核酸提取容器和核酸提取方法与流程

1.本发明涉及核酸提取容器和核酸提取方法。


背景技术：

2.基因检测广泛应用于各种医学领域的检查、农作物、病原性微生物的鉴定、食品的安全性评价，甚至还应用于病原病毒(pathogenic virus)、各种传染病的检查。为了以高灵敏度检测作为基因的微量核酸，已知有对扩增核酸的一部分而得到的物质进行分析的方法。其中，聚合酶链式反应(pcr：polmerase chain reaction)是一种备受关注的、用于选择性地扩增从生物体等采集的极少量核酸的某一部分的技术。为了进行该pcr，需要从生物体试样中提取核酸。
3.作为这种基因检测的一个示例，已知有为了调查特定的生物能否在水中、土壤中、空气中等的环境中生存而通过pcr来分析是否存在来源于特定的生物的dna(被称为环境dna)的技术(例如，参照非专利文件1～3)。为了进行分析，环境dna学会制定了《环境dna调查实验手册》，并推荐将该方法(以下简称学会标准法)作为标准方法来进行定性、定量测定(参照非专利文献4)。在学会标准法中，利用烧杯等来汲取河水、海水，对其进行过滤后，提取dna。
4.(现有技术文献)
5.(专利文献)
6.非专利文献1：hideyuki doi et.al,freshwater biology(2017)62,30-39
7.非专利文献2：plos one|doi:10.1371/journal.pone.0149786march 2,2016
8.非专利文献3：plos one|doi:10.1371/journal.pone.0142008november 4,2015
9.非专利文献4：《环境dna调查、实验手册(ver2.1)》、一般社团法人环境dna学会、互联网＜网址：http://ednasociety.org/edna_manual_ver2_1_3.pdf》


技术实现要素：

10.(发明所要解决的问题)
11.学会标准法可以较为准确地得到测量结果，被认为是一种高效的方法(从环境中提取dna至可以进行pcr等扩增的状态的比例)。然而，在该方法中，存在从试样中提取dna的顺序多且花费时间、提取需要技巧、操作人员的测定结果的偏差大、提取需要的部件、器材、试剂多且昂贵等问题。这些问题不仅存在于环境dna的提取中，还存在于用于鉴定微生物、病毒的核酸的提取中。
12.本发明是鉴于这种情况而提出的，其目的之一在于，提供一种可以简单、短时间且低成本地从试样中提取核酸的技术。
13.(解决问题所采用的措施)
14.本发明的某一方式为核酸提取容器。该核酸提取容器具有：
15.过滤器部，其包括亲水性的过滤器、生物材料收集区域和试样透过区域，其中，过
滤器从试样中收集含有核酸的生物材料，生物材料收集区域在过滤器上收集生物材料，试样透过区域供透过了过滤器的试样通过；
16.试样注入口，其与生物材料收集区域相连通；
17.空气连通口，其与生物材料收集区域相连通；以及
18.试样排出口，其与试样透过区域相连通，
19.空气连通口构成为能够相对于外部开闭。
20.本发明的另一方式为核酸提取方法。该核酸提取方法包括：
21.使试样通过具有亲水性的过滤器的过滤器部而在过滤器上收集含有核酸的生物材料的工序；
22.将核酸提取液注入过滤器部，并在过滤器上提取核酸的工序；以及
23.从过滤器部回收过滤器上的含有所提取的核酸的溶液的工序。
24.本发明的又另一方式同样为核酸提取方法。该核酸提取方法包括：
25.使试样通过具有亲水性的过滤器的过滤器部而在过滤器上收集含有核酸的生物材料的工序；
26.将核酸提取液注入过滤器部，并在过滤器上提取核酸的工序；
27.使过滤器上的含有所提取的核酸的溶液移动至与过滤器部相连通的流路内的工序；以及
28.通过向流路注入空气而分注含有核酸的溶液的工序。
29.(发明的效果)
30.根据本发明，可以简单、短时间且低成本地从试样中提取核酸。
附图说明
31.图1的(a)和图1的(b)为用于说明本发明的第一实施方式的核酸提取容器的图。
32.图2为图1的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。
33.图3为图1的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。
34.图4为图1的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
35.图5为用于说明核酸提取容器的变形例1的图。
36.图6为用于说明核酸提取容器的变形例2的图。
37.图7为用于说明透过过滤器部的试样的流动的图。
38.图8为用于说明在过滤器上利用核酸提取液提取核酸的图。
39.图9的(a)和图9的(b)为用于说明本发明的第二实施方式的核酸提取容器的图。
40.图10为图9的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。
41.图11为图9的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。
42.图12为图9的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。
43.图13为图9的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。
44.图14为图9的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
45.图15的(a)和图15的(b)为用于说明本发明的第三实施方式的核酸提取容器的图。
46.图16为图15的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。
47.图17为图15的(a)所示的核酸提取容器的e-e剖视图。
48.图18为图15的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
49.图19为示意性地示出含有核酸的溶液存在于第三流路的区域c的情况的图。
50.图20的(a)和图20的(b)为用于说明本发明的第四实施方式的核酸提取容器的图。
51.图21为图20的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。
52.图22为图20的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。
53.图23为图20的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。
54.图24为图20的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。
55.图25为图20的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
56.图26的(a)和图26的(b)为用于说明本发明的第五实施方式的核酸提取容器的图。
57.图27为图26的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。
58.图28为图26的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。
59.图29为图26的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。
60.图30为图26的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。
