包含促红细胞生成素多肽的融合蛋白的制作方法

1.本发明涉及包含与来自狗或猫的igg的fc区融合的促红细胞生成素(erythropoietin，红细胞生成素)多肽的融合蛋白。


背景技术：

2.促红细胞生成素(以下，也简称为epo)作为分子量为30,000～34,000的糖蛋白，是促进红细胞的生成和分化的因子。其在肾脏中生成，对于调节循环内的红细胞水平是必不可少的。该蛋白与红细胞前体细胞的受体结合而起作用，引起细胞内钙离子浓度的增加、dna生物合成的增加和血红蛋白生成刺激等。促红细胞生成素可用于治疗造血疾病或造血功能障碍，但存在血中半衰期短的缺点。
3.另一方面，已知免疫球蛋白恒定部分与非免疫球蛋白的融合会显著延长上述非免疫球蛋白的半衰期，因此进行了使免疫球蛋白片段与促红细胞生成素多肽结合的探讨。例如，专利文献1中记载了包含免疫球蛋白的fc部和促红细胞生成素多肽的融合蛋白的产生及其使用。实际上，据报道，包含免疫球蛋白的fc部和促红细胞生成素多肽的融合蛋白在体内延长了促红细胞生成素多肽的半衰期。
4.新生儿fc受体(neonatal fc receptor；以下也称为fcrn)与igg的fc区结合而在血浆中再循环，从而避免igg被溶酶体降解。igg通过与fcrn结合而具有较长的血浆中滞留性。igg与fcrn的结合仅在酸性条件下(例如，ph6.0)观察到，在中性条件下(例如，ph7.4)几乎观察不到结合。通常，igg经由胞吞作用(endocytosis)被非特异性地摄入细胞内，但在内体(endosome，核内体)内的酸性条件下通过与内体内的fcrn结合而返回细胞表面，在血浆中的中性条件下通过从fcrn解离而再循环，结果是，比其他的血浆中蛋白具有更长的血浆中滞留性。在内体内未与fcrn结合的igg进入溶酶体内，在此被降解。
5.作为改善igg的血浆中滞留性的方法，在人中报道了提高酸性条件下的与fcrn的结合能力的方法。通过向igg的fc区导入氨基酸取代以提高酸性条件下的与fcrn的结合能力，从内体内到血浆中的再循环效率提高，其结果，血浆中滞留性得以改善(专利文献2、3、非专利文献1～3)。
6.另外，融合了igg的fc区的细胞因子和可溶性膜受体等(fc融合蛋白)被开发作为人用的治疗用药物，但它们与igg同样地经由与fcrn的结合而实现较长的血浆中滞留性。
7.如上所述，在人中开发了改变(修饰)/应用了igg的fc区与fcrn的结合的生物药物，在狗、猫等除人以外的动物中也希望开发以同样的方式改善了血浆中滞留性的生物药物。
8.然而，关于改善、提高狗、猫中的抗体的血浆中滞留性的fc区的氨基酸改变尚属未知。
9.现有技术文献专利文献专利文献1：wo99/02709公报；
专利文献2：wo2002/060919公报；专利文献3：wo2012/083370公报；非专利文献非专利文献1：yeung ya等人, j. immunol. (2009) 182, 7663-71；非专利文献2：datta-mannan a等人, j. biol. chem. (2007) 282, 1709-17；非专利文献3：dall’acqua wf等人, j. immunol. (2002) 169, 5171-80。


技术实现要素：

10.发明所要解决的课题本发明的目的在于：以高收率/高收量获取物性和活性及血浆中滞留性更优异的、包含与igg的fc区融合的促红细胞生成素多肽的融合蛋白(以下，也简称为epo-fc融合蛋白)。
11.用于解决课题的手段为了解决上述课题，本发明人在epo-fc融合蛋白的epo部分、fc区、以及在epo部分与fc区之间存在铰链区的情况下，对其铰链区进行各种氨基酸改变，研究了其效果。结果发现了：通过对epo区和铰链区施加特定的突变，得到了物性和活性及收率/收量更优异的epo-fc融合蛋白。进一步发现了：通过使用在酸性条件下与fcrn的结合能力提高、血浆中滞留性得到改善、且在特定位点具有氨基酸改变的fc区(所谓fc区变体)作为fc，得到了除物性和活性及收率/收量以外血浆中滞留性也更优异的epo-fc融合蛋白，从而完成了本发明。
12.即，本发明如下。
13.[1] 融合蛋白，其包含与来自狗或猫的igg的fc区融合的促红细胞生成素多肽。
[0014]
[2] 上述[1]所述的融合蛋白，其中，促红细胞生成素多肽与fc区的融合经由igg的铰链区。
[0015]
[3] 上述[1]或[2]所述的融合蛋白，其中，该促红细胞生成素多肽具有至少1个突变，该突变是其野生型序列中的至少1个半胱氨酸被精氨酸或脯氨酸取代。
[0016]
[4] 上述[3]所述的融合蛋白，其中，具有至少1个突变的促红细胞生成素多肽来自猫、且具有seq id no: 9或10所表示的氨基酸序列。
[0017]
[5] 上述[2]～[4]中任一项所述的融合蛋白，其中，该铰链区具有至少1个突变，该突变是其野生型序列中的至少1个半胱氨酸被甘氨酸取代。
[0018]
[6] 上述[5]所述的融合蛋白，其中，具有至少1个突变的铰链区来自猫、且具有seq id no: 5～8中的任一条所表示的氨基酸序列。
[0019]
[7] 上述[1]～[6]中任一项所述的融合蛋白，其中，在该fc区具有氨基酸改变。
[0020]
[8] 上述[7]所述的融合蛋白，其中，该fc区来自狗igg。
[0021]
[9] 上述[7]所述的融合蛋白，其中，该fc区来自猫igg。
[0022]
[10] 上述[8]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变包含选自下述(i)～(x)的至少1个(这里，fc区中的氨基酸的编号是基于以人抗体的fc区为基准的kabat的eu索引)：(i) 第252位的亮氨酸被酪氨酸或苏氨酸取代；(ii) 第254位的丙氨酸被苏氨酸取代；
(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代；(iv) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸取代；(v) 第428位的蛋氨酸被亮氨酸取代；(vi) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代；(vii) 第434位的天冬酰胺被丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代；(viii) 第436位的酪氨酸被苏氨酸取代；(ix) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(x) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0023]
[11] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第434位的天冬酰胺被丙氨酸取代；(ii) 第436位的酪氨酸被苏氨酸取代；(iii) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(iv) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0024]
[12] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第428位的蛋氨酸被亮氨酸取代；(ii) 第434位的天冬酰胺被丙氨酸取代；(iii) 第436位的酪氨酸被苏氨酸取代；(iv) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(v) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0025]
[13] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第428位的蛋氨酸被亮氨酸取代；(ii) 第434位的天冬酰胺被丙氨酸取代；(iii) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(iv) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0026]
[14] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第252位的亮氨酸被酪氨酸取代；(ii) 第254位的丙氨酸被苏氨酸取代；以及(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代。
[0027]
[15] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第428位的蛋氨酸被亮氨酸取代；以及(ii) 第434位的天冬酰胺被丝氨酸取代。
[0028]
[16] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸取代；以及(ii) 第434位的天冬酰胺被酪氨酸取代。
[0029]
[17] 上述[10]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第252位的亮氨酸被苏氨酸取代；(ii) 第254位的丙氨酸被苏氨酸取代；(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代；(iv) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代；以及
(v) 第434位的天冬酰胺被苯丙氨酸取代。
[0030]
[18] 上述[9]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变包含选自下述(i)～(xiv)的至少1个(这里，fc区中的氨基酸的编号基于以人抗体的fc区为基准的kabat的eu索引)：(i) 第252位的丝氨酸被酪氨酸或苏氨酸取代；(ii) 第254位的丝氨酸被苏氨酸取代；(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代；(iv) 第259位的缬氨酸被异亮氨酸取代；(v) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸或苯丙氨酸取代；(vi) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代；(vii) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代；(viii) 第434位的丝氨酸被丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代；(ix) 第436位的组氨酸被苏氨酸取代；(x) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；(xi) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代；(xii) 第235位的亮氨酸被精氨酸取代；(xiii) 第236位的甘氨酸被精氨酸取代；以及(xiv) 第239位的丝氨酸被赖氨酸取代。
[0031]
[19] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第434位的丝氨酸被丙氨酸取代；(ii) 第436位的组氨酸被苏氨酸取代；(iii) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(iv) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0032]
