一种新型核酸分子检测与定量技术

技术特征：
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列为：n1uguaguan
9-n
10-n
11
ggaagaauugaucucggn
29
，其中n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且n1和n
29
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，n9和n
11
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的paprika结构核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n
29
互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
29
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
；n9与n
11
互补配对时，n9核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
11
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n
29
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n
29
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当n9与n
11
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n9与n
11
核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、g3a、g3u、g3c、u4a、u4c、u4g、a5u、a5c、a5g、g6a、g6u、g6c、u7a、u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、a18u、a18c、a18g、u19a、u19c、u19g、u20a、u20c、u20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、c24a、c24u、c24g、u25a、u25c、u25g、c26a、c26u、c26g、g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、u4a、u4c、u4g、a5c、a5g、g6u、u7a、u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、
g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、a18u、a18c、u19a、u19c、u19g、u20a、u20c、u20g、g21a、g21u、a22u、a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、c24a、c24u、c24g、u25a、u25c、c26a、c26u、g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、u4a、u4c、u4g、a5c、a5g、g6u、u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、u19a、u19c、u20a、u20c、u20g、g21u、a22u、a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、c24a、c24g、u25c、c26u、g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n
29
处的核苷酸序列为f30或trna脚手架rna序列。11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是rna分子或经碱基修饰的rna分子。12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna-rna杂交分子或经碱基修饰的dna-rna分子。13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5-10倍，至少20-50倍，至少100-200倍，至少200-1000倍或者至少1000-5000倍。14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利
要求1-14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(i)所述的结构：其中：d-为x1o-或n(x2)(x3)-；x1、x2、x3各自独立地选自氢、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基，x2、x3任选相互连接为饱和或不饱和的环；r-选自氢、氰基、羧基、酰胺基、酯基、羟基、1-10个碳的直链或支链烷基或改性烷基；ar1、ar2各自独立地选自单环芳亚基、单环杂芳亚基，或由单环芳基、单环杂芳基中的一种或两种稠合组成的具有2-3个环结构的芳香亚基；其中：ar1、ar2中的氢原子可以独立地被f、cl、br、i、羟基、硝基、醛基、羧基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、伯氨基、仲氨基、1-10个碳的直链或支链烷基和改性烷基取代；其中：以上所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自f、cl、br、i、-o-、-oh、-co-、-no2、-cn、-s-、-so2-、-(s＝o)-、叠氮基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、环氧乙烷、琥珀酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰氯、磺酰氯、饱和或不饱和的单环或双环亚环羟基、桥联酯杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1-10个碳原子，其中碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置换；其中，复合物中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中，或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。16.根据权利要求15所述的荧光团分子的复合物，所述改性烷基含有选自-oh、-o-、乙二醇单元、单糖单元、二糖单元、-o-co-、-nh-co-、-so
2-o-、-so-、me2n-、et2n-、-s-s-、-ch＝ch-、f、cl、br、i、-no2和氰基中的至少一种基团；可选地，荧光团分子含有的芳香环选自下式(
ⅱ‑
1)～(
ⅱ‑
15)中的结构：15)中的结构：可选地，荧光团分子选自下式化合物：
。17.根据权利要求16所述的复合物，其中的荧光团分子选自iii-1、iii-2、iii-3、iii-4、iii-5、iii-6、iii-7、iii-8、iii-9、iii-10、iii-11、iii-12、iii-13、iii-14、iii-15、iii-16、iii-17、iii-18、iii-19、iii-20和
ⅲ‑
21。18.根据权利要求15-17任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。19.一种权利要求15-18任一项所述的复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。20.一种dna分子，其转录权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子。21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的dna分子。22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的表达系统。23.一种试剂盒，包含权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求21所述的表达载体和/或权利要求22所述的宿主细胞和/或权利要求15-18任一项所述的复合物。24.一种检测靶标分子的方法，包括步骤：a)在包含靶标分子的溶液中加入权利要求15-18任一项所述的复合物；b)用合适波长的光激发复合物；
c)检测复合物的荧光。25.一种提取与纯化rna的方法，包含利用权利要求15-18任一项所述复合物提取与纯化rna。

技术总结
本发明涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。强度。


技术研发人员：杨弋 左方婷 陈显军
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/2/17