61.图31为图26的(a)所示的核酸提取容器的e-e剖视图。
62.图32为图26的(a)所示的核酸提取容器的f-f剖视图。
63.图33为图26的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
64.图34的(a)和图34的(b)为用于说明本发明的第五实施方式的核酸提取容器所具有的压板的图。
65.图35为图34的(a)所示的压板的j-j剖视图。
66.图36为图34的(a)所示的压板的h-h剖视图。
67.图37为图34的(a)所示的压板的g-g剖面和i-i剖面的图。
68.图38为示出在生物材料收集区域的体积为20μl时的提取液量和dna浓度的关系的曲线图。
具体实施方式
69.以下，基于附图和优选的实施方式来说明本发明。实施方式是示例且不用于限定发明，实施方式所记述的所有特征、所有特征的组合并不一定是发明的本质。
70.[第一实施方式]
[0071]
图1的(a)和图1的(b)为用于说明本发明的第一实施方式的核酸提取容器10的图。图1的(a)为核酸提取容器10的俯视图，图1的(b)为核酸提取容器10的主视图。图2为图1的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。图3为图1的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。图4为图1的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
[0072]
核酸提取容器10由树脂制的基板12、贴于基板12的下部面12a的第一密封膜(film)24和贴于基板12的上部面12b的两张密封膜(第二密封膜26和第三密封膜28)构成，其中，所述基板12在下部面12a和上部面12b形成有沟状的第一流路14、第二流路16、第三流路18和具备亲水性的过滤器22的过滤器部20，所述第一密封膜24用于密封第一流路14的一部分和第二流路16。
[0073]
基板12优选由对于温度变化稳定且不易被所使用的试样溶液侵蚀的材质形成。更进一步地，基板12优选由成型性(formability)好、透明性、阻隔性(barrier property)良
好且具有低自体荧光性的材质形成。作为这种材质，可列举玻璃等的无机材料、聚丙烯、亚克力、聚酯、硅酮等的树脂，其中优选环烯烃聚合体树脂(cop)。基板12的尺寸的一个示例为长边72mm、短边26mm、厚度4mm。作为容易进行操作的基板12的尺寸，特别优选长边为50～200mm。从成型性的观点出发，厚度优选为1～4mm。从成型成本的观点出发，短边优选为10～50mm。这种基板可以通过注射成型、铸塑成型、利用数控加工机等进行的切削加工来制作。
[0074]
关于第一密封膜24和第二密封膜26，可以是其一方的主面具有粘着性，也可以是通过按压、紫外线等能量照射、加热等来发挥粘着性、附着性的功能层形成于一方的主面，第一密封膜24和第二密封膜26各自具有与基板12的下部面12a和上部面12b容易地紧贴而一体化的功能。第一密封膜24和第二密封膜26由含有粘合剂且具有低自体荧光性的材质形成为好。从该点出发，适合使用由环烯烃聚合体树脂、聚酯、聚丙烯或者亚克力等树脂构成的透明膜，但并不限定于此。此外，第一密封膜24和第二密封膜26可以由板状的玻璃、树脂形成。在该情况下，可以期待刚性，因此有助于防止核酸提取容器10的翘曲、变形。第一密封膜24和第二密封膜26的与流路相接触的部分蛋白质的吸附少为好。
[0075]
在基板12的下部面12a和上部面12b形成有沟状的第一流路14、第二流路16和第三流路18。在本实施方式的核酸提取容器10中，第一流路14、第二流路16和第三流路18的大部分形成为在基板12的下部面12a和上部面12b露出的沟状。这是为了通过使用模具等的注射成型来廉价且容易地成型。为了将该沟密封而用作流路，在基板12的下部面12a上贴上第一密封膜24，在上部面12b上贴上第二密封膜26。第一流路14和第二流路16的尺寸的一个示例为宽1.0mm，深1.0mm。第三流路18的尺寸的一个示例为宽0.6mm，深0.6mm。从减少第三流路的总体积的观点出发，优选使第三流路18的平均截面积小于第一流路14的平均截面积。由此，在过滤时向第一流路14施压，可以减少试样进入第三流路18，可以防止在回收提取液时提取液残留于第三流路18。
[0076]
第一流路14连通试样注入口30和过滤器部20的生物材料收集区域20a。试样注入口30形成为在基板12的上部面12b露出。试样注入口30可以形成为与注射器很好地匹配。可以使例如圆柱状的筒从基板12延伸。此外，为了稳定地固定放入了试样的注射器，可以将试样注入口30形成为能够以鲁尔锁定(luer lock)方式与注射器连接。
[0077]
试样从试样注入口30导入到第一流路14。可以将孔径比过滤器22大的去除异物用的前置过滤器设置于第一流路14中。
[0078]
圆形的过滤器部20形成为在基板12的上部面12b上露出。过滤器部20被第二密封膜26密封。圆形的亲水性的过滤器22设置于过滤器部20。优选形成可以在提取核酸时，从外部视觉确认过滤器22上是否存在试样的过滤器部，例如，作为第二密封膜26，可以采用透明的膜。如图2所示，过滤器部20具有在过滤器22上收集含有核酸的生物材料的生物材料收集区域20a和供透过过滤器22的试样通过的试样透过区域20b。在此，若在试样透过区域20b中，过滤器22靠近亲水性的物质，则在用过滤器22收集生物材料后注入空气而使试样从流路排出时，水容易残留于过滤器22和该材料之间，若水残留，则在提取核酸时，核酸提取液容易透过过滤器22。因此，在试样透过区域20b中，不希望过滤器22靠近亲水性的物质。
[0079]
过滤器22为亲水性。作为这种过滤器的材料，例如例举聚偏二氟乙烯(pvdf)、玻璃纤维、聚醚砜(pes)、聚酯、纤维素等，其中优选不易吸附蛋白质的pvdf、pes。可以根据收集的生物材料来适当选择过滤器22的孔径。例如，过滤器22的孔径为1μm以下。
[0080]
在此，核酸包括dna、rna和这些的衍生物。此外，生物材料除了构成生物的生物体的物质之外，还可包括细菌等的微生物和病毒。
[0081]
在生物材料收集区域20a中，过滤器22通过o形环32固定。过滤器的尺寸的一个示例为直径4mm，o形环的尺寸的一个示例为外径4mm、内径2mm。如图2所示，o形环32形成有缺口32a和32b，以将试样从第一流路14送入过滤器22上，将核酸提取液从第三流路18送入过滤器22上。第一流路侧的缺口32a形成于o形环32的上侧，但缺口32a也可以形成于o形环32的下侧。第三流路侧的缺口32b形成于o形环32的下侧。这是为了可以回收过滤器22上的所有的核酸提取液。
[0082]
第二流路16连通试样排出口34和试样透过区域20b，以使通过了过滤器22的液体通过试样透过区域20b，并通过第二流路而从试样排出口34排出。如图2所示，在本实施方式中，试样排出口34形成为在基板12的上部面12b上露出，但也可以形成为在下部面12a上露出。
[0083]
第三流路18连通空气连通口36和过滤器部20的生物材料收集区域20a。空气连通口36形成为在基板12的上部面12b露出。如图1中的(a)所示，第三密封膜28贴于空气连通口36。使用具有可以密封空气连通口36的尺寸的第三密封膜28。在使试样从试样注入口30经由第一流路而透过过滤器22时，通过第三密封膜28封闭空气连通口36，防止试样进入第三流路。在通过核酸提取液来提取收集在过滤器22上的生物材料时，剥开第三密封膜28，打开空气连通口36。如此，构成为可以使空气连通口相对于外部开闭，由此可以在过滤器22上提取核酸。在本实施方式中，通过第三密封膜对空气连通口36进行开闭，但除此之外，也可以通过插入树脂、金属的塞子的方法等进行开闭。