[20] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代；(ii) 第434位的丝氨酸被丙氨酸取代；(iii) 第436位的组氨酸被苏氨酸取代；(iv) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(v) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0033]
[21] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代；(ii) 第434位的丝氨酸被丙氨酸取代；(iii) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；以及(iv) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代。
[0034]
[22] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第252位的丝氨酸被酪氨酸取代；(ii) 第254位的丝氨酸被苏氨酸取代；以及(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代。
[0035]
[23] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：
(i) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸取代；以及(ii) 第434位的丝氨酸被酪氨酸取代。
[0036]
[24] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第259位的缬氨酸被异亮氨酸取代；(ii) 第308位的异亮氨酸被苯丙氨酸取代；以及(iii) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代。
[0037]
[25] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(i) 第252位的丝氨酸被苏氨酸取代；(ii) 第254位的丝氨酸被苏氨酸取代；(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代；(iv) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代；以及(v) 第434位的丝氨酸被苯丙氨酸取代。
[0038]
[26] 上述[18]所述的融合蛋白，其中，该fc区的氨基酸改变是：(vi) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代；(viii) 第434位的丝氨酸被丙氨酸取代；(x) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代；(xi) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代；(xii) 第235位的亮氨酸被精氨酸取代；(xiii) 第236位的甘氨酸被精氨酸取代；以及(xiv) 第239位的丝氨酸被赖氨酸取代。
[0039]
[27] 上述[7]所述的融合蛋白，其中，具有该氨基酸改变的igg的fc区来自猫、且具有seq id no: 3或4所表示的氨基酸序列。
[0040]
[28] 药物组合物，其包含上述[1]～[27]中任一项所述的融合蛋白。
[0041]
[29] 上述[28]所述的药物组合物，该药物组合物用于治疗造血疾病或造血功能障碍。
[0042]
发明效果本发明的epo-fc融合蛋白的物性和活性优异。根据本发明，能够以高收率/高收量获取该epo-fc融合蛋白。
附图说明
[0043]
[图1] 图1是显示pcag的结构的质粒图。
[0044]
[图2] 图2是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白的基于蛋白质印迹的分析结果的图。
[0045]
[图3] 图3是在还原和非还原下通过sds-page和cbb染色确认猫epo-fc的分子间的二硫键的有无的图。
[0046]
[图4a] 图4a是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白(表8的1～3)的sec分析色谱图的图。右侧的图是左侧的图的放大图。
[0047]
[图4b] 图4b是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白(表8的4～6)的sec分析色谱图的图。右侧的图是左侧的图的放大图。
[0048]
[图4c] 图4c是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白(表8的7～9)的sec分析色谱图的图。右侧的图是左侧的图的放大图。
[0049]
[图4d] 图4d是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白(表8的10～12)的sec分析色谱图的图。右侧的图是左侧的图的放大图。
[0050]
[图4e] 图4e是显示epo区、铰链区改变型猫epo-fc融合蛋白(表8的13～15)的sec分析色谱图的图。右侧的图是左侧的图的放大图。
[0051]
[图4f] 图4f是显示合并作为猫epo-fc融合蛋白的wt catepo-c2-fc、c59p catepo-c2-fc和c165r catepo-c2-fc (表8的1～3)的sec分析结果的色谱图的图。
[0052]
[图5] 图5是显示以tf-1细胞的增殖为指标的猫epo-fc融合蛋白的生物活性评价的结果的曲线图。
[0053]
[图6a] 图6a是显示已纯化的猫epo-fc融合蛋白的sds-page分析结果的图。
[0054]
[图6b] 图6b显示已纯化的猫epo-fc融合蛋白的sec分析结果(下段)。将sec分析色谱图(上段)数值化。
[0055]
[图7] 图7是显示以tf-1细胞的增殖为指标的fc改变型猫epo-fc融合蛋白的体外活性的评价结果的曲线图。
[0056]
[图8] 图8是显示以baf3/小鼠epor细胞的增殖为指标的猫epo-fc融合蛋白的体外活性的评价结果的曲线图。
[0057]
[图9] 图9是显示以baf3/猫epor细胞的增殖为指标的猫epo-fc融合蛋白的体外活性的评价结果的曲线图。
具体实施方式
[0058]
本发明提供包含与来自哺乳动物的igg的fc区结合的epo多肽的融合蛋白(以下，也称为epo-fc融合蛋白)。以下，对本发明的epo-fc融合蛋白进行详细说明。
[0059]
1. epo-fc融合蛋白本说明书中，“epo-fc融合蛋白”是指包含来自狗或猫的igg的fc区和促红细胞生成素多肽的蛋白。在本发明的优选方案中，epo-fc融合蛋白形成同源二聚体，因此通常具有1个或2个以上的二硫键。
[0060]
fc区与epo多肽的结合方式只要是两者功能性地连接即可，没有特别限定。作为一个实施方案，epo多肽经由共价键直接与fc区连接。作为另一个实施方案，epo多肽间接地与fc区连接。例如，在epo-fc融合蛋白中，在fc区与促红细胞生成素多肽之间可包含接头。
[0061]
2. fc区本发明中，“fc区”包含来自狗或猫的igg、优选来自猫的igg的恒定区的结构域，其包括恒定区的片段、变体。
[0062]
igg中存在同种型，其数量根据动物种类而不同。在人、小鼠或大鼠中已知有igg1～igg4这4种。在狗中也存在4种igg免疫球蛋白，将它们定义为caigg-a、caigg-b、caigg-c和caigg-d (tang等人, vet. immunol. immunopathol. 80 (3-4), 259-270, 2001)。在猫中存在3种igg免疫球蛋白，它们被报道作为igg1a、igg1b、igg2而存在。
[0063]
1) kanai, t.h.等人, 2000. identification of two allelic igg1 c(h) coding regions (cgamma1) of cat. vet. immunol. immunopathol. 73(1), 53-62；
2) strietzel,c.j.等人, 2014. in vitro functional characterization of feline iggs, vet. immunol. immunopathol. 158(3-4), 214-233。
[0064]
免疫球蛋白的恒定区被定义为与免疫球蛋白c-末端区相同的天然或通过合成而生成的多肽，其可单独地或以任何组合包含ch1结构域、铰链、ch2结构域、ch3结构域或ch4结构域。重链的fc区由ch2结构域和ch3结构域构成。铰链区位于ch1结构域与ch2结构域之间。
[0065]
本发明中，狗或猫igg的fc区优选可以是向狗或猫的野生型igg的fc区中导入了氨基酸改变的fc区变体。更优选地是在酸性条件下与狗或猫fcrn结合的活性(以下，也称为fcrn结合活性)高于改变前的亲本肽的fcrn结合活性、且包含至少1个氨基酸改变的fc区变体。
[0066]“fcrn”在结构上与主要组织相容性复合物(mhc)类别i的多肽在结构上类似，在人中与类别i的mhc分子具有22～29%的序列同一性(人的参考文献：ghetie等人, immunol. today (1997) 18(12), 592-598)。
[0067]
fcrn作为由可溶性β链(或轻链)即β2-微球蛋白(有时记作β2m)和跨膜α链(或重链、有时记作fcgrt)构成的异源二聚体来表达。fcrn的α链由3个胞外结构域(α1、α2、α3)构成，α1和α2结构域与抗体的fc区中的fcrn结合结构域相互作用(raghavan等人, immunity (1994) 1, 303-315)。
[0068]
fcrn在生物体内与β2-微球蛋白形成复合物。可溶型fcrn与β2-微球蛋白的复合物可利用通常的重组表达方法(参照实施例的“fcrn表达载体的制作”、“fcrn蛋白的表达和纯化”项)来调制，可将该复合物用于本发明的fcrn结合活性的评价。本发明中，在没有特别记载的情况下，fcrn作为与β2-微球蛋白的复合物来使用。
[0069]“亲本多肽”是指，相对于导入了氨基酸改变的多肽而言，导入该改变之前的多肽。作为包含狗或猫igg的fc区的亲本多肽，可列举：包含狗或猫的天然igg的fc区的多肽，优选地，可列举：抗体、特别是构成狗或猫的天然igg的多肽。将具有在亲本多肽的fc区导入了氨基酸改变的fc区的多肽也称为fc区变体。
[0070]
狗或猫的野生型igg是指包含与天然存在的狗或猫的igg相同的氨基酸序列、且属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体的类别的多肽。
[0071]
作为fc区中的氨基酸的改变的例子，包括氨基酸的取代、插入、缺失等，优选为氨基酸的取代。对被改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以是仅1处(部位)的氨基酸被改变，也可以是2处以上的氨基酸被改变。优选2处～多处、更优选2处～5处左右的氨基酸被改变。
[0072]
在狗或猫的情况下，优选下述的改变。
[0073]
尚需说明的是，本说明书中，表示到取代部位的氨基酸残基数的数字左侧所表示的字母显示取代前的氨基酸的单字母符号，右侧所表示的字母显示取代后的氨基酸的单字母符号。到取代部位的氨基酸残基数是使人igg的fc区的kabat的eu编号系统与狗或猫的fc区对应。“eu编号系统”或“eu索引”通常是在参照抗体重链恒定区的残基的情况下使用(例如，kabat等人, sequences of proteins of immunological interest. 第5版. public health service, national institutes of health, bethesda, md. (1991))。“kabat的eu编号系统”是指人igg1 eu抗体的残基编号。本说明书中，只要没有特别说明，则关于残基
