一种钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医用材料领域，特别涉及一种钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着肿瘤免疫治疗在临床上取得的成功，肿瘤疫苗受到越来越多的关注。接种肿瘤疫苗，可诱导机体产生肿瘤抗原特异性细胞免疫应答，最终产生细胞毒性t淋巴细胞(ctls)，直接特异性杀伤肿瘤细胞。然而，仅使用肿瘤抗原很难实现该目的。诱导肿瘤疫苗的细胞免疫应答主要依靠疫苗佐剂，直接刺激免疫系统，或依靠智能递送系统来智能地引发肿瘤抗原的溶酶体逃逸和交叉递呈。因此，构建多模式疫苗递送系统成为首选，其不仅可以充当疫苗佐剂，而且还能以期望的方式递送肿瘤抗原，但目前满足多模式要求的材料很少。
3.李斯特菌溶血素o(llo)不仅是优秀的疫苗佐剂，而且还可促进肿瘤疫苗的细胞免疫应答。llo是由李斯特菌分泌的一种毒力蛋白，通过结合胆固醇分子来破坏细胞膜，这种特性使llo具备溶酶体逃逸和将生物活性物质进行胞浆递送的潜能。有研究表明含llo的脂质体可促进肿瘤抗原ova逃逸进入细胞质，诱导细胞免疫反应，显著提高ova特异性ctl活性。因此，具有多种功能的llo适用于构建多模式疫苗递送系统，促进抗原交叉递呈，诱导细胞免疫应答。但llo具有一定的细胞毒性，这限制了其在生物疫苗中的应用。
4.多功能mnco3微球是理想的载体材料，具有构建多模式肿瘤疫苗递送系统的理想性能。首先，mn
2
近期首次被发现在机体抵抗病毒感染的天然免疫过程中起关键作用，并特异性提高了动物对dna病毒的敏感性。病原体入侵后，mn
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将释放到细胞质中，触发信号转导，继而诱导抗dna病毒反应。其次，mn
2
具有良好的肿瘤免疫监视作用，能够促进cd8

t细胞的增殖与肿瘤浸润，杀伤肿瘤细胞。这些研究的发现激发了人们对于含锰材料用作疫苗佐剂的强烈兴趣。此外，mn
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在癌症诊断中也广泛用于mri成像。总的来说，ph敏感、可生物降解的mnco3微球似乎是一种构建多模式疫苗递送系统的首选材料，该系统不仅可以提供mn
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佐剂，而且还可以递送抗原至apcs细胞质中。但我们发现mnco3微球易碎，表面光滑，限制了其抗原负载能力。至今尚无mnco3作为疫苗佐剂或载体的相关报道。因此，提升mnco3微球的稳定性及抗原负载能力，并利用其构建多模式疫苗递送系统具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统。
6.本发明的另一目的在于提供所述钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
7.本发明的另一目的在于提供所述钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统作为疫苗免疫佐剂在制备疫苗中的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统，为利用钙掺杂碳酸锰微球(ca@mnco3)负载李斯特菌溶血素o(llo)获得；其中，所述的钙掺杂碳酸锰微球(ca@mnco3)通过如下方法制备得到：
10.(1)将cacl2水溶液和mncl2水溶液搅拌混合均匀，得到cacl2和mncl2的混合液；然后加入聚苯乙烯磺酸钠(pss)，得到含pss的cacl2和mncl2的混合液；
11.(2)将聚苯乙烯磺酸钠(pss)加入到na2co3水溶液中，混合均匀，然后逐滴加入到步骤(1)中得到的含pss的cacl2和mncl2的混合液中搅拌反应，离心、洗涤、冷冻干燥，得到钙掺杂碳酸锰微球(ca@mnco3)。
12.所述的钙掺杂碳酸锰微球(ca@mnco3)与李斯特菌溶血素o(llo)的质量比为250～500:1；优选为500:1。
13.步骤(1)中所述的cacl2和mncl2的混合液中ca
2
和mn
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的摩尔比为1:1。
14.步骤(1)中所述的cacl2水溶液的浓度优选为0.6mol/l。