[0084]
可以使用例如移液器来将核酸提取液从试样注入口30和空气连通口36中的任意一方导入至过滤器部20的生物材料收集区域20a。核酸提取液的量可以是能够接触过滤器22的全部表面的量，也可以是接触一部分而能够通过移动提取液来接触全部表面的量。可以使用例如移液器来从空气连通口36和试样注入口30中的任意一方回收与过滤器22的表面接触过的提取液。空气连通口36可以构成为与移液器的前端嵌合。
[0085]
如图1的(a)所示，第一流路14和第三流路18优选为夹着生物材料收集区域20a而彼此朝向相反侧延伸，更优选为与过滤器部20相连通的第一流路14和第三流路18在一条直线上。由此，可以在使试样通过过滤器22后，防止试样残留于第一流路14和过滤器部20。
[0086]
在核酸提取容器10中，所有的流路均形成为直线状，但流路的形态并不限定于此。例如，流路可以形成为组合了曲线部和直线部的所谓的连续曲折的蛇形状，其宽度也可以在中途变宽。也可以串联多个过滤器部20。由此，可以增加过滤器部20在基板12上所占的面积，可以收集更多的生物材料。
[0087]
(变形例1)
[0088]
接着，说明第一实施方式的核酸提取容器的变形例。图5为用于说明核酸提取容器的变形例1的图。图5所示的核酸提取容器50与图1的(a)所示的核酸提取容器10的不同点在于，在基板12的上部面12b进一步设置有核酸提取液注入口52，与核酸提取液注入口52相连通的第一分歧流路54与第三流路18相连接。此外，第一分歧流路54也可以连接于第一流路14。
[0089]
(变形例2)
[0090]
图6为用于说明核酸提取容器的变形例2的图。图6所示的核酸提取容器60与图1的(a)所示的核酸提取容器10的不同点在于，在基板12的上部面12b进一步设置有核酸提取液取出口62，与核酸提取液取出口62相连通的第二分歧流路64与第三流路18相连接。此外，第二分歧流路64也可以连接于第一流路14。
[0091]
(变形例三)
[0092]
在实施方式中，可以组合上述的变形例1和变形例2而在基板12设置核酸提取液注入口、核酸提取液取出口、第一分歧流路和第二分歧流路。
[0093]
(变形例四)
[0094]
在实施方式中，可以预先在第三流路和第一流路中的任意一方封入核酸提取液，可以在存在核酸提取液的区域和过滤器部之间封入空气。由此，可以简化核酸提取的工序。
[0095]
(变形例五)
[0096]
在实施方式中，在过滤器部的试样透过区域中，在收集对象物大的情况下，可以使用孔径大的过滤器。在该情况下，核酸提取液会透过过滤器，但通过从试样排出口侧施加小的压力，可以使得核酸提取液不透过过滤器。此时的压力只要是空气不会通过湿的亲水性过滤器的压力即可。可以使用例如村田制作所制造的微型鼓风机泵(mzb1001t02)，从试样排出口施加1kp左右的压力。此外，可以以使试样从基板的下部面经由过滤器而向上部面透过，使核酸提取液在过滤器的下侧通过的方式在基板形成流路和过滤器部。
[0097]
(变形例六)
[0098]
在实施方式中，包括第一流路、过滤器部、第二流路、第三流路的一个通道形成于一个基板。若考虑每个通道的成本，则优选在一个基板制作多个通道。
[0099]
接着，对如上构成的核酸提取容器10的使用方法进行说明。首先，将试样从试样注入口30向第一流路14导入，并使试样透过过滤器部20。试样的导入方法并不限定于此，例如，可以通过移液器(pipet)、滴管(spuit)、注射器(syringe)等来从该注入口直接导入适量的试样。更进一步地，可以在利用移液器、滴管、注射器等来进行的试样的吐出、导入之后，进一步加压推压或者从试样排出口34抽吸而使试样移动至过滤器部。
[0100]
图7为用于说明透过过滤器部的试样的流动的图。在图8中，如箭头a所示，试样从第一流路14向过滤器部20移动，并透过过滤器22。此时，在过滤器部20的生物材料收集区域20a中，在过滤器22上收集含有核酸的生物材料。透过过滤器22的试样向第二流路16移动。接着，从试样注入口30注入空气而将试样从第一流路14、过滤器部20、第二流路16排出。在这些工序中，空气连通口36一直被第三密封膜28密封。
[0101]
接着，剥开第三密封膜28，并将核酸提取液从空气连通口36向第三流路注入。图8为用于说明在过滤器上利用核酸提取液提取核酸的图。在图8中，如箭头b1所示，核酸提取液从第三流路向过滤器部20移动而与过滤器22的表面接触。此外，也可以将核酸提取液从试样注入口30向第一流路14注入，并使其向过滤器部20移动。
[0102]
过滤器22的孔径为如上所述那样例如1μm以下，因此核酸提取液不透过过滤器22，而停留在过滤器22上。核酸提取液的量可以是能够接触过滤器22的整个表面的量，也可以是不能接触整个表面的量。在核酸提取液的量为能够接触过滤器22的整个表面的量的情况下，使核酸提取液在过滤器22上静置例如1分钟，由此可以从过滤器22上的生物材料中提取核酸。在核酸提取液的量为不能接触过滤器22的整个表面的量的情况下，将例如移液器插
入到空气连通口36或者试样注入口30，进行基于移液器的空气的推出或抽吸，由此如图8的箭头b2所示，使核酸提取液在过滤器22上进行往复。通过该核酸提取液的往复运动，可以从收集在过滤器22上的生物材料中提取核酸。此外，用移液器进行的核酸提取液的往复运动也可以使用微型鼓风机泵等实现往复。该往复运动可以通过例如特开2019-180418所记载的方法来实现。
[0103]
在例如试样中含有许多破碎的细胞，并线粒体、核酸从细胞中被释放的情况下，收集在过滤器22上的核酸在室温下与核酸提取液接触，则可提取核酸。另一方面，在试样为细菌等的情况下，存在在常温下无法提取核酸的情况。在该情况下，可以通过施加95℃左右的温度来提取核酸。例如，将基板12载置于高温的金属板上，从而使生物材料收集区域20a的温度上升至95℃左右，由此可以从细菌等的试样中提取核酸。
[0104]
关于过滤器22上的含有所提取的核酸的溶液，将移液器插入到空气连通口36或试样注入口30而抽吸该溶液，由此从过滤器部20回收该溶液。根据上述内容完成试样中的核酸的提取。
[0105]
[第二实施方式]
[0106]
本发明的第二实施方式的核酸提取容器也由基板、贴于该基板的密封膜和过滤器构成。关于与第一实施方式的核酸提取容器10共通的结构，使用相同的符号，适当省略重复的说明。
[0107]
图9的(a)和图9的(b)为用于说明本发明的第二实施方式的核酸提取容器的图。图10为图9的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。图11为图9的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。图12为图9的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。图13为图9的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。图14为图9的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。第二实施方式的核酸提取容器80在过滤器部和第二流路方面具有与第一实施方式的核酸提取容器10不同的结构。
[0108]