编号的阐述是使kabat的eu编号与狗或猫的序列对应。
[0074]
(狗的情况)(i) 第252位的亮氨酸被酪氨酸或苏氨酸取代(l252y或l252t)；(ii) 第254位的丙氨酸被苏氨酸取代(a254t)；(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代(t256e)；(iv) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸取代(i308p)；(v) 第428位的蛋氨酸被亮氨酸取代(m428l)；(vi) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代(h433l)；(vii) 第434位的天冬酰胺被丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代(n434a、n434s、n434y或n434f)；(viii) 第436位的酪氨酸被苏氨酸取代(y436t)；(ix) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代(q438r)；以及(x) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代(s440e)。
[0075]
具有至少1个、优选2个以上的该改变。
[0076]
作为优选的改变的例子，可列举：以下的dfv-1～dfv-6、dfv-8。
[0077]
dfv-1：n434a、y436t、q438r、s440e；dfv-2：m428l、n434a、y436t、q438r、s440e；dfv-3：m428l、n434a、q438r、s440e；dfv-4：l252y、a254t、t256e；dfv-5：m428l、n434s；dfv-6：i308p、n434y；dfv-8：l252t、a254t、t256e、h433l、n434f。
[0078]
(猫的情况)(i) 第252位的丝氨酸被酪氨酸或苏氨酸取代(s252y或s252t)；(ii) 第254位的丝氨酸被苏氨酸取代(s254t)；(iii) 第256位的苏氨酸被谷氨酸取代(t256e)；(iv) 第259位的缬氨酸被异亮氨酸取代(v259i)；(v) 第308位的异亮氨酸被脯氨酸或苯丙氨酸取代(i308p或i308f)；(vi) 第428位的丝氨酸被亮氨酸取代(s428l)；(vii) 第433位的组氨酸被亮氨酸取代(h433l)；(viii) 第434位的丝氨酸被丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代(s434a、s434y或s434f)；(ix) 第436位的组氨酸被苏氨酸取代(h436t)；(x) 第438位的谷氨酰胺被精氨酸取代(q438r)；以及(xi) 第440位的丝氨酸被谷氨酸取代(s440e)；(xii) 第235位的亮氨酸被精氨酸取代(l235r)；(xiii) 第236位的甘氨酸被精氨酸取代(g236r)；以及(xiv) 第239位的丝氨酸被赖氨酸取代(s239k)。
[0079]
具有至少1个、优选2个以上的该改变。
[0080]
作为优选的改变例，可列举：以下的cfv-1～cfv-4、cfv-6～dfv-8和sicfv3。
[0081]
cfv-1：s434a、h436t、q438r、s440e；cfv-2：s428l、s434a、h436t、q438r、s440e；cfv-3：s428l、s434a、q438r、s440e；cfv-4：s252y、s254t、t256e；cfv-6：i308p、s434y；cfv-7：v259i、i308f、s428l；cfv-8：s252t、s254t、t256e、h433l、s434f；sicfv-3：l235r、g236r、s239k、s428l、s434a、q438r、s440e。
[0082]
在使人eu编号与狗或猫的序列对应的情况下、以及在将狗或猫的fc区的起始氨基酸设为1的情况下，关于各改变汇总于表1。
[0083]
[表1]在本发明的epo-fc融合蛋白来自猫的情况下，作为所使用的fc区，可优选列举：
seq id no: 3所示的cfv-3和seq id no: 4所示的sicfv-3。
[0084]
本发明中使用的包含igg的fc区的多肽除了施行与epo部的结合以外，例如还可施行：用于增强adcc (抗体依赖性细胞毒)活性或cdc (补体依赖性细胞毒)活性的改变、用于提高蛋白酶抵抗性的改变、用于减少效应子功能的改变、减少对补体的结合活性的改变、用于提高抗体的异质性或稳定性的改变、用于促进抗原消失的改变、用于与多个分子的抗原反复结合的改变、用于以提高血中滞留性为目的而降低恒定区的pi的改变、用于持有对其他抗原的结合能力的改变等。更详细而言，可参照current pharmaceutical biotechnology, 2016, 17, 1298-1314中记载的fc工程技术。需要说明的是，该文献中的关于残基编号的阐述基于kabat的eu编号系统。这些改变的种类例如可以是氨基酸的取代、缺失、添加、插入、修饰中的任一种、或它们的组合，优选为氨基酸的取代。
[0085]
向氨基酸序列中导入这样的氨基酸的改变(缺失、取代、插入、添加)可通过对编码其氨基酸序列的核苷酸序列进行部分改变来导入。该核苷酸序列的部分改变可适当采用已知的位点特异性突变导入法(site specific mutagenesis，位点特异性诱变法) (proc natl acsd sci usa., 1984, 第81卷, 5662-5666; sambrook等人, molecular cloning a laboratory manual (1989), 第2版, cold spring harbor laboratory press)或重叠延伸pcr等已知方法。另外，作为改变成除天然氨基酸以外的氨基酸的方法，也可采用多个已知方法(annu. rev. biophys. biomol. struct. (2006) 35, 225-249、proc. natl. acad. sci. u.s.a. (2003) 100(11), 6353-6357)。例如，适合使用在作为终止密码子之一的uag密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因trna中包含结合有非天然氨基酸的trna的无细胞翻译系统(clover direct (protein express))等。
[0086]
另外，可参照下述文献中实施的改变人igg1的fc区的方法。
[0087]
drug metab dispos. 2007 jan; 35(1): 86-94；int immunol. 2006 dec; 18(12): 1759-69；j biol chem. 2001 mar 2; 276(9): 6591-604；j biol chem. 2007; 282(3): 1709-17；j immunol. 2002; 169(9): 5171-80；j immunol. 2009; 182(12): 7663-71；molecular cell, 第7卷, 867-877, april, 2001；nat biotechnol. 1997 jul; 15(7): 637-40；nat biotechnol. 2005 oct; 23(10): 1283-8；proc natl acad sci u s a. 2006 dec 5; 103(49): 18709-14；ep2154157、us20070141052、wo2000/042072、wo2002/060919、wo2006/020114、wo2006/031370、wo2010/033279、wo2006/053301、wo2009/086320。
[0088]
本发明中使用的fc区变体具有fcrn结合活性，特别是与改变前的fc区的活性相比显示高fcrn结合活性、特别是在酸性条件下显示高fcrn结合活性。
[0089]
本发明中，“具有活性”是指在可测定其活性的系统中测定值高于其系统中的背景值(或者测定阴性对照时的值)。例如，具有结合活性是指在elisa或facs、biacore等可测定结合活性的系统中测定值高于背景值。本发明中，测定值相对于背景值的高度优选为2倍以上、更优选为3倍以上、进一步优选为5倍以上、特别优选为10倍以上。
[0090]
例如，本发明中，可使用kd (解离常数)的倒数作为fcrn结合活性的值。本发明中使用的fc区变体的kd值的测定例如可利用biacore (ge healthcare)的已知方法进行。具体而言，在biacore的情况下，将本发明提供的fc区变体或包含该变体的抗体分子固定在传感芯片上，使fcrn作为分析物流经于此，从而可测定kd值。通过在野生型igg的fc区(野生型fc)和突变型igg的fc区(fc区变体)以及ph酸性范围的条件下和ph中性的条件下进行测定，可算出kd (fc区变体)/kd (野生型fc)和kd (ph酸性)/kd (ph中性)的值。
[0091]
也可使用kd (dissociation rate constant：解离速度常数)来代替kd。
[0092]
本说明书中，与狗或猫fcrn结合的活性高于改变前的亲本多肽是指，例如，与狗或猫fcrn结合的活性为亲本多肽的105%以上、优选为110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、特别优选为130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上。
[0093]
如果可对本发明的fc区变体赋予在ph酸性范围条件下与狗或猫fcrn结合的活性强于天然的狗或猫igg这样的性质，而且如果可使用该fc区变体来构成igg，则会使酸性条件下的igg与fcrn的结合上升，从而从内体内向血浆中的再循环效率上升，其结果，可改善或提高血浆中滞留性。
[0094]
本发明中，ph酸性范围条件下的对狗或猫fcrn的结合活性是指ph4.0～ph6.5下的fcrn结合活性。优选是指ph5.0～ph6.5下的fcrn结合活性，进一步优选是指ph5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5中的任一值下的狗或猫fcrn结合活性，特别优选是指接近于生物体内的早期内体内的ph的ph5.8～ph6.0下的fcrn结合活性。另外，本发明中，ph中性范围条件下的对狗或猫fcrn的结合活性是指ph6.7～ph10.0下的fcrn结合活性。优选地，是指ph7.0～ph9.0下的fcrn结合活性，进一步优选地，是指ph7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0中的任一值下的fcrn结合活性，特别优选地，是指在接近于生物体内的血浆中的ph的ph7.4下的fcrn结合活性。
[0095]
由于与fcrn的结合亲和性在ph7.4下非常低，所以在难以准确地测定其亲和性的情况下，可采用ph7.0来代替ph7.4。作为在测定条件下采用的温度，可在10℃～50℃的任意温度下测定与fcrn的结合亲和性。优选地，为了确定与fcrn的结合亲和性，采用15℃～40℃的温度。没有特别限定，温度25℃是优选方案之一。
[0096]
3. 铰链区铰链区通常位于重链恒定区的ch1结构域的c-末端。在igg同工型中，二硫键典型的是在该铰链区中产生。在本发明的epo-fc融合蛋白中，epo多肽与fc区的结合可经由该铰链区，也可不经由该铰链区而直接连接。铰链区可来自各免疫球蛋白类别。猫igg的铰链区有3个半胱氨酸，狗igg的铰链区有3个半胱氨酸，其中至少1个与免疫球蛋白的重链间的二硫键相关。因此，本发明的优选的铰链区来自igg。作为一个实施方案，igg的铰链区内的第一半胱氨酸优选地被其他氨基酸、优选被甘氨酸取代。作为另一个实施方案，可列举：除从第一半胱氨酸取代成甘氨酸以外，第二或第三半胱氨酸也被甘氨酸取代，作为又一个实施方案，可列举：除从第一半胱氨酸取代成甘氨酸以外，第二和第三半胱氨酸也被甘氨酸取代。