15.步骤(1)中所述的mncl2水溶液的浓度优选为0.6mol/l。
16.步骤(1)中所述的cacl2水溶液与mncl2水溶液的体积比为1:1。
17.步骤(1)中所述的聚苯乙烯磺酸钠(pss)的添加量为按每毫升(ml)cacl2和mncl2的混合液配比0.2mg聚苯乙烯磺酸钠计算。
18.步骤(2)中所述的聚苯乙烯磺酸钠(pss)的添加量为按每毫升(ml)na2co3溶液配比0.5mg聚苯乙烯磺酸钠计算。
19.步骤(2)中所述的na2co3水溶液的浓度优选为0.6mol/l。
20.步骤(2)中所述的反应体系中cacl2、mncl2和na2co3的摩尔比为5:5:4(即cacl2和mncl2的总量与na2co3的摩尔比为5:2)。
21.步骤(2)中所述的含pss的cacl2和mncl2的混合液与na2co3水溶液的体积比为5:2。
22.步骤(2)中所述的搅拌反应的条件为：600rpm搅拌30min。
23.步骤(2)中所述的离心的条件为：4000rpm离心5min。
24.步骤(2)中所述的洗涤为用无水乙醇和去离子水交替洗涤；优选为用无水乙醇和去离子水交替洗涤四次。
25.所述的钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
26.所述的疫苗为肿瘤疫苗。
27.所述的钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统作为疫苗免疫佐剂在制备疫苗制剂中的应用。
28.所述的疫苗制剂包括上述钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统和抗原。
29.所述的抗原优选为卵清蛋白(ova)。
30.所述的钙掺杂碳酸锰多模式疫苗递送系统作为疫苗免疫佐剂在制备疫苗制剂中的应用，为将抗原和李斯特菌溶血素o(llo)加入到溶剂中，再加入钙掺杂碳酸锰微球(ca@mnco3)，室温搅拌孵育24h以上，得到所述的疫苗制剂。
31.所述的钙掺杂碳酸锰微球与抗原的质量比为50～100:3；优选为100:3。
32.所述的钙掺杂碳酸锰微球与李斯特菌溶血素o(llo)的质量比为250～500:1；优选为500:1。
33.所述的溶剂生理盐水。
34.所述的搅拌的转速优选为100rpm。
35.所述的疫苗制剂的免疫接种途径为皮下注射；优选为腹股沟皮下注射。
36.所述的疫苗制剂储存于4℃条件下。
37.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
38.1、mnco3具有酸敏感性，可释放mn
2
，可增强免疫刺激效果，但其易碎，负载抗原能力弱，通过钙掺杂形成了粗糙的表面，这大大增加了微球的比表面积和稳定性，为了克服碳酸锰的脆性及负载能力低等问题，本发明借助碳酸钙的ph敏感性、良好的稳定性和高负载能力等优势，通过一锅法构建ca掺杂的mnco3微球(ca@mnco3)，以改善mnco3微球的稳定性和负载抗原能力。
39.2、llo可促进抗原递呈，但其毒性限制了其应用，为了克服现有的免疫佐剂诱导的免疫能力较弱以及llo的毒性较大等缺陷，本发明通过ca@mnco3微球物理吸附llo构建了一种多模式肿瘤疫苗递送系统(ca@mnco3/llo)，该多孔载体材料可以隐藏llo毒性，改善细胞免疫应答。
40.3、本发明中的ca@mnco3具有良好的生物相容性，且合成简单、成本低廉，经济环保；同时，本发明的ca@mnco3在水及生理盐水中具有良好的分散性，比表面积大，便于制备疫苗制剂。
41.4、本发明首次采用ca@mnco3/llo作为免疫递送系统，能促进dc2.4细胞对抗原的摄取，并利用llo促进抗原进行溶酶体逃逸，促进抗原的交叉递呈，促进抗原进入外周免疫器官，促进脾细胞增殖，诱导更高水平的抗原特异性igg抗体效价、ifn-γ、il-4和il-10，实现更加优异的细胞免疫应答，因此在疫苗治疗领域具有重要的应用价值。
42.5、本发明构建的多模式肿瘤疫苗递送系统(ca@mnco3/llo)作为免疫佐剂用于改善细胞免疫应答具有以下的优势：(1)用于合成ca@mnco3的材料来源丰富、制备方法简单、生物安全性良好；(2)ca@mnco3在水和生理盐水中的分散性好，便于免疫疫苗制剂的生产制备；(3)ca@mnco3的比表面积大，表面粗糙，可高效负载抗原；(4)ca@mnco3可粘附于细胞表面，使抗原更有效的被抗原递呈细胞(apc)识别、摄取，诱导机体的免疫应答；(5)ca@mnco3微球能够有效保护抗原ova和佐剂llo免受体内的酸、碱、蛋白酶等破坏，提高抗原的利用率；(6)llo可促进抗原进行溶酶体逃逸，改善细胞免疫应答；(7)ca@mnco3微球可隐藏llo毒性，构建的多模式肿瘤疫苗递送系统具有良好的生物安全性，且该系统本身可以充当佐剂(llo和mn