如图9的(a)所示，在第二实施方式的核酸提取容器80中，沟状的过滤器部82形成为在基板12的上部面12b露出。长方形的亲水性的过滤器84设置于过滤器部82。过滤器部82具有在过滤器84之上的生物材料收集区域82a和在过滤器84之下的试样透过区域82b。如图9的(a)所示，在生物材料收集区域82a中，通过在过滤器84的长边的两侧设置硅酮橡胶(silicone rubber)86、88来固定过滤器84。过滤器84的尺寸的一个示例为长边21mm、短边4.0mm，硅酮橡胶86、88的尺寸的一个示例为长边21mm、短边1.5mm、厚度0.5mm。因此，生物材料收集区域82a变为宽1.0mm，深0.5mm的流路。第二实施方式的核酸提取容器80的过滤器部82的试样的透过面积比第一实施方式的核酸提取容器10的过滤器部20大。因此，在第二实施方式中，可以进一步提高核酸的提取效率。
[0109]
如图9的(a)所示，过滤器84所露出的部分(夹在硅酮橡胶86、88之间的部分)与第一流路14和第三流路18处于同一条直线上。由此，使试样透过后的流路的空气的置换变得容易，使提取液的移动和回收变得容易。
[0110]
如图10所示，试样透过区域82b与第二流路90的第一支流路90a、第二支流路90b、第三支流路90c、第四支流路90d相连通。支流路的数量可以根据过滤器84的形状来适当变更。
[0111]
与上述的第一实施方式的核酸提取容器10的使用方法相同地使用如上所述般构
成的第二实施方式的核酸提取容器80，由此可以提取试样中的核酸。
[0112]
上述的变形例1～6也可以适用于第二实施方式的核酸提取容器80。
[0113]
[第三实施方式]
[0114]
本发明的第三实施方式的核酸提取容器与第二实施方式的核酸提取容器相同地，也由基板、贴于该基板的密封膜和过滤器构成。关于与第二实施方式的核酸提取容器80共通的结构，使用相同的符号，适当省略重复的说明。
[0115]
图15的(a)和图15的(b)为用于说明本发明的第三实施方式的核酸提取容器的图。图16为图15的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。图17为图15的(a)所示的核酸提取容器的e-e剖视图。图18为图15的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。第三实施方式的核酸提取容器100和第二实施方式的核酸提取容器80的结构的不同点在于，核酸提取容器80设置有：在基板12的上部面12b上的核酸提取液取出口102、与核酸提取液取出口102相连通并与第三流路18连接的第二分歧流路104、在基板12的上部面12b上的空气注入口106、以及与空气注入口106相连通并连接于第三流路18的第三分歧流路108，核酸提取液取出口102和空气注入口106被第四密封膜110密封。在第三实施方式中，可以通过使用第三流路18的与第二分歧流路104的连接位置和第三流路18的与第三分歧流路108的连接位置之间的第三流路18的区域c，来分注规定量的核酸提取液而送至核酸提取液取出口102。
[0116]
如图17所示，核酸提取液取出口102可以为能够储存核酸提取液的形状。可以在储存了核酸提取液的核酸提取液取出口102直接混合用于pcr扩增的试剂。
[0117]
接着，对如上构成的核酸提取容器100的使用方法进行说明。首先，与上述的第一实施方式的核酸提取容器10的使用方法相同地，使试样通过过滤器部82，在过滤器84上收集含有核酸的生物材料，将核酸提取液放入过滤器部82，在过滤器84上提取核酸。
[0118]
接着，将移液器插入到空气连通口36并使移液器动作，由此使过滤器84上的含有提取出的核酸的溶液向包括第三流路18的区域c的位置移动。提取核酸时，剥开第三密封膜28而空气连通口36打开。图19为示意性地示出含有核酸的溶液存在于第三流路18的区域c的情况的图。接着，贴回第三密封膜28而封闭空气连通口36，通过新的密封膜(未图示)来封闭试样注入口30。之后，剥开第四密封膜110而打开核酸提取液取出口102和空气注入口106。将移液器插入到空气注入口106并推入空气，由此仅将存在于区域c的含有核酸的溶液送至核酸提取液取出口102。由此，分注含有核酸的溶液。核酸提取液取出口102的形状为上述的能够储存溶液的形状。更进一步地，将区域c的容积设定为可以与pcr扩增试剂直接混合的容积，由此可以在核酸提取液取出口102储存该容积的溶液。在该情况下，可以直接将用于pcr扩增的试剂添加于储存在核酸提取液取出口102的溶液。
[0119]
上述的变形例1、4～6也可以适用于第三实施方式的核酸提取容器100。
[0120]
[第四实施方式]
[0121]
图20的(a)和图20的(b)为用于说明本发明的第四实施方式的核酸提取容器的图。图21为图20的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。图22为图20的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。图23为图20的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。图24为图20的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。图25为图20的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。
[0122]
核酸提取容器120由树脂制的基板122、贴于基板122的下部面122a的第一密封膜
134、和贴于基板122的上部面122b的两张密封膜(第二密封膜136和第三密封膜138)构成，所述基板122在下部面122a和上部面122b形成有沟状的第一流路124、第二流路126、第三流路128和具有亲水性的过滤器132的过滤器部130，所述第一密封膜134用于密封第二流路126和过滤器部130。
[0123]
基板122的材质和尺寸与第一实施方式中的基板12相同。此外，与第一实施方式的基板12相同地，基板122可以通过注射成型、铸塑成型、利用数控加工机等进行的切削加工来制作。
[0124]
第一密封膜134和第二密封膜136的结构和材质与第一实施方式中的第一密封膜24和第二密封膜26相同。第一密封膜134和第二密封膜136的与流路相接触的部分优选为吸附的蛋白质少。
[0125]
在基板122的下部面122a和上部面122b形成有沟状的第一流路124、第二流路126和第三流路128。与第一实施方式相同地，在第四实施方式的核酸提取容器120中，第一流路124、第二流路126和第三流路128的大部分也形成为在基板122的下部面122a和上部面122b露出的沟状。这是为了通过使用了模具等的注射成型来廉价且容易地成型。为了将该沟密封而用作流路，在基板122的下部面122a上贴上第一密封膜134，在上部面12b上贴上第二密封膜136。第一流路124、第二流路126和第三流路128的尺寸与第一实施方式中的第一流路14、第二流路16、第三流路18相同。
[0126]
第一流路124连通试样注入口140和过滤器部130的生物材料收集区域130a。试样注入口140形成为在基板122的上部面122b上突出。试样注入口140的形状并不限定于图示的形状，与第一实施方式中的试样注入口30相同地，可以使试样注入口140形成为与注射器很好地匹配，也可以使试样注入口140形成为能够以鲁尔锁定方式与注射器连接。
[0127]
试样从试样注入口140导入到第一流路124。可以将孔径比过滤器132大的去除异物用的前置过滤器设置于第一流路124中。
[0128]