[0097]
在fc区来自狗igg的情况下，优选使用来自狗igg的铰链区，在fc区来自猫igg的情况下，优选使用来自猫igg的铰链区。作为来自猫igg的铰链区，可列举：具有seq id no: 5～8中的任一条所表示的氨基酸序列的铰链区。
[0098]
在本发明的epo-fc融合蛋白来自猫的情况下，作为所使用的铰链区的序列，可列举：seq id no: 5～8中的任一条所示的序列。
[0099]
4. 促红细胞生成素多肽(epo多肽)本发明中，epo多肽除了包含来自任意的动物种类、优选哺乳动物、更优选狗或猫、特别优选猫的野生型或天然的促红细胞生成素、重组促红细胞生成素以外，还包含促红细胞生成素样分子，该促红细胞生成素样分子包含具有生物学活性的促红细胞生成素片段、促红细胞生成素的变体。
[0100]
在fc区来自狗igg的情况下，优选使用来自狗的epo多肽，在fc区来自猫igg的情况下，优选使用来自猫的epo多肽。作为来自猫的epo多肽，可列举：具有seq id no: 9或10所表示的氨基酸序列的epo多肽。
[0101]
野生型或天然的促红细胞生成素是刺激来自促红细胞生成素前体细胞的红细胞的增殖和发育的糖蛋白激素。野生型或天然的促红细胞生成素通常可从血液或血浆、或者从尿中分离和纯化。
[0102]
通过重组或以化学方式合成的促红细胞生成素可采用本领域技术人员所已知的技术来生成。
[0103]
本说明书中，促红细胞生成素的活性(特别是生物学活性)被定义为刺激由与促红细胞生成素受体的相互作用介导的细胞增殖的能力。促红细胞生成素的功能测定可在体外或体内进行。例如，促红细胞生成素的体外活性可在使用细胞的测定中进行试验。具体而言，促红细胞生成素活性可通过使用了表达epo受体的tf-1细胞的细胞增殖测定来评价。体内活性例如可列举：使用了动物模型的血细胞比容(hct)测定或网状红细胞测定等。
[0104]
本发明中可使用的促红细胞生成素样分子只要与野生型或天然的促红细胞生成素具有同等的生物学活性或功能活性即可，对其氨基酸序列没有特别限定，通常与野生型或天然的促红细胞生成素的对应的序列具有至少约55%、约65%、约75%、典型的是至少约80%、约85%、约90%、以及最典型的是约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%的序列同一性。
[0105]
本发明的促红细胞生成素被理解为特别包含具有与野生型促红细胞生成素的序列类似的氨基酸序列的促红细胞生成素多肽。例如，只要维持其生物学活性或功能活性即可，可在野生型促红细胞生成素的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸的改变。这样的氨基酸改变的例子包括氨基酸残基的添加、缺失或取代。
[0106]
在本发明的epo-fc融合蛋白来自猫的情况下，作为所使用的epo多肽的序列，可列举：seq id no: 9或10的任一条所示的序列。
[0107]
向促红细胞生成素中导入突变的方法在该技术领域中为人所熟知。例如突变可利用定点突变导入技术来导入。可利用广泛的位点特异性突变导入技术。
[0108]
5. 接头本发明的epo-fc融合蛋白可在fc部分与促红细胞生成素部分之间包含接头分子、优选肽接头。伴有接头的融合蛋白可具有增加了的生物学活性这样的已改善的特性。接头
通常包含1～25个氨基酸(例如，5～25个或10～20个氨基酸)。
[0109]
6. epo-fc融合蛋白的体外活性和体内效能epo-fc融合蛋白的体外活性可通过使用了细胞的测定来进行试验。特别是，epo-fc融合蛋白与epo受体(以下，也简称为epor)之间的相互作用可通过tf-1细胞增殖测定来评价。
[0110]
epo-fc融合蛋白的体内生物学活性例如可通过在小鼠和大鼠等动物模型中进行的测定来测定。体内测定的例子包括血细胞比容(hct)测定和网状红细胞测定，但并不限于这些。
[0111]
7. epo-fc融合蛋白的合成本发明中，可提供编码本发明的epo-fc融合蛋白的多核苷酸。多核苷酸主要由dna、rna、其他核酸类似物等构成。构建编码本发明的epo-fc融合蛋白的多核苷酸，插入至适当的表达载体(根据需要可使用2种表达载体)。此时，插入至表达载体使在表达调控区、例如增强子、启动子的调控下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可使用适当的宿主与表达载体的组合。
[0112]
作为可使用的载体，只要是稳定地保持所插入的基因的载体即可，对种类没有特别限定，可利用市售的各种载体。作为基因克隆用载体，例如可列举：m13系载体、puc系载体等。在为了生产本发明提供的epo-fc融合蛋白而使用载体的情况下，表达载体特别有效。作为表达载体，只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，没有特别限定。例如，作为试管内表达用载体，例如可列举：pbest载体(promega公司制造)等，作为大肠杆菌表达用载体，例如可列举：pgex、pet、pbluescript载体(stratagene公司制造)等，作为培养细胞表达用载体，例如可列举：pme18s-fl3载体(genbank登录号ab009864)等，作为动物细胞表达用载体，可列举：pcdna，作为生物个体内表达用载体，例如可列举：pme18s载体(mol cell biol. 8: 466-472 (1988))等。向载体中插入本发明的多核苷酸例如可使用in-fusion advantage pcr克隆试剂盒(clontech公司制造)来进行。
[0113]
对可使用的宿主细胞没有特别限定，例如可适当使用大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞例如可用作用于制造或表达本发明的epo-fc融合蛋白的产生系统。产生系统包括体外和体内的产生系统。作为体外的产生系统，可列举：使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的产生系统。
[0114]
作为可用作宿主细胞的真核细胞，例如可列举：动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，可示例：哺乳类细胞、例如cho (j. exp. med. (1995) 108: 94.0)、cos、hek293、3t3、骨髓瘤、bhk (幼仓鼠肾)、hela、vero等；两栖类细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞(valle等人, nature (1981) 291: 338-340)；以及昆虫细胞、例如sf9、sf21、tn5。优选使用cho-dg44、cho-dx11b、cos7、hek293、bhk。在以大量表达为目的的情况下，特别优选cho。向宿主细胞内导入载体例如可采用：磷酸钙法、deae葡聚糖法、使用了阳离子脂质体dotap (boehringer mannheim制造)的方法、电穿孔法、脂质转染法、微量注射法等本领域技术人员已知的方法。另外，也可使用freestyle 293表达系统(invitrogen公司制造)，从基因导入进行到多肽的表达。
[0115]
所得到的epo-fc融合蛋白可从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离，以实质上纯粹且均匀的分子的形式纯化。epo-fc融合蛋白的分离、纯化可采用普通多肽的纯化
中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。例如，可适当选择柱色谱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析、重结晶等并组合进行分离、纯化。
[0116]
8. 药物组合物本发明还提供药物组合物，其含有按照本发明制作的epo-fc融合蛋白。药物组合物可用于治疗疾病，例如本发明提供的药物组合物可用于刺激红细胞形成、以及用于预防和治疗贫血。本说明书中，“治疗”是指得到药理学和/或生理学的效果。关于效果，在完全或部分性地妨碍疾病的症状方面可为预防效果，在完全或部分性地治疗疾病的症状方面可为治疗效果。本说明书中的“治疗”包括哺乳动物、特别是狗或猫、或与它们近缘的动物种类中的所有疾病的治疗。
[0117]
本发明提供的药物组合物可按照本领域技术人员已知的方法制成制剂(例如，remington’s pharmaceutical science, 最新版, mark publishing company, easton, usa)。通常包含该领域惯用的、为了治疗、诊断或预防目的而适合给予至对象的药学上可接受的添加成分。例如，在以固体形式制成制剂的情况下，例如可使用乳糖等填充剂、羧甲基纤维素、明胶等粘合剂、着色剂、包衣剂等，这种制剂适合口服给药。另外，例如也可加入白色凡士林、纤维素衍生物、表面活性剂、聚乙二醇、有机硅、橄榄油等作为载体或赋形剂，以霜剂、乳液、洗液等形态作为外用药涂抹在患处而进行使用。另外，在以液体形式制成制剂的情况下，可包含常用的生理学上可接受的溶剂和乳化剂、稳定剂。作为溶剂，可列举：水、pbs、等渗生理盐水等，作为乳化剂，可示例：聚氧乙烯系表面活性剂、脂肪酸系表面活性剂、有机硅等，作为稳定剂，可列举：狗血清白蛋白、明胶等多元醇、或山梨糖醇、海藻糖等糖类等。用于口服给药的组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、含嗽液或粉末。
[0118]
对本发明的药物组合物的给药方法没有特别限定，通过注射给药最可期待治疗效果。作为注射给药方法，也不限于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、腹腔内给药、胸腔内给药的任何方法。
[0119]
给药量要根据使用的epo-fc融合蛋白的种类或个体的大小、给药方法、疾病的种类、症状等来确定，只要给予足以显示治疗效果和预防效果的量即可。
[0120]
本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照纳入本说明书。
实施例
[0121]
接下来，列举参考例、试验例和实施例，以进一步说明本发明，但本发明并不限于这些。
[0122]
参考例1. 具有野生型fc的igg表达载体的制作登录在genbank:af354265.1的野生型狗igg h链的fc区(seq id no: 1、以下也简称为狗野生型fc、dog wtfc。)和登录在genbank: ab016710.1的野生型猫igg h链的fc区(seq id no: 2、以下也简称为猫野生型fc、cat wtfc。)根据氨基酸序列委托genscript japan株式会社进行基因合成。
[0123]
igg h链的fd～铰链的区域(seq id no: 18、以下记作fd-铰链)和igg l链的整个区域(seq id no: 19、以下记作l链)是根据登录在imgt (参照地点url http://
www.imgt.org/)的imgt/mab-db id:77的人源化抗人ige抗体即奥马珠单抗(omalizumab)的氨基酸序列，委托genscript japan株式会社进行基因合成，使作为分泌信号肽在fd-铰链的n末端侧赋予由mefglswvflvalfrgvqc (seq id no: 20)构成的氨基酸、在l链的n末端侧赋予由mdmrvpaqllgllllwlsgarc (seq id no: 21)构成的氨基酸。
[0124]
