本发明涉及形成基质的交联羧烷基壳聚糖、包括该交联羧烷基壳聚糖的组合物、其制备方法及其各种应用，特别是在治疗性、风湿病学、眼科、美容医学、整形手术、开放手术、皮肤病学、妇科或整容领域中的应用。
背景技术
壳聚糖衍生物是已知的，尤其在以WO 2016/016463和WO 2016/016464公开的考麦德制药公司(Kiomed Pharma)的申请及相应的专利中。从考麦德制药公司已知的还有具有优势的壳聚糖衍生物，例如在提交为PCT/EP2018/080763和PCT/EP2018/080767的考麦德制药公司的专利申请及它们的同族中描述的羧烷基壳聚糖，这些专利申请的内容通过引用并入本发明。
根据本发明人，有利的是能够调节羧烷基壳聚糖组合物的生物力学行为，或者甚至能够通过羧烷基壳聚糖的存在来增加治疗的持久性或效果。然而，提供具有改进的生物力学特性的这种组合物(特别是当需要制备水凝胶时)，对于本领域技术人员来说并不是显而易见的。在现有技术的生物聚合物组合物(尤其是水凝胶)中，本领域技术人员已知的生物聚合物基组合物的技术问题之一在于，一些组合物不是内聚水凝胶的形式，即，水凝胶在水性介质存在下自发地分解成不同的部分，从而形成颗粒、碎片。这也被称为碎片凝胶或碎片水凝胶。
人们认识到，当产品植入人类或动物组织中时，这种非内聚水凝胶存在长期炎性结节形成或肉芽肿反应的风险，这被认为是许多医学应用所不希望的(Bergerey-Galley，Aesth Surf J 24，33，2004)。因此，就受试者或患者的健康安全而言，能够避免形成明显的碎片并获得内聚水凝胶形式的组合物是重要的。
而且，在某些情况下，出于几个原因，希望避免这种聚集体以改善填充有这种组合物(这种组合物适当地被生物整合到组织中从而允许均质填充)的组织的美学(视觉和/或摸起来)外观。
因此，对于许多应用，优选内聚水凝胶，例如，当向其中添加水性介质时，该内聚凝胶保持为一整块。这也被称为“均质”水凝胶。再者，对于大多数应用，优选被称为“光滑”水凝胶的水凝胶，因为它的视觉外观上没有或几乎没有结块。
除了内聚性之外，根据本发明的组合物，特别是水凝胶，应适合于在人类或动物中使用，尤其是在安全性、免疫相容性、生物可吸收性、生物力学特性和持久性或活性时间方面。然而，并非现有技术中的所有组合物都令人满意地表现出这些特性，因此不符合本发明。
将羧烷基壳聚糖实施为水凝胶形式的各种方法是已知的。尤其是Rufato等人(Intechopen81811，2018)，Upadhyaya等人(J Controlled Release，2014)，以及Fonseca-Santos等人(Mater Sci Engineering C77，1349，2017)已经确定了用于医疗或药物用途的几种包含羧烷基壳聚糖的壳聚糖基水凝胶。然而，这些水凝胶中没有一种是本发明人所要寻找的，因为它们不满足期望，特别是同时在内聚性、安全性、免疫相容性、生物力学特性、生物可吸收性和/或持久性或活性时间方面。除了根据上述申请PCT/EP2018/080763和PCT/EP2018/080767的考麦德制药公司的组合物之外，根据本发明人，根据现有技术的用于制备已知水凝胶的羧烷基壳聚糖中没有一种表现出良好的免疫相容性。并非任何壳聚糖都可以用于形成可用于人类或动物的水凝胶。
目前已知的壳聚糖基水凝胶是通过将壳聚糖或其衍生物之一与其它聚合物，例如海藻酸盐/酯、异丙基丙烯酰胺、聚氨酯、聚丙烯腈、明胶、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)结合而制备的。然而，这些聚合物要么是非生物可吸收的，要么是免疫反应性的，而这不满足本发明的目的。