沟状的过滤器部130形成为在基板122的下部面122a上露出。过滤器部130被第一密封膜134密封。亲水性的过滤器132设置于过滤器部130。如图21所示，过滤器部130具有在过滤器132上收集含有核酸的生物材料的生物材料收集区域130a和供透过过滤器132的试样通过的试样透过区域130b。如在第一实施方式中说明的那样，为了在提取核酸时不使核酸提取液透过过滤器132，在试样透过区域130b中，不希望过滤器132靠近亲水性的物质。
[0129]
在试样透过区域130b中，通过在过滤器132的长边的两侧设置硅酮橡胶142、144来固定过滤器132，但也可以将过滤器接合或者熔接于基板122的下部面122a的沟面。过滤器132的尺寸的一个示例为长边40mm、短边4.0mm，硅酮橡胶142、144的尺寸的一个示例为长边40mm、短边1.5mm、厚度0.5mm。因此，试样透过区域130b变为宽1.0mm，深0.5mm的流路。生物材料收集区域130a在基板122的下部面122a上形成为沟状，在试样透过区域130b设置过滤器132，由此变为流路。生物材料收集区域130a的尺寸的一个示例为宽1.0mm，深0.5mm。像这样将过滤器部130形成于基板122的下部面122a上，从试样透过区域130b侧固定过滤器132，由此，即使异物附着于如本实施方式中的硅酮橡胶这样的过滤器的夹具、在组装核酸提取容器时进入异物，也可以防止这些异物混入核酸提取液。此外，在使试样透过过滤器时，在基板中向生物材料收集区域施加压力，因此，根据压力的大小存在密封过滤器部的膜被剥开的风险，而根据本实施方式中的过滤器部130的结构，密封生物材料收集区域130a的面积
变小，密封过滤器部的膜被剥开的风险变小。
[0130]
过滤器132的材料和孔径与第一实施方式中的过滤器22相同。
[0131]
第二流路126连通试样排出口146和试样透过区域130b，以使通过了过滤器132的液体通过试样透过区域130b，并通过第二流路126而从试样排出口146排出。在本实施方式中，试样排出口146形成为从基板122的上部面122b上突出，但也可以形成于下部面122a上。
[0132]
第三流路128连通空气连通口148和过滤器部130的生物材料收集区域130a。空气连通口148形成为在基板122的上部面122b突出。如图20的(a)所示，第三密封膜138贴于空气连通口148。空气连通口148和第三密封膜138的结构与第一实施方式中的空气连通口36和第三密封膜28相同。
[0133]
与第一实施方式相同地，可以将核酸提取液从试样注入口140和空气连通口148中的任意一方导入至过滤器部130的生物材料收集区域130a。核酸提取液的量可以是能够接触过滤器132的全部表面的量，也可以是接触一部分而能够通过移动提取液来接触全部表面的量。与第一实施方式相同地，可以从空气连通口148和试样注入口140中的任意一方回收与过滤器132的表面接触过的提取液，也可以向生物材料收集区域130a施加压力，使提取液透过过滤器132而从试样排出口146回收提取液。空气连通口148可以构成为与移液器的前端嵌合。
[0134]
如图20的(a)所示，第一流路124和第三流路128优选为夹着生物材料收集区域130a而彼此朝向相反侧延伸，更优选为与过滤器部130相连通的第一流路124和第三流路128在一条直线上。由此，可以在使试样通过过滤器132后，防止试样残留于第一流路124和过滤器部130。
[0135]
在核酸提取容器120中，所有的流路均形成为直线状，但流路的形态并不限定于此。例如，流路可以形成为组合了曲线部和直线部的所谓的连续曲折的蛇形状，其宽度也可以在中途变宽。也可以串联多个过滤器部130。由此，可以增加过滤器部130在基板122上所占的面积，可以收集更多的生物材料。
[0136]
与上述的第一实施方式的核酸提取容器10的使用方法相同地使用如上构成的第四实施方式的核酸提取容器120，由此可以提取试样中的核酸。
[0137]
上述的变形例1～6也可以适用于第四实施方式的核酸提取容器120。
[0138]
[第五实施方式]
[0139]
图26的(a)和图26的(b)为用于说明本发明的第五实施方式的核酸提取容器的图。图27为图26的(a)所示的核酸提取容器的a-a剖视图。图28为图26的(a)所示的核酸提取容器的b-b剖视图。图29为图26的(a)所示的核酸提取容器的c-c剖视图。图30为图26的(a)所示的核酸提取容器的d-d剖视图。图31为图26的(a)所示出的核酸提取容器的e-e剖视图。图32为图26的(a)所示的核酸提取容器的f-f剖视图。图33为图26的(a)所示的核酸提取容器所具有的基板的俯视图。图34的(a)和图34的(b)为用于说明本发明的第五实施方式的核酸提取容器所具有的压板的图。
[0140]
图35为图34的(a)所示的压板的j-j剖视图。图36为图34的(a)所示的压板的h-h剖视图。图37为图34的(a)所示的压板的g-g剖面和i-i剖面的图。
[0141]
核酸提取容器160由树脂制的基板162、第一密封膜170和压板180构成，所述基板162在下部面162a和上部面162b形成有沟状的流路164和具有亲水性的过滤器168的过滤器
部166，所述第一密封膜170贴于基板162的下部面162a上，用于密封流路164和过滤器部166，所述压板180将过滤器168固定于过滤器部166。
[0142]
基板162的材质和尺寸与第一实施方式中的基板12相同。此外，与第一实施方式的基板12相同地，基板162可以通过注射成型、铸塑成型、利用数控加工机等进行的切削加工来制作。
[0143]
第一密封膜170的结构和材质与第一实施方式中的第一密封膜24和第二密封膜26相同。第一密封膜170的与流路相接触的部分优选为吸附的蛋白质少。
[0144]
沟状的流路164形成于基板162的下部面162a。在第五实施方式的核酸提取容器160中，流路164形成为在基板162的下部面162a露出的沟状。这是为了通过使用了模具等的注射成型来廉价且容易地成型。为了将该沟密封而用作流路，在基板162的下部面162a上贴上第一密封膜170。流路164的尺寸与第一实施方式中的第二流路16相同。
[0145]
试样注入口174与过滤器部166的生物材料收集区域130a相连通。试样注入口174形成为在基板162的上部面162b上突出。试样注入口174的形状并不限定于图示的形状，与第一实施方式中的试样注入口30相同地，可以使试样注入口174形成为与注射器很好地匹配，也可以使试样注入口140形成为能够以路厄锁定方式来与注射器进行连接。
[0146]
试样从试样注入口174导入到过滤器部166的生物材料收集区域166a。可以将孔径比过滤器168大的去除异物用的前置过滤器设置于试样注入口174中。
[0147]
沟状的过滤器部166形成为在基板162的下部面162a上露出。亲水性的过滤器168设置于过滤器部166。如图27所示，过滤器部166具有在过滤器168上收集含有核酸的生物材料的生物材料收集区域166a和供透过过滤器168的试样通过的试样透过区域166b。在试样透过区域166b中，通过设置压板180来固定过滤器168，但也可以将过滤器168接合或者熔接于基板162的下部面162a的沟面。过滤器部166被第一密封膜170密封。如在第一实施方式中说明的那样，为了在提取核酸时不使核酸提取液透过过滤器168，在试样透过区域166b中，不希望过滤器168靠近亲水性的物质。
[0148]