包含所合成的分泌信号肽的奥马珠单抗的fd-铰链基因通过pcr法扩增，使用in-fusion hd克隆试剂盒(clontech公司制造) (以下，记作in-fusion试剂盒)与同样通过pcr法扩增的dog wtfc基因和cat wtfc基因分别连接，使fd-铰链成为n末端侧、wtfc成为c末端侧，同时，插入至pcdna3.1( ) (invitrogen)的cmv启动子的正下方，之后转化大肠杆菌dh5α并提取质粒，从而得到了h链表达用载体pcdna3.1( )/奥马珠单抗fd-dog wtfc和pcdna3.1( )/奥马珠单抗fd-cat wtfc。
[0125]
包含所合成的分泌信号肽的奥马珠单抗的l链基因通过pcr法扩增，使用in-fusion试剂盒插入至pcdna3.1( ) (invitrogen)的cmv启动子的正下方，之后转化大肠杆菌dh5α并提取质粒，从而得到了l链表达用载体pcdna3.1( )/奥马珠单抗lch。
[0126]
在任何情况下使用in-fusion试剂盒时，均按照所附说明书记载的方法，在in-fusion反应后的dna溶液中进行了大肠杆菌dh5α感受态细胞(toyobo)的转化。将所得到的转化体在含有100μg/ml氨苄西林(ampicillin，氨苄青霉素)的lb液体培养基中、于37℃下培养过夜，使用nucleobond xtra midi试剂盒(takara bio株式会社)从中提取质粒。所得到的表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员已知的方法进行确定，确认编码了目标氨基酸序列的蛋白。
[0127]
奥马珠单抗fd-铰链区的氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrlscavsgysitsgyswnwirqapgkglewvasitydgstnynpsvkgritisrddskntfylqmnslraedtavyycargshyfghwhfavwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcp (seq id no: 18)；野生型狗igg h链fc区的氨基酸序列apemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspgk (seq id no: 1)；野生型猫igg h链fc区的氨基酸序列ppemlggpsififppkpkdtlsisrtpevtclvvdlgpddsdvqitwfvdntqvytaktspreeqfnstyrvvsvlpilhqdwlkgkefkckvnskslpspiertiskakgqphepqvyvlppaqeelsrnkvsvtcliksfhppdiaveweitgqpepennyrttppqldsdgtyfvysklsvdrshwqrgntytcsvshealhshhtqksltqspgk (seq id no: 2)；奥马珠单抗l链的氨基酸序列diqltqspsslsasvgdrvtitcrasqsvdydgdsymnwyqqkpgkapklliyaasylesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqshedpytfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (seq id no: 19)。
[0128]
参考例2. 具有改变型fc的igg h链表达载体的制作以fc区的氨基酸序列被取代成表1“狗、猫fc改变的位点”所示的氨基酸的方式设计了编码突变氨基酸的引物。以实施例1中制作的h链表达用载体pcdna3.1( )/奥马珠单抗fd-dog wtfc和pcdna3.1( )/奥马珠单抗fd-cat wtfc为模板，通过使用了所设计的引物的pcr法扩增在fc区导入了突变的dna片段，使用in-fusion试剂盒连接已扩增的dna片段，从而制作了仅在成为模板的fc的任意部位导入了突变的h链表达载体。
[0129]
在任何情况下使用in-fusion试剂盒时，均按照所附说明书记载的方法，在in-fusion反应后的dna溶液中进行了大肠杆菌dh5α感受态细胞(toyobo)的转化。将所得到的转化体在含有100μg/ml氨苄西林的lb液体培养基中、于37℃下培养过夜，使用nucleobond xtra midi试剂盒(takara bio株式会社)从中提取质粒。所得到的表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员已知的方法进行确定，确认编码了目标氨基酸序列的蛋白。
[0130]
参考例3. 抗体表达和纯化将参考例1和参考例2中得到的表达载体一过性地导入至freestyle 293细胞(invitrogen)，进行了抗体的表达。回收所得到的培养上清后，通过0.22μm过滤器millex(r)-gp(merck millipore)，得到了培养上清。通过使用了mabselect sure (ge healthcare)的亲和色谱，利用50mm乙酸对所得到的培养上清进行洗脱，加入1.5m tris-hcl (ph7.5)进行中和处理，从而纯化了抗体。对于所得到的抗体，使用可分馏30kda的超滤膜(merck millipore)进行了缓冲液置换，置换成20mm组氨酸-hcl、150mm nacl、ph6.5的缓冲液。纯化抗体浓度如下计算：使用分光光度计测定280nm下的吸收度，由所得值通过pace等人的方法算出吸光系数，再利用该吸光系数算出抗体浓度(protein science (1995); 4, 2411-2423)。
[0131]
参考例4. fcrn表达载体的制作登录在genbank: xp_005616366.1的狗fcgrt的胞外区(seq id no: 22、以下也简称为dog fcgrt。)和登录在genbank: xp_023100998.1的猫fcgrt的胞外区(seq id no: 23、以下也简称为cat fcgrt。)分别委托genscript japan株式会社进行基因合成、以及将所合成的基因克隆到pcdna3.1( ) (invitrogen)并进行质粒提取，使成为在c末端侧赋予his标记物(标签) (hhhhhhhh) (seq id no: 24)的氨基酸序列。所得到的表达载体为pcdna3.1( )/dog fcgrt、pcdna3.1( )/cat fcgrt。
[0132]
根据登录在genbank: np_001271408的狗β2m (seq id no: 25、以下也简称为dog β2m。)和登录在genbank: np_001009876的猫β2m (seq id no: 26、以下也简称为cat β2m。)氨基酸序列，委托genscript japan株式会社进行基因合成、以及将所合成的基因克隆到pcdna3.1( ) (invitrogen)并进行质粒提取。所得到的表达载体为pcdna3.1( )/dog β2m、pcdna3.1( )/cat β2m。
[0133]
dog fcgrt胞外区的氨基酸序列mgvprprswglgfllfllptlraadshlsllyhltavsapppgtpafwasgwlgpqqylsynnlraqaepygawvwenqvswywekettdlrtkeglflealkalgdggpytlqgllgcelgpdntsvpvakfalngedfmtfdpklgtwngdwpetetvskrwmqqagavskertfllyscpqrllghlergrgnlewkeppsmrlkarpgspgfsvltcsafsfyppelqlrflrnglaagsgegdfgpngdgsfhawssltvksgdehhyrclvqhaglpqpltvelespakss (seq id no: 22)；
cat fcgrt胞外区的氨基酸序列mgvprpqpwglgfllfllptlraaeshlsllyhltavsspapgtpafwvsgwlgpqqylsynnlraqaepcgawvwenqvswywekettdlrnkqelflealkvlgeggpytlqgllgcelgpdnasvpvakfalngedfmdfdpklgtwsgewpetetiskrwmqeagavskertfllnscpqrllghlergrgnlewkeppsmrlkarpgspgfsvltcsafsfyppelqlrflrnglaagsgegdfgpngdgsfhawssltvksgdehhyrclvqhaglpqpltvelespakss (seq id no: 23)；dog β2m的氨基酸序列maprpalatagflalllillaacrldavqhppkiqvysrhpaengkpnflncyvsgfhppeieidllkngkemkaeqtdlsfskdwtfyllvhteftpneqdefscrvkhvtlsepqivkwdrdn (seq id no: 25)；cat β2m的氨基酸序列marfvvlvllgllylshldavqhspkvqvysrhpaengkpnflncyvsgfhppqiditlmkngkkmeaeqtdlsfnrdwtfyllvhteftptvedeyscqvnhttlsepkvvkwdrdm (seq id no: 26)。
[0134]
参考例5. fcrn蛋白的表达和纯化使用实施例4中得到的pcdna3.1( )/dog fcgrt与pcdna3.1 ( )/dog β2m的组合、以及pcdna3.1( )/cat fcgrt与pcdna3.1( )/cat β2m的组合，将表达载体共转染到freestyle293细胞(invitrogen公司)中，使狗和猫的fcrn蛋白表达。进行培养，回收所得到的培养上清后，通过0.22μm过滤器millex(r)-gp(merck millipore)得到了培养上清。所得到的培养上清原则上通过以下的2个步骤进行纯化。步骤1是对his标记物进行亲和柱色谱(his trap hp)，通过使用了20mm tris、0.5m nacl、10mm咪唑、ph7.4和20mm tris、0.5m nacl、500mm咪唑、ph7.4的缓冲液的咪唑浓度的梯度洗脱来分馏目标蛋白。步骤2是使用凝胶过滤柱色谱(superdex200)，进行向d-pbs(-)、ph7.0缓冲液的置换和尺寸分馏，进行了目标蛋白的纯化。关于纯化蛋白，使用分光光度计测定在280nm处的吸光度，由所得值通过pace等人的方法算出吸光系数，利用该吸光系数算出纯化蛋白的浓度(protein science (1995); 4, 2411-2423)。
[0135]
试验例1：利用biacore进行的相互作用测定(结合分析)所获取的抗体对狗和猫的fcrn的结合能力的评价为了判断所获取的抗体是否具有对狗和猫的fcrn的结合能力，使用biacorex100 (ge healthcare)进行评价。作为血浆中的条件，设定为ph7.4。作为内体内的条件(酸性条件)，设定为ph6.0。使目标抗体捕获到传感芯片蛋白l (ge healthcare)上，使用狗、猫fcrn作为抗原。使用3种运行缓冲液(1：50mmol/l磷酸、150mmol/l nacl、0.05% (w/v) tween-20、ph7.4；2：50mmol/l磷酸、150mmol/l nacl、0.05% (w/v) tween-20、ph7.0；3：50mmol/l磷酸、150mmol/l nacl、0.05%(w/v) tween-20、ph6.0)进行测定。
[0136]
测定的实施方法以流速5μl/分钟注射用运行缓冲液稀释的抗体达1分钟，使其捕获到传感芯片上。之后，以流速30μl/分钟注射用运行缓冲液稀释至1600、800、400、200、100nm的fcrn和运行缓冲液(作为参照溶液)达2分钟，与所捕获的抗体相互作用，再以流速30μl/分钟流入运行缓冲液达10分钟，观察fcrn的解离。最后，以流速30μl/分钟注射10mmol/l甘氨酸-hcl、ph1.7，1分钟注射2次，再生传感芯片。通过再生操作，洗涤捕获到传感芯片上的抗体，重复使用传感芯片。
