg,1.03mmol)，1-(叔丁氧羰基)-4-甲氧基哌啶-4-羧酸1e(401.24mg,1.55mmol，根据公开专利wo2020175968 a1制备)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(197.76mg,1.03mmol)依次加入到二氯甲烷(10ml)中，室温条件下持续搅拌4小时。反应液加入水(50ml)，以乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物用硅胶柱层析法(展开剂：a体系)纯化，得到(r)-4-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羰基)-4-甲氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯1f(450mg,0.72mmol)，产率：70％。
[0185]
ms m/z(esi)：574.3[m-55]

[0186]
第四步
[0187]
(r)-(2-chloro-4-((1-(3-nitro-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-5,7-dihydro-6h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)(4-methoxypiperidin-4-yl)methanone
[0188]
(r)-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基吡啶-4-基)甲酮
[0189]
将(r)-4-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-羰基)-4-甲氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯1f(500mg,0.79mmol)，浓盐酸(28.98mg,0.79mmol)依次加入到1,4-二氧六环(10ml)中，室温条件下持续搅拌4小时。反应液减压浓缩，得到(r)-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基吡啶-4-基)甲酮1g(400mg,0.76mmol)，产率：95.14％。
[0190]
ms m/z(esi)：530.1[m h]

[0191]
第五步
[0192]
(2-chloro-4-(((r)-1-(3-nitro-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-5,7-dihydro-6h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)(4-methoxy-1-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)piperidin-4-yl)methanone
[0193]
(2-氯-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基-1-((四氢呋喃-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲酮
[0194]
将(r)-(2-氯-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基吡啶-4-基)甲酮1g(300mg,0.57mmol)，2-(溴甲基)四氢呋喃(187.21mg,1.13mmol)和碳酸钠(120.24mg,1.13mmol)依次加入到乙腈(15ml)中，升温至85℃下持续搅拌36小时。反应液加入水(50ml)，以乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物用硅胶柱层析法(展开剂：b体系)纯化，得到产物(2-氯-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基-1-((四氢呋喃-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲酮1h(200mg,0.65mmol)，产率58％。
[0195]
ms m/z(esi)：614.3[m h]