过滤器168的尺寸的一个示例为长边46mm、短边6mm，压板180的尺寸的一个示例为长边46mm、短边6mm、厚度1mm。试样透过区域166b变为宽1mm、深1mm的流路。生物材料收集区域166a在基板162的下部面162a上形成为沟状，在试样透过区域166b设置过滤器168，由此变为流路。生物材料收集区域166a的尺寸的一个示例为宽1mm、深0.5mm。像这样将过滤器部166形成于基板162的下部面162a上，从试样透过区域166b侧通过压板180来固定过滤器168，由此，即使异物附着于本实施方式中的压板、在组装核酸提取容器时进入异物，也可以防止这些异物混入核酸提取液。此外，在使试样透过过滤器时，在基板中向生物材料收集区域施加压力，因此，根据压力的大小存在密封过滤器部的膜被剥开的风险，而根据本实施方式中的过滤器部166的结构，密封生物材料收集区域166a的面积变小，密封过滤器部的膜被剥开的风险变小。
[0149]
过滤器168的材料和孔径与第一实施方式中的过滤器22相同。
[0150]
如图34的(a)、图34的(b)、图35～图37所示，压板180由树脂制的基板182构成，构成试样透过区域166b的切口182a形成于基板182。基板182的材质与第一实施方式中的基板12相同。基板182的尺寸和形状可以根据期望的过滤器部166的尺寸和形状来适当调整。切口182a的尺寸和形状可以根据期望的试样透过区域166b的尺寸和形状来适当调整。此外，
与第一实施方式的基板12相同地，基板182可以通过注射成型、铸塑成型、利用数控加工机等进行的切削加工来制作。
[0151]
流路164连通试样排出口176和试样透过区域166b，以使通过了过滤器168的液体通过试样透过区域166b，并通过流路164而从试样排出口176排出。在本实施方式中，试样排出口176形成为从基板162的上部面162b上突出，但也可以形成于下部面162a上。
[0152]
空气连通口178与过滤器部166的生物材料收集区域166a相连通。空气连通口178形成为在基板162的上部面166b突出。如图26的(a)所示，第二密封膜172贴于空气连通口178。空气连通口178和第二密封膜172的结构与第一实施方式中的空气连通口36和第三密封膜28相同。
[0153]
与第一实施方式相同地，可以将核酸提取液从试样注入口174和空气连通口178中的任意一方导入至过滤器部166的生物材料收集区域166a。核酸提取液的量可以是能够接触过滤器168的全部表面的量，也可以是接触一部分而能够通过移动提取液来接触全部表面的量。与第一实施方式相同地，可以从空气连通口178和试样注入口174中的任意一方回收与过滤器168的表面接触过的提取液，也可以向生物材料收集区域166a施加压力，使提取液透过过滤器168而从试样排出口176回收提取液。空气连通口178可以构成为与移液器的前端嵌合。
[0154]
如图26的(a)和图27所示，试样注入口174和空气连通口178与生物材料收集区域166a直接连通。进而，密封膜的数量比第一实施方式～第四实施方式少。因此，能够以比第一实施方式～第四实施方式低的成本制造第五实施方式的核酸提取容器。
[0155]
如图26的(a)和图27所示，试样注入口174和空气连通口178优选为夹着生物材料收集区域166a而配置于彼此的相反侧。由此，可以在使试样通过过滤器168后，防止试样残留于过滤器部166。
[0156]
在核酸提取容器160中，流路形成为直线状，但流路的形态并不限定于此。例如，流路可以形成为组合了曲线部和直线部的所谓的连续曲折的蛇形状，其宽度也可以在中途变宽。也可以串联多个过滤器部166。由此，可以增加过滤器部166在基板162上所占的面积，可以收集更多的生物材料。
[0157]
与上述的第一实施方式的核酸提取容器10的使用方法同样地使用如上构成的第五实施方式的核酸提取容器160，由此可以提取试样中的核酸。
[0158]
上述的变形例5、6也可以适用于第五实施方式的核酸提取容器160。
[0159]
(实施例)
[0160]
以下，说明本发明的实施例，但这些实施例仅为用于优选地说明本发明的示例，并不以任何方式限制本发明。
[0161]
在本实施例中，关于环境dna的分析，比较实施方式的使用核酸提取溶液的方法和现有的学会标准法。在此，环境dna(environmental dna,edna)是指，释放到环境中、来源于在此生存的生物的dna。更具体地，在环境中生存的各种生物不断地向周围释放出其dna。例如，在动物的情况下，通过皮肤、体毛、排泄物、尸体等释放出其dna。通过检测或者定量存在于环境中的环境dna，可以确定生存于该环境的物种，或者可以掌握该环境的生物多样性。此外，从稳定性的观点出发，分析的dna的种类多为线粒体dna。在学会标准法中，过滤数百ml～1l的试样水，从所收集到的含有环境dna的粒子中提取dna，最终成为提取出200μl的液
体的状态。之后，使用该液体的一部分(2μl左右)并通过pcr进行检测，观察是否存在被测定生物，或者观察存在的程度。
[0162]
在本实施例中的pcr中使用的试剂如下述表1所示。
[0163]
[表1]
[0164][0165][0166]
在pcr中使用的正向引物(引物f)、反向引物(引物r)、取样针的序列如下。
[0167]
虹鳟鱼引物f：5'-agtctctccctgtatatcgtc-3'(序列号1)
[0168]
虹鳟鱼引物r：5'-gatttagttcatgaagttgcgagagta-3'(序列号2)
[0169]
虹鳟鱼取样针：5'-ccaacaactctttaaccatc-3'(序列号3)
[0170]
取样针的5'端用fam标记，3'端用[nfq]-[mgb]标记。
[0171]
(参考文献：wilcox,t.m,carim,k.j.,mckelvey,k.s.,young,m.k.,&schwartz,m.k.2015(4nov.).the dual challenges of generality and specificity when developing environmental dnamarkers for species and subspecies of oncorhynchus.plos one,10(11)e0142008.doi:10.1371/journal.pone.0142008.)
[0172]
鲤鱼引物f：5'-ggtgggttctcagtagacaatgc-3'(序列号4)
[0173]
鲤鱼引物r：5'-ggcggcaataacaaatggtagt-3'(序列号5)
[0174]
鲤鱼取样针：5'-cactaacacg attcttcgca ttccacttcc-3”'(序列号6)
[0175]
取样针的5'端用fam标记，3'端用tamra标记。
[0176]
(参考文献：takahara,t.,minamoto,t.,yamanaka,h.,doi,h.&kawabata,z.2012.estimation of fish biomass using environmental dna.plos one,7:e35868.)
[0177]
鲣鱼引物f：5'-tacccctgacgtagaatcagcc-3'(序列号7)
[0178]
鲣鱼引物r：5'-ggccaatatgggagtaaatgcag-3'(序列号8)
[0179]
鲣鱼取样针；5'-tgccgagacgtaaacttcgg-3'(序列号9)
[0180]
取样针的5'端用cy5标记，3'端用bhq3标记。
[0181]
(参考文献：lin,w.-f.&hwang,d.-f.2008.application of species-specific pcr for the identification of dried bonito product(katsuobushi).food chemistry 106:390-396.)
