融合蛋白、其相关核酸分子以及其在高通量测序中的应用的制作方法

技术特征：
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括脱氧核糖核苷酸抗体以及与所述脱氧核糖核苷酸抗体融合表达的荧光素酶，所述融合蛋白能够与所述脱氧核糖核苷酸抗体对应的脱氧核糖核苷酸结合，且在催化荧光素酶底物后发光。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸抗体选自datp、dttp、dctp及dgtp中任意一种脱氧核糖核苷酸的抗体；优选地，所述荧光素酶选自细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海萤荧光素酶、海肾荧光素酶、高斯荧光素酶、nanoluc萤光素酶和刺虾荧光素酶中的任意一种；优选地，所述脱氧核糖核苷酸抗体采用igg、fab、scfv、及vhh中的任意一种抗体的结构。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸抗体包括轻链和重链，并且所述重链与所述荧光素酶融合表达；优选地，所述重链与所述荧光素酶之间通过柔性肽连接；优选地，所述柔性肽为(ggggs)n或a(eaaak)na，n选自1、2、3或4；优选地，所述重链与所述荧光素酶之间通过柔性肽连接形成h-luc重组重链，其中，所述h-luc重组重链选自seq id no：1、seq id no：3、seq id no：5或seqid no：7；优选地，所述融合蛋白为anti-a-luc融合蛋白、anti-t-luc融合蛋白、anti-c-luc融合蛋白或anti-g-luc融合蛋白，其中，所述anti-a-luc融合蛋白的所述h-luc重组重链的氨基酸序列为seq id no：1，所述轻链的氨基酸序列为seq id no：2；所述anti-t-luc融合蛋白的所述h-luc重组重链的氨基酸序列为seq id no：3，所述轻链的氨基酸序列为seq id no：4；所述anti-c-luc融合蛋白的所述h-luc重组重链的氨基酸序列为seq id no：5，所述轻链的氨基酸序列为seq id no：6；所述anti-g-luc融合蛋白的所述h-luc重组重链的氨基酸序列为seq id no：7，所述轻链的氨基酸序列为seq id no：8。4.编码权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的融合片段的核酸分子，其特征在于，所述融合片段为所述脱氧核糖核苷酸抗体与所述荧光素酶融合表达的片段。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述融合片段为所述脱氧核糖核苷酸抗体的重链与所述荧光素酶融合而成的所述h-luc重组重链，其中，编码所述h-luc重组重链的核酸分子的核酸序列选自seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13或seqid no：15；优选地，编码所述融合蛋白的核酸分子还包括编码脱氧核糖核苷酸抗体的轻链的核酸分子，其中，当编码所述h-luc重组重链的核酸分子的核酸序列为seq id no：9时，编码所述轻链的核酸分子的核酸序列为seq id no：10；当编码所述h-luc重组重链的核酸分子的核酸序列为seq id no：11时，编码所述轻链的核酸分子的核酸序列为seq id no：12；当编码所述h-luc重组重链的核酸分子的核酸序列为seq id no：13时，编码所述轻链的核酸分子的核酸序列为seq id no：14；当编码所述h-luc重组重链的核酸分子的核酸序列为seq id no：15时，编码所述轻链的核酸分子的核酸序列为seq id no：16。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体上连接有权利要求4或5所述的核酸分子。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中转染有权利要求6所述的重组载体。8.一种高通量测序方法，其特征在于，所述高通量测序方法包括：将带有可逆阻断基团的脱氧核糖核苷酸加入到待测序的核酸分子上，再加入权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，通过检测所述融合蛋白自发光所产生的信号来确定掺入的脱氧核糖核苷酸的类型，从而确定所述待测序的核酸分子的序列。9.根据权利要求8所述的高通量测序方法，其特征在于，通过检测在每一轮反应中掺入带有所述可逆阻断基团的脱氧核糖核苷酸时，所述融合蛋白自发光所产生的信号，来获得所述待测序的核酸分子的碱基序列；其中，每一轮反应的反应体系包括所述带有可逆阻断基团的脱氧核糖核苷酸、所述待测序的核酸分子、dna聚合酶、所述融合蛋白以及所述融合蛋白的荧光素酶活性相对应的底物荧光素，且每一轮反应掺入的所述带有可逆阻断基团的脱氧核糖核苷酸为可逆阻断datp、可逆阻断dttp、可逆阻断dctp及可逆阻断dgtp中的一种；优选地，所述荧光素选自萤火虫荧光素、海萤荧光素、腔肠素、氟代腔肠素和腔肠素类似物中的任意一种；优选地，通过自发光测序平台检测所述融合蛋白自发光所产生的信号，更优选所述自发光测序平台包括dnbseq-e5测序仪。10.权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白在高通量测序中的应用。

技术总结
本发明提供了一种融合蛋白、其相关核酸分子以及其在高通量测序中的应用。其中，该融合蛋白包括脱氧核糖核苷酸抗体以及与脱氧核糖核苷酸抗体融合表达的荧光素酶，融合蛋白能够与脱氧核糖核苷酸抗体对应的脱氧核糖核苷酸结合，且在催化荧光素酶底物后发光。该融合蛋白兼具两种活性，一方面能够识别阻断的脱氧核糖核苷酸上的碱基，直接靶向测序碱基，另一方面能够催化荧光素酶底物自发光。因而应用于测序时，不需要化学修饰制备试剂原料，同时拥有自发光测序平台仪器结构简单、无需荧光光源等优势。优势。优势。


技术研发人员：章文蔚 张维 董宇亮 郑越 马旭妍 王佑富
受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院
技术研发日：2021.08.17
技术公布日：2023/2/17