例如，Huang等人(RCS Adv 2016DOI:10.1039/C5RA26160K)制备了一种乙二醇壳聚糖和透明质酸水凝胶，然而由于这种乙二醇壳聚糖是免疫反应性的，所以它不适用于人类。Song等人(Sci Rep 6，37600，2016)通过羧甲基壳聚糖的氨基和透明质酸醛之间的席夫碱反应，制备了基于羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸的水凝胶。然而，在本发明人的经验中，所用的羧甲基壳聚糖不具有满足本发明目的所需的分子结构。特别地，根据所进行的体外和体内试验，所描述的水凝胶非常迅速地消融。因此，这种水凝胶需要改进，尤其是在其持久性方面，以便用于广泛的适应症。
再者，以往的产品往往不是很多功能的(versatile)，而不能满足不同适应症的需要，尤其是不同治疗性适应症的需要。因此，需要提供一种在性能，尤其是生物力学性能方面足够多功能的产品，以容易地使其适应不同的应用。
例如，在再生医学或手术中，通常寻求修复改变的组织或液体和/或防止组织改变、填充组织，甚至分离组织以避免粘连。组织改变的起因可能是自然衰老、外部攻击(创伤、紫外线辐射、手术……)、病理(如炎症、自身免疫病理等)。但大多数组织改变涉及氧化应激，有时称为氧化性应激，其特征是高含量的自由基能够损伤组织或细胞。减少自由基的数量能够使得组织防止/延缓其衰老并减少其有害后果。有几种方法来减少组织中自由基的数量，例如通过施用抗氧化物质，如维生素C、B、E和/或泛醌。或者，可以使用能够清除自由基的组合物，从而减少它们在组织中的含量和增殖。
如在Ngo等人的综述(Adv Food Nutrition Res 73,15,2014)中所列的，如针对用于生物医学用途的多种制剂所描述的，壳聚糖及其一些衍生物表现出清除氧化性自由基的能力。例如，尤其如Ujang等人(The Development,Characterization and Application of Water Soluble Chitosan；in Biotechnology of Biopolymers,InTech,2011.ISBN:978-953-307-179-4)所描述的，使用体外测量方法研究了具有不同结构和分子量的羧甲基壳聚糖清除不同类型自由基的能力。
然而，很难提供治疗形式的组合物以利用壳聚糖的有益效果，尤其是其清除自由基的能力，使得既能减少氧化性应激对组织的影响，又能更好地调节产品的生物力学行为，甚至通过这种外生源的聚合物的存在来增加治疗的持久性或效果。
因此，现有技术不能显而易见地使本领域技术人员能够提供令人满意的组合物来克服本发明中提出的问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决提供适用于人或动物(特别是在治疗性、手术和整容领域)的壳聚糖衍生物或包含它的组合物的技术问题。
本发明的一个目的是解决如下技术问题，该技术问题在于提供一种治疗形式的壳聚糖衍生物或包含它的组合物以利用壳聚糖的有益效果，尤其是其清除自由基的能力，使得既可以减少氧化性应激对组织的影响，又可以更好地调节生物力学行为以及通过这种外生源的聚合物的存在来增加治疗的持久性或效果。
特别地，本发明的一个目的是解决如下技术问题：提供一种组合物，尤其是以生物可吸收水凝胶的形式，该组合物特别是在再生医学或抗衰老医学的背景下(例如在治疗性、风湿病学、矫形外科、妇科、眼科、美容医学、整形手术、开放手术、皮肤病学或整容领域)，适于与人或动物组织接触使用，在生物力学特性、原位持久性或活性时间、良好的健康安全性(特别是在短期和长期内没有免疫反应和/或异物反应)方面是可接受的，并且具有有益的效果。
本发明的一个目的是解决提供具有良好生物力学特性(特别是根据其适应症可调节的生物力学特性)的组合物的技术问题。
本发明的一个目的是解决提供一种基于壳聚糖衍生物的产品的技术问题，以使得能够制备具有适应于每个预期的适应症的可变的生物力学特性的一系列产品。
本发明的一个目的是解决提供一种组合物的技术问题，该组合物提供，优选同时提供内聚性、安全性(包括免疫相容性)、生物力学特性、足够用于在人或动物中给药的生物再吸收性，并且优选具有适当的持久性或活性时间。
本发明的一个目的是通过特别是提供一种壳聚糖衍生物或包含它的组合物(该壳聚糖衍生物或包含它的组合物具有患有预期的适应症的人或动物可接受的等级)，来解决本发明中提出的技术问题。