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)，还可以通过多种机制智能共递送抗原ova和佐剂llo；(8)多模式疫苗递送系统能促进抗原进入外周免疫器官，诱导更高水平的抗原特异性igg抗体效价、ifn-γ、il-4和il-10，因此在肿瘤的免疫治疗领域具有重要的应用价值。
43.6、本发明研究发现，当将ca@mnco3/llo/抗原疫苗制剂接种于机体，该疫苗递送系统能对抗原进行缓释，在酸性溶酶体中缓慢溶解进而释放佐剂和抗原，促进抗原ova及佐剂mn
2
逃逸至胞浆，实现抗原的交叉递呈和细胞免疫，该疫苗递送系统能对抗原进行缓释，使机体不断接受免疫刺激从而诱导长期有效的免疫应答。因此，该研究工作为新型肿瘤疫苗的开发提供了新的视角。
附图说明
44.图1是ca@mnco3及mnco3微球的sem图。
45.图2是ca@mnco3及mnco3微球的n2吸脱附曲线图。
46.图3是ca@mnco3对抗原ova负载能力的评价图；其中，a为ca@mnco3和ca@mnco3负载抗原ova后的元素分析图；b为mnco3和ca@mnco3对抗原负载结果图。
47.图4是红细胞与llo、ca@mnco3/ova/llo、ii-ca@mnco3/ova/llo和h2o孵育后的溶血结果图。
48.图5是疫苗制剂在dc2.4细胞内的分布图；其中，a为流式细胞仪检测结果；b为疫苗制剂的平均荧光强度。
49.图6是免疫组织化学染色结果图。
50.图7是igg抗体效价的测定结果图。
51.图8是ifn-γ的分泌实验结果图。
52.图9是il-4的分泌实验结果图。
53.图10是il-10的分泌实验结果图。
具体实施方式
54.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
55.本发明实施例中涉及的卵清蛋白(ova)购于sigma公司，李斯特菌溶血素o(llo)购于prospec公司。
56.实施例1制备ca@mnco3微球
57.一、ca@mnco3微球，由以下步骤制得：
58.(1)首先，配制浓度均为0.6m的cacl2、mncl2和na2co3水溶液。
59.(2)将5ml cacl2水溶液与5ml mncl2水溶液混合并搅拌均匀，得到cacl2和mncl2的混合液，然后加入2mg聚苯乙烯磺酸钠(pss)，得到含pss的cacl2和mncl2的混合液。
60.(3)取4ml na2co3溶液，加入2mg pss，混匀，然后将其逐滴加入到含pss的cacl2和mncl2的混合液中，在600rpm下，搅拌30min。
61.(4)收集反应所得颗粒，并离心(4000rpm，5min)，用无水乙醇和去离子水交替洗涤四次，经冷冻干燥后，得到ca@mnco3微球，室温密闭保存。
62.二、mnco3微球，由以下步骤制得：
63.(1)将4mg nh4hco3和0.1mg mncl2混合在20ml去离子水中，搅拌30min，制备纳米种子溶液。
64.(2)将纳米种子溶液与1l mncl2水溶液(6mm，含有0.5％异丙醇)混合并搅拌均匀，并在50℃下，加入1l nh4hco3水溶液(0.06m，含有0.5％(v/v)异丙醇)，快速搅拌(2000rpm)30min；随后，将混合溶液冷却至室温并用hcl中和至ph＝7。
65.(3)所得颗粒用去离子水洗涤三次，冷冻干燥24h。
66.采用sem观察mnco3和ca@mnco3微球形貌，结果如图1所示：在负载抗原的过程中，纯
mnco3微球不稳定，在100rpm搅拌下会被破坏。而钙掺杂后，制备的ca@mnco3微球表面粗糙，显示出良好的分散性和稳定性。随后，采用全自动比表面及孔隙度分析仪分析微球的比表面积，结果如图2所示：ca掺杂后，大大提高了mnco3微球的比表面积。
67.实施例2多模式疫苗递送系统的构建及将其作为疫苗免疫佐剂的应用
68.一、ca@mnco3微球对抗原的负载