[0137]
由于在ph7.4下野生型igg与fcrn的结合亲和性非常低，故难以计算kd值，因此在难以准确地测定亲和性的情况下，采用ph7.0代替ph7.4来实施测定。
[0138]
分析方法为了算出包含各fc区变体的抗体与fcrn的解离常数kd (mol/l)，动力学分析按照以下的方法进行实施。首先，使目标抗体捕获到上述的传感芯片上，使其与用运行缓冲液稀释的fcrn发生相互作用，对于所得到的传感图，利用biacore评估软件使测定结果以1:1结合模型进行全局拟合，从而算出结合速度常数ka (l/mol/s)、解离速度常数kd (1/s)，由其值算出解离常数kd (mol/l)。
[0139]
在所得到的传感图为箱型且立即达到平衡状态的情况下，注射fcrn期间的平衡值(=结合量)反映了解离常数kd (m)，关于各变体与fcrn的解离常数kd (mol/l)的算出，通过利用biacore评估软件对作为biacore的测定结果而得到的传感图进行稳态亲和性分析来算出。
[0140]
以1:1结合模型相互作用的分子在biacore上的行为可由下式1表示。
[0141]
req = c
×
rmax/(kd c) riꢀꢀꢀ(式1)上述式中的各项的含义如下。
[0142]
req(ru)：恒定状态结合水平(steady state binding levels)；rmax(ru)：分析物的表面结合能力(affinity binding capacity of the surface)；ri(ru)：样品中的容量折射率贡献(bulk refractive index contribution in the sample)；c(m)：分析物浓度(analyte concentration)；kd(m)：平衡解离常数(equilibrium dissociation constant)。
[0143]
结果见下表。
[0144]
[表2][表3]
[表4][表5]实施例1. 猫的野生型促红细胞生成素与igg h链fc区的融合蛋白的表达质粒的
构建构建了猫的促红细胞生成素(以下，称为epo)与igg h链fc区(以下，称为fc)的融合蛋白(以下，称为cat epo-fc或猫epo-fc。)的表达质粒。详情记载如下。
[0145]
以登录在genbank: jq413414.1的野生型猫epo的氨基酸序列(seq id no: 11)和登录在genbank: ab016710.1的野生型猫igg h链的铰链区(seq id no: 12)～fc区(seq id no: 2)的氨基酸序列为参考，确定了猫epo-fc的氨基酸序列(seq id no: 13)。此时，epo区、fc区保留野生型序列，而在铰链区将存在的三处半胱氨酸中的n末端侧的1个改变为甘氨酸。根据已确定的氨基酸序列合成了基因。
[0146]
用限制酶sbfi和ecorv (均来自new england biolabs)切割本公司构建的质粒pcag (结构见图1)，调制在cag启动子正下方开环的质粒片段，使用in-fusion hd克隆试剂盒(clontech公司制造) (以下，记作in-fusion试剂盒)与所合成的猫epo-fc的基因片段连接，构建了野生型猫epo-fc的表达质粒pcag/c2 cat wtepo-fc。使用in-fusion试剂盒时，按照所附说明书记载的方法，在in-fusion反应后的dna溶液中进行了大肠杆菌dh5α感受态细胞(toyobo)的转化。将所得到的转化体在含有25μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中、于37℃下培养过夜，使用nucleobond xtra midi试剂盒(takara bio株式会社)从培养所得的大肠杆菌中提取质粒。所得到的质粒的核苷酸序列按照本领域技术人员已知的方法进行确定，确认编码了目标氨基酸序列的蛋白。
[0147]
野生型猫epomgscecpalllllsllllplglpvlgapprlicdsrvleryileareaenvtmgcaegcsfsenitvpdtkvnfytwkrmdvgqqavevwqglallseailrgqallanssqpsetlqlhvdkavsslrsltsllralgaqkeatslpeatsaaplrtftvdtlcklfriysnflrgkltlytgeacrrgdr (seq id no: 11)；野生型猫igg h链的铰链区rktdhppgpkpcdcpkcp (seq id no: 12)；野生型猫igg h链的fc区ppemlggpsififppkpkdtlsisrtpevtclvvdlgpddsdvqitwfvdntqvytaktspreeqfnstyrvvsvlpilhqdwlkgkefkckvnskslpspiertiskakgqphepqvyvlppaqeelsrnkvsvtcliksfhppdiaveweitgqpepennyrttppqldsdgtyfvysklsvdrshwqrgntytcsvshealhshhtqksltqspgk (seq id no: 2)；基因合成的猫epo-fcmgscecpalllllsllllplglpvlgapprlicdsrvleryileareaenvtmgcaegcsfsenitvpdtkvnfytwkrmdvgqqavevwqglallseailrgqallanssqpsetlqlhvdkavsslrsltsllralgaqkeatslpeatsaaplrtftvdtlcklfriysnflrgkltlytgeacrrgdrrktdhppgpkpgdcpkcpppemlggpsififppkpkdtlsisrtpevtclvvdlgpddsdvqitwfvdntqvytaktspreeqfnstyrvvsvlpilhqdwlkgkefkckvnskslpspiertiskakgqphepqvyvlppaqeelsrnkvsvtcliksfhppdiaveweitgqpepennyrttppqldsdgtyfvysklsvdrshwqrgntytcsvshealhshhtqksltqspgk (seq id no: 13)。
[0148]
实施例2. 改变了epo区、铰链区的氨基酸的猫epo-fc的表达质粒的构建为了探索使野生型猫epo-fc的物性或生理活性发生变化的氨基酸突变，如表6所示，构建了使epo区的半胱氨酸、铰链区的半胱氨酸、铰链区的有无发生了各种变化的猫epo-fc的氨基酸突变体(以下，也称为猫epo-fc变体)的表达质粒。详情记载如下。
[0149]
首先，设计了在实施例1中构建的pcag/c2 cat wtepo-fc的猫epo-fc dna的突变导入部位退火、并且编码表6所示的各猫epo-fc变体的特征性氨基酸序列的引物。接下来，以pcag/c2 cat wtepo-fc为模板，通过使用了所设计的引物的pcr法扩增导入了突变的dna片段，使用in-fusion试剂盒连接已扩增的dna片段，从而构建了猫epo-fc变体的表达质粒pcag/c2 c59p cat epo-fc、pcag/c2 c165r cat epo-fc、pcag/c1a cat wtepo-fc、pcag/c1a c59p cat epo-fc、pcag/c1a c165r cat epo-fc、pcag/c1b cat wtepo-fc、pcag/c1b c59p cat epo-fc、pcag/c1b c165r cat epo-fc、pcag/c0 cat wtepo-fc、pcag/c0 c59p cat epo-fc、pcag/c0 c165r cat epo-fc、pcag/hl cat wtepo-fc、pcag/hl c59p cat epo-fc、pcag/hl c165r cat epo-fc。in-fusion试剂盒的使用、以及之后的大肠杆菌dh5α的转化和培养、提取质粒、核苷酸序列的确定均与实施例1记载的方法同样地进行，确认了可构建目标质粒。
[0150]
[表6]实施例3. 野生型猫epo-fc和epo区、铰链区改变型猫epo-fc蛋白的表达/纯化/分析使用细胞/培养基/转染试剂一同包装的expicho
tm
表达系统试剂盒(gibco)，按照试剂盒的max titer操作指南，将实施例1和实施例2中得到的15种猫epo-fc的表达质粒分别导入至expi cho-s
tm
细胞中，培养14天，进行了蛋白表达。将转染后的30ml培养上清通过0.22μm过滤器millex(r)-gp (merck millipore)进行澄清化。
[0151]
使澄清化培养上清的一部分在使用了novex
tm 4-20% tris-甘氨酸mini凝胶(invitrogen)的非还原条件sds-page中电泳，之后转印到pvdf膜(invitrogen)上，通过1次抗体为兔抗人促红细胞生成素抗体(r&d systems)、2次抗体为山羊抗兔igg抗体(ap) (millipore)、显色底物为碱性磷酸酶染色用bcip-nbt溶液试剂盒、nuclease tested (nacalai tesque)的蛋白质印迹法，分析了培养上清中所含的目标蛋白(图2)。
[0152]
在非还原条件的sds-page中，具有c2型、c1a型、c1b型铰链的猫epo-fc变体在具有c0型、hl型铰链的猫epo-fc变体的主要谱带(55-70kda间)的约2倍的位置(130-250kda间)
出现了主要谱带。由此显示了：具有c2型、c1a型、c1b型铰链的猫epo-fc变体在分子间形成了二硫键。而且，在epo区具有c165r突变的猫epo-fc变体与其他变体相比，拖尾的谱带非常浅，由此显示出：除二聚体以外的缔合体/聚集体少，具有优异的物性。
[0153]
将澄清化培养上清的剩下的全部添加在填充有mabselect sure (ge healthcare lifesciences)的柱中后，以50mm乙酸作为洗脱缓冲液、以1.5m tris-hcl、ph7.5作为中和缓冲液，实施了所表达的蛋白的蛋白a亲和纯化。之后，再使用superdex200凝胶过滤柱(ge healthcare lifesciences)，实施以50mm磷酸、300mm nacl、ph7.0为缓冲液的凝胶过滤色谱，分取主峰的蛋白组分，从而得到了纯化蛋白。使用分光光度计来测定纯化蛋白在280nm处的吸光度，由所得值通过pace等人的方法(protein science (1995); 4, 2411-2423)算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化蛋白的收量(表7)。
[0154]
[表7]在具有c2型、c1a型、hl型铰链的猫epo-fc变体中发现了：除铰链的突变以外，若还在epo区组合c165r突变，则纯化后的蛋白收量提高。在对蛋白进行凝胶过滤纯化时，尽可能仅分取主峰，不分取认为是蛋白聚集物/降解物的杂峰，由此认为：epo区c165r、并且具有c2型、c1a型、hl型铰链的猫epo-fc收量良好的原因在于优异的物性。
[0155]
使用novex
tm 4-20% tris-甘氨酸mini凝胶(invitrogen)，在非还原条件和还原条件下对纯化后的猫epo-fc进行sds-page后，用simplyblue
tm safestain (invitrogen)进行cbb染色，确认了猫epo-fc的分子间二硫键的有无(图3)。
[0156]
具有c2型、c1a型、c1b型铰链的猫epo-fc变体的主要谱带在还原条件下位于55-70kda间，但在非还原条件下位于约2倍大小(130-250kda间)。由此显示出：具有c2型、c1a型、c1b型铰链的猫epo-fc变体在分子间形成了包含二硫键的二聚体。另外，具有c0型、hl型铰链的猫epo-fc变体的主要谱带不依赖于非还原/还原，常常位于55-70kda间，由此显示出：至少在分子间未形成包含二硫键的共价二聚体。另一方面，具有c0型、hl型铰链的猫epo-fc变体也具有fc，这一点没有改变，因此认为形成了经由fc的非共价二聚体。