具体实施方式
为了解决本发明中提出的技术问题，发明人寻求开发一种即具有良好的抗氧化特性又具有用于人类或动物中的预期应用的良好的力学特性(称为生物力学特性)的壳聚糖。
本发明人从他们自己的经验中了解到取代的壳聚糖，尤其是羧烷基壳聚糖的优点。特别是，考麦德制药公司已经以PCT/EP2018/080763和PCT/EP2018/080767提交了专利申请。他们试图应用这种教导来解决本发明中提出的技术问题。
本发明人注意到，通过离子(即非共价)交联形成的羧烷基壳聚糖水凝胶在植入后对于一些预期的应用不能保持其生物力学特性足够长的时间；尤其是，这种技术不能使得广泛地调节持久性或活性时间。此外，通过酶催化的交联形成的羧烷基壳聚糖水凝胶由于其蛋白质性质而存在酶免疫反应性的风险，并使所得交联产物的最终纯化复杂化。
专利申请CN 107325306(Imeik Technology Development)描述了在几个连续的交联步骤(多次交联)中采用BDDE通过交联来制备基于甲壳类动物来源的羧甲基壳聚糖的凝胶。然而，该方法不能提供符合本发明标准的水凝胶，特别是因为所获得的水凝胶不是内聚的，这是由于该水凝胶是由分散在羧甲基壳聚糖溶液中的交联壳聚糖衍生物的颗粒形成的，整体再次交联以形成凝胶。交联操作重复数次(“多次交联”)。这种产品很可能形成肉芽肿，从而在与人或动物身体接触后对免疫相容性产生负面影响，这正是本发明寻求避免的。本发明进一步有利地能够使得适应症的多样性更多，尤其是当需要内聚(即，例如在与水接触时保持为一整块而不碎裂)和/或“光滑”外观的水凝胶时。根据CN107325306，所使用的羧甲基壳聚糖具有低DA(脱乙酰化度为60-99％，优选为80-95％，即实际上乙酰化度(DA)远低于40％)。Czechowska-Biskup等人(DOI:10.15259.PCACD.21.03)也描述了具有低乙酰化度的羧甲基壳聚糖水凝胶。然而，这些水凝胶不是内聚的并且不满足本发明的目的。
发明人已经发现，根据本发明的交联羧烷基壳聚糖基质或包含它的组合物(特别是水凝胶)能够解决本发明中提出的至少一个，优选地全部的技术问题。
因此，本发明涉及包括至少一种羧烷基壳聚糖的基质，该羧烷基壳聚糖具有氨基葡萄糖单元、N-乙酰基氨基葡萄糖单元和被羧烷基取代的氨基葡萄糖单元，以相对于总氨基葡萄糖单元的摩尔数的N-乙酰基摩尔数来表示，所述羧烷基壳聚糖的乙酰化度为40％-80％，所述羧烷基壳聚糖通过羧烷基壳聚糖链之间的共价键交联。
实际上，已经发现DA小于40％的交联羧烷基壳聚糖不可能获得具有所需内聚性的水凝胶，因为它在润湿过程中会碎裂成分开的碎片，这对于许多应用来说是不希望的。
根据本发明，内聚的水凝胶被理解为，通过调整传统用于表征皮内使用的水凝胶的方法，例如Micheels等人(J Clin Aesth Dermatol 10,29,2017和J Drugs Dermatol 15,1092,2016)描述的方法，根据称为“水试验”的以下内聚性试验保持其内聚性的水凝胶：
将质量为1g的待测试水凝胶置于直径5cm的玻璃陪替氏培养皿的中心。将体积为1ml的蒸馏水加入到该培养皿的外围。轻轻摆动该陪替氏培养皿，直到水覆盖水凝胶且然后回到水平位置。在基质与水接触后即刻，优选地在基质与水接触15至25秒后，优选地在基质与水接触至少30秒后，观察水凝胶是否保持完整(即，当它是内聚的时会形成一个整体)或当它是非内聚的时是否自发地分离成不同的部分或形成肉眼可见的颗粒。
此外，有利地发现，根据本发明的基质能够清除自由基。对于本领域技术人员来说，保持该壳聚糖特性远非显而易见的。虽然已知羧烷基壳聚糖的分子结构(DS)和分子量会影响其清除自由基的能力，但也已经公开有相矛盾的结果。因此，不清楚交联羧烷基壳聚糖是否会表现出清除自由基的能力。
此外，根据本发明的水凝胶表现出这样的抗氧化活性，同时具有适当的内聚性、生物力学特性、持久性和安全性。