69.(1)将5mg实施例1制备的ca@mnco3微球加入到1ml ova溶液(300μg/ml，用生理盐水配制)中，室温下搅拌24h(100rpm)，将所得ca@mnco3/ova微球于4℃储存。以实施例1制备的mnco3微球负载抗原为对照。在不同时间点(0、6、12、24、48、72h)，将该悬浮液离心，取上清，采用bca试剂盒检测上清液中ova浓度，并使用sem附带的能量色散x射线光谱仪(eds)对微球的元素进行分析。结果如图3a所示：ca@mnco3负载抗原ova后，在ca@mnco3/ova微球中发现了氮元素，这说明ca@mnco3微球成功负载ova。
70.(2)随后，检测并比较了不同剂量的mnco3和ca@mnco3微球(微球的用量为5mg和10mg，制备方法同实施例1)对ova的负载能力。结果如图3b所示：mnco3微球负载ova的水平非常低，而5mg ca@mnco3微球在24h内即可负载300μg ova，并在72h内保持负载，这表明钙的掺杂增加了mnco3微球负载ova的能力及稳定性。
71.二、疫苗制剂的制备
72.以卵清蛋白ova为模型抗原，用生理盐水为溶剂，配制1ml ova(含300μg)和llo(含20μg)的混合溶液。将该混合溶液加入到5mg或10mg ca@mnco3微球中，室温搅拌24h(100rpm)，分别制成ca@mnco3/ova/llo和ii-ca@mnco3/ova/llo疫苗制剂。使用相同的方案，制备不含llo的ca@mnco3/ova疫苗制剂，同时以铝佐剂与ova制备疫苗制剂为阳性对照(不含ca@mnco3和llo)，以生理盐水为空白对照，以300μg/ml的ova溶液(用生理盐水配制)为阴性对照。疫苗制剂于4℃储存。不同配方的疫苗按以表1进行配制。
73.表1皮下注射用的疫苗制剂
[0074][0075]
三、溶血检测
[0076]
抽取健康人体的新鲜血液，在1000
×
g下离心5min。取下层红细胞，用生理盐水洗涤3次。用生理盐水，将洗涤后的红细胞稀释成浓度为16％(v/v)的悬浮液。取100μl待测液(去离子水(h2o)、分别含2μg llo的llo溶液、按表1的配方配制的ca@mnco3/ova/llo和ii-ca@mnco3/ova/llo疫苗制剂)，加入200μl上述红细胞悬液，于37℃孵育15min。随后，离心5min(1000
×
g)，取100μl上清液，通过酶标仪(multiskan mk3，thermo fisher，美国)检测
其在540nm下的吸光度(od)，三次重复。
[0077]
结果如图4所示：与纯llo作用后，红细胞的溶血率为98.4％，而与ca@mnco3/ova/llo和ii-ca@mnco3/ova/llo微球作用后，红细胞的溶血率分别仅为3.97和2.27％。这说明，llo可以被ca@mnco3微球完全吸附，从而掩盖其毒性。
[0078]
四、dc2.4细胞对ova的摄取
[0079]
将dc2.4细胞(慧颖生物科技)接种于24孔培养板(1
×
105cells/孔)，于37℃培养箱中孵育24h。用pbs缓冲液洗涤两次，并加入pbs缓冲液、cy5.5-ova、ca@mnco3/cy5.5-ova、ca@mnco3/cy5.5-ova/llo和ii-ca@mnco3/cy5.5-ova/llo(先使用cy5.5荧光标记ova(cy5.5-ova)，再按上述表1的配方相应进行配制即可)待测液，三个重复，于37℃继续培养6h。最后，吸除培养液，用pbs缓冲液洗涤去除游离的颗粒，重悬细胞，采用流式细胞仪进行检测。
[0080]
结果如图5所示：与单独cy5.5-ova比，在所有含ca@mnco3的组中，ova内化比例明显更高；其中，ii-ca@mnco3/ova/llo组的ova内化比例最高。这表明，ca@mnco3和llo的引入大大增加了抗原的摄取，这有利于进一步的抗原递呈。
[0081]
五、小鼠免疫方案及各项免疫指标的测定
[0082]
将c57bl/6雌性小鼠(4～6周龄，北京华阜康)随机分为5组(n＝5)，分别皮下接种100μl按表1的配方配制的ova、ca@mnco3/ova、ca@mnco3/ova/llo、ii-ca@mnco3/ova/llo和alum/ova待测液。合计接种两次，间隔7天。在第二次接种后的第7天，从实验鼠的血液中分离血清，并于-20℃储存备用。随后，脱颈处死小鼠，从其脾脏中分离脾细胞、制备不同浓度的脾细胞悬浮液，备用。
[0083]
1.免疫组化试验
[0084]
将c57bl/6雌性小鼠(4～6周龄)随机分为5组(n＝5)，分别皮下接种100μl的ova、ca@mnco3/ova、ca@mnco3/ova/llo、ii-ca@mnco3/ova/llo和alum/ova待测液(30μg ova/只)。在第2天和第7天，收集小鼠脾脏，用4％的多聚甲醛将其固定，用于免疫组化分析。最后，通过显微镜(leica dmi6000，德国)观察抗原蛋白ova在小鼠脾脏中的分布情况。