[0157]
再以g3000swxl柱(tosoh)为载体，以50mm磷酸、300mm nacl、ph7.0为流动相，流速设为0.7ml/分钟，检测波长设为220nm，使用尺寸排阻色谱(sec)装置分析纯化后的猫epo-fc。以比主峰(二聚体)先洗脱的峰作为聚集/缔合体，以晚洗脱的峰作为单体、降解物，进行分析，通过面积百分率法算出主峰的含量(%)，与保留时间(rt)一起在样本间进行比较(表8) (图4)。
[0158]
[表8]
表8中，在所有的猫epo-fc变体中主峰的保留时间均显示了相似的数值，由此强烈暗示了：即使在具有不含c0型、hl型半胱氨酸的铰链的猫epo-fc变体中，也形成了与具有包含c2型、c1a型、c1b型半胱氨酸的铰链的变体同等程度的分子量、即形成了二聚体。
[0159]
由图4可知：在具有c2型、c1a型、c1b型铰链的猫epo-fc变体中，除铰链的突变以外还在epo区组合了c165r或c59p突变，从而在sec分析时位于主峰左侧的认为是聚集/缔合体的次峰(sub-peak)与具有野生型epo的猫epo-fc相比减少。图4f是显示合并作为猫epo-fc融合蛋白的1. wt cat epo-c2-fc、2. c59p cat epo-c2-fc和3. c165r cat epo-c2-fc (表8的1～3)的sec分析结果的色谱图的图。通过放大所合并的色谱图，可知3. c165r cat epo-c2-fc的次峰最少。
[0160]
特别是epo区为c165r突变且具有c2型铰链的猫epo-fc的次峰少，由此可知：该变体的物性良好。
[0161]
以上，可知在实施例3中评价的猫epo-fc在所有变体中均主要形成了二聚体，但发现了根据epo区、铰链区的半胱氨酸的数量等，聚集体的生成比例发生变化，进而在纯化后的未变性蛋白的收量上产生差异。尤其是发现了在具有epo区的c165r、并且铰链区为c2型的猫epo-fc变体中，聚集等过度的多聚体化处于被抑制的倾向，且纯化后的蛋白为二聚体，并且纯度/收量均优异。
[0162]
实施例4. 猫epo与his标记物、以及小鼠epo与his标记物的融合蛋白的表达质粒的构建作为猫epo-fc蛋白的对照品等，构建了各种实验中使用的猫epo与his标记物的融合蛋白(以下，称为猫epo-his或cat epo-his)和小鼠epo与his标记物的融合蛋白(以下，称为小鼠epo-his或mouse epo-his)的表达质粒。详情记载如下。
[0163]
最初，设计在猫epo的n末端侧退火的正向引物、和在c末端侧退火且编码包含接头的his标记物(gaahhhhhhhhh (seq id no: 14))的反向引物，以实施例1和实施例2中构建的pcag/c2 cat wtepo-fc、pcag/c2 c59p cat epo-fc、pcag/c2 c165r cat epo-fc为模板，通过使用了所设计的引物的pcr法调制了3种(野生型、c59p、c165r)猫epo-his整个区域的dna片段。
[0164]
接下来，确定对登录在genbank: nm_007942.2的小鼠epo的氨基酸序列(seq id no: 15)的c末端侧赋予了包含接头的his标记物(gaahhhhhhhhh)的小鼠epo-his的氨基酸序列，根据氨基酸序列委托genscript japan株式会社进行基因合成，得到了小鼠epo-his整个区域的dna片段。然后，用限制酶sbfi和ecorv(均来自new england biolabs)切割质粒
pcag，调制了在cag启动子正下方开环的质粒片段。最后，使用in-fusion试剂盒将3种猫epo-his (野生型、c59p、c165r)和小鼠epo-his的dna片段分别与pcag的质粒片段连接，构建了总计4种epo-his质粒、即pcag/cat wtepo-his、pcag/c59p cat epo-his、pcag/c165r cat epo-his、pcag/mouse wtepo-his。in-fusion试剂盒的使用和之后的大肠杆菌dh5α的转化和培养、提取质粒、核苷酸序列的确定均与实施例1记载的方法同样地进行，确认了可构建目标质粒。
[0165]
野生型小鼠epomgvperptlllllsllliplglpvlcapprlicdsrvleryileakeaenvtmgcaegprlsenitvpdtkvnfyawkrmeveeqaievwqglsllseailqaqallanssqppetlqlhidkaisglrsltsllrvlgaqkelmsppdttppaplrtltvdtfcklfrvyanflrgklklytgevcrrgdr (seq id no: 15)。
[0166]
实施例5. 通过向哺乳类细胞中转染猫epo-his、小鼠epo-his表达质粒而进行的蛋白表达和纯化使用细胞/培养基/转染试剂一同包装的expicho
tm
表达系统试剂盒(gibco)，按照试剂盒的max titer操作指南，将实施例4中得到的pcag/cat wtepo-his、pcag/c59p cat epo-his、pcag/c165r cat epo-his、pcag/mouse wtepo-his分别导入至expi cho-s
tm
细胞，培养7天，进行了蛋白表达。将转染后的30ml培养上清通过0.22μm过滤器millex(r)-gp(merck millipore)进行澄清化。将培养上清添加在填充有his trap hp (ge healthcare lifesciences)的柱中，通过咪唑梯度洗脱实施了his标记物蛋白的亲和纯化。之后，再使用superdex200凝胶过滤柱(ge healthcare lifesciences)实施以d-pbs(-)为缓冲液的凝胶过滤色谱，得到了纯化蛋白。使用分光光度计测定纯化蛋白在280nm处的吸光度，由所得值通过pace等人的方法算出吸光系数，利用该吸光系数算出纯化蛋白的浓度(protein science (1995); 4, 2411-2423)。
[0167]
实施例6. 使用了tf-1细胞的epo区、铰链区改变型猫epo-fc的体外活性评价使用显示人epo依赖性细胞增殖的人红白血病细胞株即tf-1细胞，在体外评价了实施例3中调制的15种猫epo-fc和实施例5中调制的3种猫epo-his和所购入的人epo (peprotech)的生物活性。详情记载如下。
[0168]
用包含10% fbs (thermo fisher scientific)、100u/ml青霉素/链霉素(thermo fisher scientific)的rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)洗涤baf3/cat epor和tf-1细胞3次，之后用该培养基调整细胞数使达到4
×
105个细胞/ml，在96孔-板(corning)的各孔中分别接种50μl。以该培养基作为稀释液，调制配体(各种epo-fc、epo-his、epo)的8种浓度的从13.16nm起的4倍稀释系列，在接种有细胞的96孔-板的各孔中分别注入50μl。在37℃、5% co2条件下培养3天，以10μl/孔加入细胞计数试剂盒-8 (同仁化学研究所)，培养3小时后，再次测定450nm的吸光度(参照波长620nm)，评价了各种配体的生物活性。结果见图5。
[0169]
与人epo相比，作为单体的猫epo-his使tf-1细胞增殖的活性明显低。认为这是由tf-1细胞表达的人epor与猫epo的亲和性之差引起的。然而，确认到了以下倾向：猫epo-fc的活性明显高于猫epo-his，特别是epo区具有c59p、c165r突变的突变体、并且铰链区具有c2型、c1a型突变的变体显示出较其他的猫epo-fc更高的活性。
[0170]
尤其是epo区为c165r突变且铰链区为c2型的猫epo-fc变体的活性高。
[0171]
实施例7. fc改变型猫epo-fc的表达质粒的构建在实施例3和实施例6中，在具有epo区的c165r突变、铰链区的c2突变的猫epo-fc中看到了物性和生理活性改善的倾向。为了确认epo区的c165r突变、铰链区的c2突变的性质即使在向野生型fc中导入了突变的猫epo-fc中是否也不受损，构建了向fc区也导入了突变的猫epo-fc的表达质粒。新构建的猫epo-fc变体的epo区、铰链区、fc区的序列的特征见表9。质粒构建的详情记载如下。
[0172]
设计了在野生型猫fc dna的想要导入突变的部位退火、并且编码seq id no: 3所示的fc变体(称为cfv3)的特征性氨基酸序列的引物。接下来，以实施例2中构建的pcag/c2 c165r cat epo-fc为模板，通过使用了所设计的引物的pcr法扩增导入有突变的dna片段，使用in-fusion试剂盒连接已扩增的dna片段，从而构建了表达质粒pcag/c2 c165r cat epo-cfv3。
[0173]
设计了在cfv3 dna的想要导入突变的部位退火、并且编码seq id no: 4所示的fc变体(称为sicfv3)的特征性氨基酸序列的引物。接下来，以pcag/c2 c165r cat epo-cfv3为模板，通过使用了所设计的引物的pcr法扩增导入有突变的dna片段，使用in-fusion试剂盒连接已扩增的dna片段，从而构建了表达质粒pcag/c2 c165r cat epo-sicfv3。
[0174]
设计仅扩增fc区的引物，通过以pcag/c2 c165r cat epo-sicfv3为模板的pcr法调制了sicfv3的dna片段。另外，分别设计扩增epo区和epo～铰链区的引物，通过以实施例1中构建的pcag/c2 cat wtepo-fc和实施例2中构建的pcag/hl c165r cat epo-fc为模板的pcr法分别调制了包含c2型铰链区的野生型猫epo (cat wtepo-c2铰链)、不含铰链区的c165r型猫epo (cat c165r epo)的dna片段。最后，使用in-fusion试剂盒连接通过pcr法调制的epo (cat wtepo-c2铰链、cat c165r epo)及fc(sicfv3) dna的片段和通过实施例1的限制酶处理(sbfi和ecorv)调制的pcag的质粒片段，从而构建了pcag/c2 cat wtepo-sicfv3、pcag/hl c165r cat epo-sicfv3。in-fusion试剂盒的使用、以及之后的大肠杆菌dh5α的转化和培养、提取质粒、核苷酸序列的确定均与实施例1记载的方法同样地进行，确认了可构建目标质粒。
[0175]
猫fc变体cfv3ppemlggpsififppkpkdtlsisrtpevtclvvdlgpddsdvqitwfvdntqvytaktspreeqfnstyrvvsvlpilhqdwlkgkefkckvnskslpspiertiskakgqphepqvyvlppaqeelsrnkvsvtcliksfhppdiaveweitgqpepennyrttppqldsdgtyfvysklsvdrshwqrgntytcsvlhealhahhtrkeltqspgk (seq id no: 3)；猫fc变体sicfv3ppemrrgpkififppkpkdtlsisrtpevtclvvdlgpddsdvqitwfvdntqvytaktspreeqfnstyrvvsvlpilhqdwlkgkefkckvnskslpspiertiskakgqphepqvyvlppaqeelsrnkvsvtcliksfhppdiaveweitgqpepennyrttppqldsdgtyfvysklsvdrshwqrgntytcsvlhealhahhtrkeltqspgk (seq id no: 4)；[表9]
实施例8. fc改变型猫epo-fc的蛋白表达和纯化使用细胞/培养基/转染试剂一同包装的expicho
tm