[0182]
pcr的扩增反应的条件如下。
[0183]
95℃下15秒，之后重复60℃下10秒和95℃下3.5秒。
[0184]
(实施例1)
[0185]
制作图1的(a)和图1的(b)所示的核酸提取容器10。核酸提取容器10为26*75*4mm的板状，材质为环烯烃聚合物(cop)。通过贴附3m公司的聚烯烃微密封胶带(9795)来密封流路、过滤器部、空气连通口。第一流路14和第二流路16的尺寸为宽1.0mm，深1.0mm，第三流路18的尺寸为宽0.6mm，深0.6mm。亲水性过滤器的尺寸为φ4mm。通过φ4*φ2的o形环32来固定过滤器22。过滤器22的素材为聚偏二氟乙烯(pvdf)，孔径为0.45μm。过滤器22的有效面为φ3mm。
[0186]
使用该核酸提取容器而通过以下的步骤来得到提取出dna的提取液。
[0187]
(1)将10ml注射器插入到试样注入口30，从此处注入2ml试样。此时，将管插入到试样排出口34而废弃所排出的溶液。
[0188]
(2)暂时拔出先前的注射器，吸入10ml空气后，再次插入到试样注入口30，将10ml空气注入流路，由此，排出第一流路14和第二流路16内的试样。
[0189]
(3)剥开空气连通口36的密封膜，通过移液器从此处注入5μl的dna提取液，在通过目视来确认位置的同时，将dna提取液推入至过滤器部20，放置1分钟。
[0190]
(4)将移液器插入到空气连通口36而吸取先前的提取液。
[0191]
试样为将鲣鱼的生肉悬浮于纯水中而得到的悬浮液的稀释水。作为dna提取液，使用200mm的na2co3水溶液。
[0192]
将1.6μl使用核酸提取容器10而得到的提取液与14.4μl的pcr扩增试剂混合，通过日本板硝子株式会社制的pcr1100来扩增，得到的循环数阈值(ct值)为38.9。过滤和提取所需的时间为约3分钟。在本实施例中，将提取液与pcr扩增试剂直接混合，但也可以在使提取液与中和液等混合后再与pcr试剂混合。
[0193]
(比较例1)
[0194]
按照《环境dna调查、实验手册(ver2.1)》(一般社团法人环境dna学会、互联网＜网址：http://ednasociety.org/edna_manual_ver2_1_3.pdf》)，通过滤芯式过滤器(cartridge-type filter)(sterivex 0.45μm；默克公司制造)过滤50ml与实施例1相同的试样后，使用qiagen k.k.的dneasy血液和组织试剂盒来提取dna。将1.6μl得到的提取液与14.4μl的pcr扩增试剂混合，通过与实施例1相同的移动式pcr装置(产品名picogene pcr1100)来扩增，得到的ct值为40.1。过滤和提取所需的时间为约2小时。
[0195]
实施例1和比较例1的结果如下述表2所示。
[0196]
[表2]
[0197][0198]
实施例1中的试样的量在比较例1的1/10以下。此外，在实施例1中，从过滤到提取为止的工序比比较例1简单，且实施例1的工序所需时间为3分钟左右，而比较例1为2小时。更进一步地，如表2所示，通过实施例1得到的ct值与通过比较例1得到的ct值近乎等同，这表示实施例1可以在试样的量在1/10的情况下得到与比较例1等同的检测灵敏度。在实施例1中使用的消耗品少，提取所使用的核酸提取容器10的结构简单，能够以低成本进行制造。通常来说，在核酸核定中，为了避免像残留物这样的污染，许多物品都是一次性的，因此降低消耗品的成本十分重要。更进一步地，在实施例1中，试样的量少，因此容易将作为试样的水送至检测公司。此外，在实施例1中，不需要特别的设备且操作顺步骤少而简单，因此任何人都可以轻松地进行提取，也可以在现场进行提取。此外，在实施例1中，可以在密封空间进行过滤和提取，因此减少了污染的风险。
[0199]
(实施例2)
[0200]
制作图9的(a)和图9的(b)所示的核酸提取容器80。核酸提取容器80为26*75*4mm的板状，材质为环烯烃聚合物(cop)。通过贴附3m公司的聚烯烃微密封胶带(9795)来密封流路、过滤器部、空气连通口。第一流路14和第二流路16的尺寸为宽1.0mm，深1.0mm，第三流路18的尺寸为宽0.6mm，深0.6mm。过滤器84的尺寸为长21mm、宽4mm。通过宽1.5mm、厚0.5mm的硅酮橡胶86、88来从上压住过滤器84的两侧，由此固定过滤器84。过滤器84的素材为聚偏二氟乙烯(pvdf)，孔径为0.45μm。过滤器84的有效面积为20mm2。
[0201]
使用该核酸提取容器80而通过以下的步骤来得到提取出dna的提取液。
[0202]
(1)将10ml注射器插入到试样注入口30，从此处注入10ml或者5ml试样。此时，将管插入到试样排出口34而废弃所排出的溶液。
[0203]
(2)暂时拔出先前的注射器，吸入10ml空气后，再次插入到试样注入口30，将10ml空气注入第一流路和第二流路。
[0204]
(3)剥开空气连通口36的第三密封膜28，通过移液器从此处注入5μl的dna提取液，将提取液推入至过滤器部82。之后，在通过目视来确认位置的同时，使用移液器使dna提取液往复1分钟，以使dna提取液接触到过滤器84的所有有效面。
[0205]
(4)将移液器插入到空气连通口36而吸取先前的提取液。
[0206]
试样为将虹鳟鱼的水槽水用纯水稀释100倍的液体10ml(实施例2-1)、为筑波市的鲤鱼所生存的池塘的水5ml(实施例2-2)。作为dna提取液，使用200mm的na2co3水溶液(实施例2-1)、使用钟渊化学工业股份有限公司的简易提取试剂盒第2版(实施例2-2)。
[0207]
从所获得的dna提取液中取出1.6μl，并将其直接与14.4μl的pcr扩增试剂混合，通过与实施例1相同的移动式pcr装置来扩增，得到如下述表3所示的结果。这次将提取液与pcr扩增试剂直接混合，但也可以在使提取液与中和液等混合后再与pcr试剂混合。过滤和
提取所需的时间为约3分钟。
[0208]
[表3]
[0209][0210]
在本实施例中的dna提取中，dna提取液仅与过滤器的一半左右接触，但可知通过使dna提取液往复，可以提取捕捉(trap)在过滤器的整个面积的dna。据此，可以通过使滤器部的长度边长且提高试样的透过量，来进一步提高灵敏度。
[0211]
通常，将被提取物(小鼠的尾巴、植物等)浸渍于提取液而溶解，从而提取核酸。在本实施例中，可知即使不浸渍于提取液，仅通过使提取液流动于收集有生物材料的过滤器上，也可以进行提取。仅通过流动便可提取意味着提取液比浸渍整体的情况少，使得提取液中的核酸浓度上升。
[0212]
(比较例2)
[0213]
与比较例1相同地，从100ml与实施例2-1相同的试样(比较例2-1)中、从50ml与实施例2-2相同的试样(比较例2-2)中提取dna。将1.6μl得到的提取液与14.4μl的pcr扩增试剂混合，通过与实施例1相同的移动式pcr装置来扩增，得到如下述表4所示的结果。过滤和提取所需的时间为约2小时。
[0214]
[表4]
[0215][0216]