[0085]
结果如图6所示：在第二天，所有小鼠的脾脏中的ova含量低。然而，在第7天，与单独ova相比，含ca@mnco3的组中ova含量明显增加；其中，ii-ca@mnco3/ova/llo组的ova含量在第7天最高。这说明，抗原在注射部位更长时间的滞留及更多的内化都促进了抗原迁移至脾脏，有利于促进抗原递呈。
[0086]
2.igg抗体效价的测定
[0087]
采用酶联免疫吸附检测(elisa)技术，检测实验鼠血清中ova特异性抗体的滴度。首先，用碳酸盐缓冲液(0.1m，ph 9.6)配制抗原ova溶液(10μg/ml)，并加入到96孔板中(100μl/孔)，于4℃包被过夜。第二天，用含0.05％(v/v)吐温-20的pbs(pbst)洗板3次，加入封闭液(含2％(v/v)牛血清白蛋白的pbst溶液，200μl/孔)，置于微孔板震荡孵育器中孵育1h(37℃，400rpm)。随后，用pbst洗板3次，加入已梯度稀释的血清样品(100μl/孔)，三个重复，继续孵育2h。随后，用pbst洗板3次，并拍打至孔板中无残留液体。接下来，往孔板中加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体hrp-igg(biolegend)(100μl/孔，用血清稀释液以1:2000v/v稀释)，继续孵育1h。随后，用pbst洗板4次，并拍打至孔板中无残留液体。在避光条件下，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物(100μl/孔)，孵育15min。最后，加入h2so4终
止液(100μl/孔)，终止显色反应，采用酶标仪检测吸光度(ods，450nm)。
[0088]
结果如图7所示：与单独ova和alum/ova组相比，含ca@mnco3的组中抗体水平显著增加。其中，ii-ca@mnco3/ova/llo组的抗体水平最高。这表明ca@mnco3和llo显示出强大的疫苗佐剂功能，并显著增强免疫反应。
[0089]
3.elisa测定脾细胞分泌的细胞因子水平
[0090]
将获得的脾细胞悬液接种至12孔板中(5
×
105cells/孔)，并加入抗原ova溶液(终浓度：25μg/ml)，再刺激脾细胞60h。随后，收集细胞上清液，采用elisa试剂盒检测上清液中细胞因子ifn-γ、il-4和il-10的分泌水平。简单的来说，往96孔板中加入capture antibody溶液(赛默飞)(100μl/孔)，于4℃包被过夜。第二天，用pbst洗板4次，加入200μl assay diluent a溶液，孵育1h。随后，用pbst洗板4次，加入脾细胞上清液(100μl/孔)，孵育2h。随后，用pbst洗涤4次，拍板至孔内无残留液体。然后，每孔加入100μl hrp标记亲和素(avidin-hrp)溶液，于37℃孵育1h，用pbst洗板4次。接下来，每孔加入100μl tmb显色液，显色15min后，加入h2so4溶液(100μl/孔)，终止显色反应。最后，通过酶标仪检测450nm处的od值。
[0091]
结果如图8～10所示：与单独ova相比，含ca@mnco3的组中ifn-γ、il-4和il-10水平更高；其中，ca@mnco3和llo的引入诱导了更高的ifn-γ分泌，ii-ca@mnco3/ova/llo组的ifn-γ、il-4和il-10水平最高。这表明，ca@mnco3的引入可触发了更强的体液免疫，而llo的引入触发了更强的细胞免疫。
[0092]
综上所述，本发明制得的ca@mnco3的分散性良好，可改善mnco3的脆性及抗原负载能力，隐藏llo毒性。与ova制成了不同的疫苗制剂后对小鼠进行皮下注射。结果表明，基于ca@mnco3的制剂能够显著增强dc2.4细胞对抗原的摄取、脾细胞增殖、igg水平和细胞因子分泌(ifn-γ、il-4和il-10)。这主要归功于ca@mnco3对抗原的保护和缓释能力，有利于dcs摄取和递呈更多的抗原。ca@mnco3可在酸性溶酶体中缓慢溶解而释放佐剂和抗原，促进抗原及佐剂逃逸至胞浆，实现抗原的交叉递呈和细胞免疫。总之，多模式ca@mnco3/llo疫苗递送系统有潜力应用于皮下免疫的疫苗递送系统。
[0093]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。