表达系统试剂盒(gibco)，按照试剂盒的max titer操作指南，将5种(实施例2中构建的pcag/c2 c165r cat epo-fc和实施例7中构建的4种猫epo-fc的表达质粒pcag/c2 c165r cat epo-sicfv3、pcag/c2 cat wtepo-sicfv3、pcag/c2 c165r cat epo-cfv3、pcag/hl c165r cat epo-sicfv3)猫epo-fc的表达质粒分别导入至expi cho-s
tm
细胞，培养7天，进行了蛋白表达。使转染后的30ml培养上清通过0.22μm过滤器millex(r)-gp (merck millipore)进行澄清化。按照与实施例3同样的方法纯化/分析了澄清化培养上清。
[0176]
图6显示已纯化的蛋白的sds-page分析和sec分析的结果，表10显示纯化蛋白的收量的结果。
[0177]
[表10]发现了：以epo区为c165r突变且铰链区为c2型的猫epo-fc变体为基础，即使进一步向fc区导入sicfv3突变或cfv3，所表达的蛋白也形成了二聚体，且纯化后的蛋白的纯度/收量均良好。
[0178]
实施例9. 使用了tf-1细胞的fc改变型猫epo-fc的体外活性评价使用显示人epo依赖性细胞增殖的人红白血病细胞株即tf-1细胞，在体外评价了实施例8中调制的猫epo-fc和所购入的人epo (peprotech)的生物活性。详情记载如下。
[0179]
用包含10% fbs (thermo fisher scientific)、100u/ml青霉素/链霉素(thermo fisher scientific)的rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)洗涤tf-1细胞3次，之后用该培养基调整细胞数使达到4
×
10
5 个细胞/ml，在96孔-板(corning)的各孔中分别接种50μl。以该培养基作为稀释液，调制配体(各种epo-fc、epo-his、epo)的8种浓度的从13.16nm起的4倍稀释系列，在接种有细胞的96孔-板的各孔中分别注入50μl。在37℃、5% co2条件下培养3天，以10μl/孔加入细胞计数试剂盒-8 (同仁化学研究所)，培养3小时后，再次测定450nm的吸光度(参照波长620nm)，评价了各种配体的生物活性。结果见图7。
[0180]
通过与epo区为野生型或不具有铰链区的epo-fc变体相比确认到了：在epo区为c165r突变且铰链区为c2型的猫epo-fc变体中，即使进一步向fc区导入sicfv3突变或cfv3，
也维持活性高的倾向。
[0181]
实施例10. 猫和小鼠epo受体的表达质粒的构建构建了在猫epo的生物活性评价中使用的细胞株的建立所需的猫epo受体(以下，称为猫epor或cat epor)和小鼠epo受体(以下，称为小鼠epor或mouse epor)的表达质粒。详情记载如下。
[0182]
根据登录在genbank: xm_023245578.1的猫epor的氨基酸序列(seq id no: 16)和登录在genbank: nm_010149.3的小鼠epor的氨基酸序列(seq id no: 17)来合成基因，得到了猫epor和小鼠epor的dna片段。然后，用限制酶xbai和hindiii (均来自new england biolabs)切割质粒pbapo-ef1α pur (takara bio)，调制了在ef1α启动子正下方开环的质粒片段。最后，使用in-fusion试剂盒将猫epor和小鼠epor的dna片段分别与pbapo-ef1α pur的质粒片段连接，构建了猫和小鼠epor的表达质粒、即pbapo-ef1α pur/cat epor、pbapo-ef1α pur/mouse epor。使用in-fusion试剂盒时，按照所附说明书记载的方法，在in-fusion反应后的dna溶液中进行了大肠杆菌dh5α感受态细胞(toyobo)的转化。将所得到的转化体在含有100μg/ml氨苄西林的lb液体培养基中、于37℃下培养过夜，使用nucleobond xtra midi试剂盒(takara bio株式会社)由培养而得到的大肠杆菌提取质粒。所得到的质粒的核苷酸序列按照本领域技术人员已知的方法来确定，确认编码了目标氨基酸序列的蛋白。
[0183]
猫epormdhlwaplwpgvgslclllagaawapppnpldpkfeskaallaargpeellcfterledlvcfweeaasagvgpdnysffyqlegepwkpcslhqaptargavrfwcslptadassfvplelrvtavssgapryhriihinevvlldppagllarradegghvvlrwlpppgapvasliryevnissgnvaggaqkveildgrtecalsnlrgrtrytfmvrarmaepsfggfwsawsepaslltasdldpliltlslilvlillllavlallshrrtlkqkiwpgipspesefeglftthkgnfqlwlyqnegclwwspcapfaedppsplevlsercwgatqaaepgaeegplleplgsehtqdtylvldkwllprnppsedlprpdgsldmvamhkgseasscssalslkpgpegalgasfeytildpssqllrpralppelpptpphikylylmvsdsgistdyssggsqeaqgdsstgpylnpyenslipatetsppsyvacs (seq id no: 16)；小鼠epormdklrvplwprvgplclllagaawapspslpdpkfeskaallasrgseellcftqrledlvcfweeaassgmdfnysfsyqlegesrkscslhqaptvrgsvrfwcslptadtssfvplelqvteasgspryhriihinevvlldapagllarraeegshvvlrwlpppgapmtthiryevdvsagnraggtqrvevlegrtecvlsnlrggtrytfavrarmaepsfsgfwsawsepaslltasdldpliltlslilvlisllltvlallshrrtlqqkiwpgipspesefeglftthkgnfqlwllqrdgclwwspgssfpedppahlevlseprwavtqagdpgaddegpllepvgsehaqdtylvldkwllprtpcsenlsgpggsvdpvtmdeasetsscpsdlaskprpegtspssfeytildpssqllcpralppelpptpphlkylylvvsdsgistdyssggsqgvhgdssdgpyshpyenslvpdseplhpgyvacs (seq id no: 17)。
[0184]
实施例11. 猫epor和小鼠epor表达ba/f3细胞株的建立为了得到显示猫epo、小鼠epo依赖性增殖的细胞株，如下所示，分别进行了表达猫epor、小鼠epor的ba/f3细胞株的建立。详情记载如下。
[0185]
分取10μg实施例10中构建的pbapo-ef1α pur/cat epor、pbapo-ef1α pur/mouse epor，混合在悬浮于pbs的ba/f3细胞(0.8
×
107个细胞)中，使用gene pulser (bio-rad)以0.33kv、950μfd的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理进行了基因导入的ba/f3细胞在包含
0.4ng/ml的小鼠白介素-3 (r&d systems)、10%胎牛血清(以下记作fbs、thermo fisher scientific)、100u/ml青霉素/链霉素的rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)中培养一昼夜，在细胞中加入实施例5中调制的野生型的猫epo-his、小鼠epo-his，选择了epo-his依赖性地增殖的细胞。epo-his终浓度尝试3.29nm、13.16nm这2种浓度，用猫epo-his选择已导入猫epor基因的细胞，用小鼠epo-his选择已导入小鼠epor基因的细胞。
[0186]
通过上述操作，建立了猫epor表达ba/f3细胞株(以下，记作baf3/cat epor)、小鼠epor表达ba/f3细胞株(以下，记作baf3/mouse epor)。确认了：所建立的baf3/cat epor依赖于猫epo-his进行增殖，而baf3/小鼠epor依赖于小鼠epo-his进行增殖。
[0187]
实施例12. 使用了baf3/mouse epor的猫epo-fc的体外活性评价确认了实施例8中调制的猫epo-fc (c165r cat epo-sicfv3)是否可使实施例11中建立的baf3/mouse epor浓度依赖性地增殖。作为猫epo-fc的对照，还同时评价了实施例5中调制的野生型猫epo-his、野生型小鼠epo-his、所购入的野生型人epo (peprotech)的活性。详情记载如下。
[0188]
用包含10% fbs (thermo fisher scientific)、100u/ml青霉素/链霉素(thermo fisher scientific)的rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)洗涤baf3/小鼠epor 3次，之后用该培养基调整细胞数使达到1.5
×
105个细胞/ml，在96孔-板(corning)的各孔中分别接种50μl。以该培养基作为稀释液，调制配体(猫epo-fc、猫epo-his、小鼠epo-his、人epo)的8种浓度的从13.16nm起的4倍稀释系列，在接种有细胞的96孔-板的各孔中分别注入50μl。在37℃、5% co2条件下培养2天，以10μl/孔加入细胞计数试剂盒-8 (同仁化学研究所)，培养2小时后，再次测定450nm的吸光度(参照波长620nm)，评价了各种配体的生物活性。结果见图8。
[0189]
在体外可确认到猫epo-his、猫epo-fc浓度依赖性地与小鼠epor作用。认为即使在对小鼠个体给药的体内实验中猫epo-fc也可显示生理活性。
[0190]
实施例13. 使用了baf3/cat epor的猫epo-fc的体外活性评价确认了实施例8中调制的猫epo-fc (c165r cat epo-sicfv3)是否可使实施例11中建立的baf3/cat epor浓度依赖性地增殖。作为猫epo-fc的对照，还同时评价了实施例5中调制的野生型猫epo-his、所购入的野生型人epo (peprotech)的活性。详情记载如下。
[0191]
用包含10% fbs (thermo fisher scientific)、100u/ml青霉素/链霉素(thermo fisher scientific)的rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)洗涤baf3/cat epor 3次，之后用该培养基调整细胞数使达到1.5
×
105个细胞/ml，在96孔-板(corning)的各孔中分别接种50μl。以该培养基作为稀释液，调制配体(猫epo-fc、猫epo-his、人epo)的8种浓度的从13.16nm起的4倍稀释系列，在接种有细胞的96孔-板的各孔中分别注入50μl。在37℃、5% co2条件下培养2天，以10μl/孔加入细胞计数试剂盒-8 (同仁化学研究所)，培养2小时后，再次测定450nm的吸光度(参照波长620nm)，评价了各种配体的生物活性。结果见图9。
[0192]
可确认到：猫epo-fc使baf3/cat epor细胞浓度依赖性地增殖。另外，显示出：与猫epo-his相比，猫epo-fc为高活性。认为即使在对猫个体给药的体内实验中，猫epo-fc也可显示生理活性。
[0193]
产业实用性本发明的epo-fc融合蛋白的物性和活性优异。根据本发明，能够以高收率/高收量
获取该epo-fc融合蛋白。
[0194]
本技术以2020年6月10日申请的特愿2020-101237为基础，通过在这里提及，使其全部内容均包含在本说明书中。