在实施例2中，即使使用与比较例2相同的试样，也能够以1/10的试样量来得到近乎相同的ct值，检测出相同的dna量。即，实施例2的检测灵敏度与比较例2等同，与实施例1相同地，实施例2具有容易将试样送至检测公司、提取步骤简单、污染少的优点。
[0217]
(实施例3)
[0218]
制作图15的(a)和图15的(b)所示的核酸提取容器100。核酸提取容器100为26*75*4mm的板状，材质为环烯烃聚合物(cop)。通过贴附3m公司的聚烯烃微密封胶带(9795)来密封流路、过滤器部、注入口。第一流路14和第二流路16的尺寸为宽1.0mm、深1.0mm。第三流路
18的尺寸为宽0.6mm、深0.6mm。第二分歧流路104和第三分歧流路108的尺寸与第三流路18相同。过滤器84的尺寸为长21mm、宽4mm。通过宽1.5mm、厚0.5mm的硅酮橡胶86、88来从上压住过滤器84的两侧，由此固定过滤器84。过滤器84的素材为聚偏二氟乙烯(pvdf)，孔径为0.45μm。过滤器84的有效面积为20mm2。
[0219]
使用该核酸提取容器100而通过以下的步骤来得到提取出dna的提取液。试样为10ml的实施例2-1的水。
[0220]
(1)将10ml注射器插入到试样注入口30，从此处注入10ml试样。此时，将管插入到排出口而废弃所排出的溶液。
[0221]
(2)暂时拔出先前的注射器，吸入10ml空气后，再次插入到试样注入口30，将10ml空气注入流路。
[0222]
(3)剥开第三密封膜28，通过移液器从空气连通口36注入5μl的提取液，将提取液推入至过滤器84后，在通过目视来确认位置的同时，使用移液器来使提取液往复1分钟，以使提取液接触到过滤器84的所有有效面，最终使提取液停止于包括第三流路18的区域c的部分。
[0223]
(4)贴回第三密封膜以密封空气连通口36，通过新的密封膜来封闭试样注入口30后，剥开第四密封膜110，将移液器插入到空气注入口106，通过移液器推入空气，由此在核酸提取液取出口102的液储部中储存先前的提取液。
[0224]
将储存在液储部的提取液分注为1.6μl。将此投入14.4μl的pcr扩增试剂而混合。通过与实施例1相同的移动式pcr装置来扩增该混合液中的dna，得到的ct值为30.2。过滤和提取所需的时间为约3分钟。在本实施例中，将提取液与pcr扩增试剂直接混合，但也可以在使提取液与中和液等混合后再与pcr试剂混合。与实施例2相比，不需要1.6μl的分注，也不再需要与pcr扩增试剂混合的管，因此可以更容易地从提取转到pcr扩增。
[0225]
[表5]
[0226][0227]
(实施例4)
[0228]
制作图26的(a)和图26的(b)所示的核酸提取容器160。核酸提取容器160为26*75*4mm的板状，材质为环烯烃聚合物(cop)。通过贴附3m公司的聚烯烃微密封胶带(9795)来密封流路、过滤器部、注入口。流路164的尺寸为宽1.0mm、深1.0mm。试样透过区域166b为宽1mm、深1mm的流路。生物材料收集区域166a为宽1mm、深0.5mm的流路。过滤器168的尺寸为长46mm、宽6mm。通过将如图34所示的压板180放入核酸提取容器160，来固定过滤器168。压板180为6*46*1mm的板状。过滤器168的素材为聚偏二氟乙烯(pvdf)，孔径为0.65μm。过滤器168的有效面积为40mm2。生物材料收集区域166a的体积为20μl。
[0229]
使用该核酸提取容器160而通过以下的步骤来得到提取出dna的提取液。
[0230]
(1)将10ml注射器插入到试样注入口174，从此处注入10ml试样。此时，将管插入到排出口而废弃所排出的溶液。
[0231]
(2)暂时拔出先前的注射器，吸入10ml空气后，再次插入到试样注入口174，将10ml
空气注入流路。
[0232]
(3)剥开第二密封膜172，通过移液器从空气连通口178注入规定量的提取液，将提取液推入至过滤器168后，在通过目视来确认位置的同时，使用移液器使提取液往复2分钟，以使提取液接触到过滤器168的所有有效面。
[0233]
(4)使用相同的移液器从空气连通口178回收提取液。
[0234]
试样为将虹鳟鱼的水槽水用纯水稀释50倍的液体10ml。作为dna提取液，使用钟渊化学工业股份有限公司的简易提取试剂盒第2版。
[0235]
从所获得的提取液中取出1.5μl，并将其直接与13.5μl的pcr扩增试剂混合，利用stepone plus实时pcr系统(applied biosystems)来扩增。提取液量和dna浓度(复制数/μl)的关系如图38所示。其中，dna浓度是从pcr时创建标准曲线的ct值转换而来的。
[0236]
根据图38可知，若通过少的提取液量来进行提取，则提取液的dna浓度变高。
[0237]
以上，基于实施方式对本发明进行了说明。本领域技术人员可以理解的是：该实施方式是一个示例，这些实施方式的各构件、各处理过程的组合可产生各种各样的变形例，并且这些变形例都属于本发明的范围。
[0238]
(产业上的可利用性)
[0239]
本发明可以利用于核酸提取容器和核酸提取方法。
[0240]
(附图标记的说明)
[0241]
10：核酸提取容器；14：第一流路；16：第二流路；18：第三流路；
[0242]
20：过滤器部；20a：生物材料收集区域；20b：试样透过区域；
[0243]
22：过滤器；30：试样注入口；34：试样排出口；36：空气连通口；
[0244]
50：核酸提取容器；52：核酸提取液注入口；54：第一分歧流路；
[0245]
60：核酸提取容器；62：核酸提取液取出口；64：第二分歧流路；
[0246]
80：核酸提取容器；82：过滤器部；82a：生物材料收集区域；
[0247]
82b：试样透过区域；84：过滤器；90：第二流路；
[0248]
100：核酸提取容器；102：核酸提取液取出口；
[0249]
104：第二分歧流路；106：空气注入口；108：第三分歧流路；
[0250]
120：核酸提取容器；124：第一流路；126：第二流路；
[0251]
128：第三流路；130：过滤器部；130a：生物材料收集区域；
[0252]
130b：试样透过区域；132：过滤器；140：试样注入口；
[0253]
146：试样排出口：148：空气连通口；160：核酸提取容器；
[0254]
164：流路；166：过滤器部；166a：生物材料收集区域；
[0255]
166b：试样透过区域；168：过滤器；174：试样注入口；
[0256]
176：试样排出口；178：空气连通口。
[0257]
(序列表纯文本)
[0258]
序列号1：虹鳟鱼正向pcr引物
[0259]
序列号2：虹鳟鱼反向pcr引物
[0260]
序列号3：虹鳟鱼取样针
[0261]
序列号4：鲤鱼正向pcr引物
[0262]
序列号5：鲤鱼反向pcr引物
[0263]
序列号6：鲤鱼取样针
[0264]
序列号7：鲣鱼正向pcr引物
[0265]
序列号8：鲣鱼反向pcr引物
[0266]
序列号9：鲣鱼取样针。