[0196]
第六步
[0197]
(4-(((r)-1-(3-amino-5-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)amino)-2-chloro-5,7-dihydro-6h-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)(4-methoxy-1-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)piperidin-4-yl)methanone
[0198]
(4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-氯-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基-1-((四氢呋喃-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲酮
[0199]
将(2-氯-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)(4-甲氧基-1-((四氢呋喃-2-基)甲基)哌啶-4-基)甲酮1h(100mg,0.16mmol)，铁粉(18.22mg,0.32mmol)和1m的盐酸水溶液(3ml)依次加入到乙醇(5ml)中，升温至100℃下持续搅拌4小时，以乙酸乙酯(30ml)萃取，分去水层，有机相以饱和氯化钠溶液
1.75(m,7h),1.45(t,j＝7.0hz,4h).
[0210]
单一构型化合物(较长保留时间)：
[0211]
75mg；保留时间5.990分钟,手性纯度99.32％ee。
[0212]
ms m/z(esi):583.3[m 1]
[0213]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(dd,j＝8.2,3.5hz,1h),6.84(s,1h),6.78(s,1h),6.71(d,j＝4.8hz,1h),5.56(d,j＝3.4hz,2h),5.21(m,j＝10.8,5.3hz,1h),4.80(d,j＝22.3hz,2h),4.52(d,j＝22.8hz,2h),3.92(q,j＝6.4hz,1h),3.73(q,j＝7.2hz,1h),3.60(q,j＝7.5hz,1h),3.13(d,j＝14.0hz,3h),2.81-2.58(m,2h),2.43-2.23(m,4h),1.97-1.68(m,7h),1.45(t,j＝6.9hz,4h)
[0214]
生物学评价
[0215]
测试例1、本发明化合物阻断sos1与kras g12c蛋白结合的测试
[0216]
以下方法用于测定本发明化合物在体外条件下阻断sos1与kras g12c蛋白相互作用的能力。本方法使用cisbio公司的kras-g12c/sos1 binding assay kits试剂盒(货号63adk000cb16peg)，详细实验操作可参考试剂盒说明书。
[0217]
将实验流程简述如下：使用diluent buffer(货号62dlbddf)配置tag1-sos1和tag2-kras-g12c蛋白为5x的工作液浓度备用。受试化合物溶解于dmso中制备为10mm贮存液，随后使用diluent buffer进行稀释备用。首先向孔中加入2μl受试化合物(反应体系终浓度为10000nm-0.1nm)，随后加入4μl tag1-sos1 5x的工作液和4μl tag2-kras-g12c5x的工作液，离心并混匀，静置15分钟；随后加入10μl预混匀的anti-tag1-tb
3
和anti-tag2-xl665，室温下孵育2小时；最后使用酶标仪以tf-fret模式上测定在304nm的激发波长下，各孔发射波长为620nm和665nm的荧光强度，并计算各孔665/620的荧光强度比值。通过与对照组(0.1％dmso)的荧光强度比值进行比较，计算受试化合物在各浓度下的百分比抑制率，并通过graphpad prism 5软件以受试化合物浓度对数值-抑制率进行非线性回归分析，获得化合物的ic
50
值，结果见下表。
[0218]
表1本发明化合物阻断sos1与kras g12c蛋白结合的测试活性表
[0219][0220]
结论：本发明化合物对于sos1与kras g12c蛋白相互作用具有较强的阻断作用，化合物的ic
50
《1μm，优选化合物的ic
50
《100nm。
[0221]
测试例2、本发明化合物对oci-aml5细胞增殖抑制测定
[0222]
以下方法用于测定本发明化合物对oci-aml5细胞增殖的影响。oci-aml5细胞(含有sos1 n233y突变)购于南京科佰生物科技有限公司，培养于含10％胎牛血清、100u青霉素和100μg/ml链霉素的memα培养基中。细胞活力通过luminescent cell viability assay试剂盒(promega，货号g7573)进行测定。
[0223]
实验方法按照试剂盒说明书的步骤操作，简述如下：受试化合物首先溶解于dmso中制备为10mm贮存液，随后以培养基进行稀释，配制成测试样品，化合物的终浓度范围在
10000nm-0.15nm。将处于对数生长期的细胞以1000个细胞每孔的密度接种至96孔细胞培养板中，在37℃，5％co2培养箱中培养过夜，随后加入受试化合物后继续培养120小时。培养结束后，向每孔加入50ul体积的celltiter-glo检测液，震荡5分钟后静置10分钟，随后在酶标仪上使用luminescence模式读取样品各孔发光值。通过与对照组(0.3％dmso)的数值进行比较计算化合物在各浓度点的百分比抑制率，之后在graphpad prism 5软件中以化合物浓度对数-抑制率进行非线性回归分析，获得化合物抑制细胞增殖的ic
50
值，结果见下表。
[0224]
表2本发明化合物对oci-aml5细胞增殖抑制活性表
[0225][0226]
结论：本发明化合物对oci-aml5细胞增殖具有较好的抑制作用。
[0227]
测试例3、本发明化合物对dld-1细胞中p-erk1/2抑制活性的测定
[0228]
以下方法用于测定本发明化合物对dld-1细胞中p-erk1/2抑制活性。本方法使用cisbio公司的advanced phospho-erk1/2(thr202/tyr204)试剂盒(货号64aerpeh)，详细实验操作可参考试剂盒说明书。dld-1细胞(含有kras g13d突变)购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0229]
将实验流程简述如下：dld-1细胞培养于含10％胎牛血清、100u青霉素，100μg/ml链霉素和1mm sodium pyruvate的rpmi 1640完全培养基中。dld-1细胞按每孔30000个铺于96孔板中，培养基为完全培养基，在37℃，5％co2培养箱内培养过夜。将受试化合物溶解于dmso中制备为10mm贮存液，随后使用rpmi 1640基础培养基进行稀释，每孔加入90ul含对应浓度受试化合物的rpmi 1640基础培养基，受试化合物在反应体系中的终浓度范围为10000nm-0.15nm，置于细胞培养箱培养3小时40分钟。随后加入10ul用rpmi 1640基础培养基配制的hegf(购自roche，货号11376454001)，使其终浓度为5nm，置于培养箱培养20分钟。弃去细胞上清，使用冰浴的pbs清洗细胞，之后每孔加入45μl的1
×
cell phospho/total protein lysis buffer(advanced phospho-erk1/2试剂盒组分)进行裂解，96孔板置于冰上裂解半小时，随后参照advanced phospho-erk1/2(thr202/tyr204)试剂盒说明书检测裂解液。最后在酶标仪以tf-fret模式上测定在304nm的激发波长下，各孔发射波长为620nm和665nm的荧光强度，并计算各孔665/620的荧光强度比值。通过与对照组(0.1％dmso)的荧光强度比值进行比较，计算受试化合物在各浓度下的百分比抑制率，并通过graphpad prism5软件以受试化合物浓度对数值-抑制率进行非线性回归分析，获得化合物的ic
50
值，结果见下表。
[0230]
表3本发明化合物对dld-1细胞中p-erk1/2抑制活性表
[0231]
[0232]
结论：本发明化合物对dld-1细胞erk磷酸化具有较好的抑制作用。
[0233]
测试例4、本发明化合物对nci-h358细胞增殖抑制测定
[0234]
以下方法用于测定本发明化合物对nci-h358细胞在三维(3d)非锚定条件下细胞增殖的影响。nci-h358细胞(含有kras g12c突变)购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养于含10％胎牛血清、100u青霉素，100μg/ml链霉素和1mm sodium pyruvate的rpmi 1640培养基中。细胞活力通过3d cell viability assay试剂盒(promega，货号g9683)进行测定。
[0235]
实验方法按照试剂盒说明书的步骤操作，简述如下：受试化合物首先溶解于dmso中制备为10mm贮存液，随后以培养基进行稀释，配制成测试样品，化合物的终浓度范围在10000nm-0.15nm。将处于对数生长期的细胞以2000个细胞每孔的密度接种至超低吸附384孔细胞培养板(perkinelmer,#3830)中，，并加入受试化合物后继续培养120小时。培养结束后，向每孔加入30ul体积的celltiter-glo 3d检测液，震荡30分钟后静置120分钟，随后在酶标仪上使用luminescence模式读取样品各孔发光值。通过与对照组(0.1％dmso)的数值进行比较计算化合物在各浓度点的百分比抑制率，之后在graphpad prism 5软件中以化合物浓度对数-抑制率进行非线性回归分析，获得化合物抑制细胞增殖的ic
50
值，结果见下表。
[0236]
表4本发明化合物对nci-h358细胞增殖抑制活性表
[0237][0238]
结论：本发明化合物对h358细胞增殖具有较好的抑制作用。