此外，现有技术并不清楚：配制成水凝胶的交联羧烷基壳聚糖是否是内聚的，优选是光滑的(即没有明显的、可见的或摸起来可察觉的碎片)，并具有适当的安全性，特别是免疫相容性、生物力学特性和长久性。本发明能够特别是以水凝胶的形式提供这种基质或组合物。关于免疫相容性的交联基质，即非免疫反应性的并且基本上不激活免疫反应的交联基质，它至少应该由一种或多种非免疫反应性聚合物制备。使用特定且标准化的试验，例如人类全血试验(体外)和皮下注射到小鼠的气囊中来验证聚合物是非免疫反应性的。
可以接受的是，由根据本发明的基质形成的水凝胶不是完全光滑的，具有例如可见的或摸起来可察觉的结块，前提是根据上述水试验它是内聚的。
根据本发明的基质的特征在于起始羧烷基壳聚糖，其被交联以形成根据本发明的基质。
根据第一方面，使用真菌来源的羧烷基壳聚糖，该真菌来源的羧烷基壳聚糖具有羧烷基取代的氨基葡萄糖单元、N-乙酰基氨基葡萄糖单元和氨基葡萄糖单元，以取代基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，所述羧烷基壳聚糖优选具有大于20％的羧烷基基团的取代度。
这也被称为壳聚糖衍生物或取代的壳聚糖。
通过壳聚糖的取代来制备羧烷基壳聚糖。通常，根据以PCT/EP2018/080763及其同族(尤其是FR 17 61314和EP 18799772.1)和PCT/EP2018/080767及其同族(尤其是FR 17 61323和EP 18799773.9)提交的考麦德制药公司的专利申请制备羧烷基壳聚糖，这些专利申请特别地通过引用并入本文以说明羧烷基壳聚糖的制备。
壳聚糖例如是CAS号9012-76-4所表示的壳聚糖。
本发明所用的壳聚糖有利地来源于真菌，并且优选源自子囊菌Ascomycete类型的真菌的菌丝体，特别是黑曲霉Aspergillus piger和/或担子菌类Basidiomycete真菌的菌丝体，并且特别是香菇Lentinula edodes(什塔克菇)和/或双孢蘑菇Agaricus bisporus(白蘑菇)。优选地，该壳聚糖源自双孢蘑菇Agaricus bisporus。壳聚糖优选是高纯度的，即含有很少来自其真菌来源或来自制备过程的杂质，具有与其作为植入物或药物组合物的用途相配的微生物级别。一种制备壳聚糖的方法是专利WO 03/068824(EP 1483299；US 7 556 946)中描述的方法。
通常，将甲壳素在氢氧化钠存在下悬浮在水性介质中，然后根据所需分子量将该介质在高温下加热一段可变的时间。然后将壳聚糖溶解在酸性介质中进行纯化，在碱性介质中进行沉淀，洗涤并干燥。
优选地，所述壳聚糖具有足够的纯度等级以用于药物用途。
有利地对壳聚糖进行纯化，然后优选地进行干燥。纯化后，本发明的方法可包括干燥羧烷基壳聚糖的步骤，然后可选地将其研磨成粉末。可以例如通过蒸发水，例如通过喷雾干燥(雾化)、流化床方法、或通过在真空或大气压下的加热干燥、或通过冻干来干燥羧烷基壳聚糖。
可以将羧烷基壳聚糖溶解于水性溶液中，例如溶解于适用于注射入或植入体内，特别是人体内的制药等级的水中。
然后对这样的羧烷基壳聚糖进行交联以制备根据本发明的基质。
交联羧烷基壳聚糖的DA和DS可以用未交联羧烷基壳聚糖的DA和DS的函数来表示，因为交联后DA和DS基本不变。然而，如果交联剂提供了N-乙酰基或羧烷基，则相较于起始未交联羧烷基壳聚糖这些外来的基团不被算在交联羧烷基壳聚糖的DA和DS内。如下所述，DA和DS的值是本领域技术人员已知的。因此，DA和DS既指交联之前也指交联之后。
通过电位滴定法，如例如专利申请WO2017009335和WO2017009346中所述的，测定壳聚糖的乙酰化度(DA)。或者，也可以通过壳聚糖的其它已知方法来测定DA，诸如液相质子核磁共振、固相碳-13核磁共振、红外光谱法。
有利的是，以N-乙酰基氨基葡萄糖单元的摩尔数相对于总单元的摩尔数表示，该羧烷基壳聚糖的乙酰化度在40-80％之间。乙酰化度以(D-氨基葡萄糖单元的)N-乙酰基基团的数量相对于壳聚糖中存在的总氨基葡萄糖单元(N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、取代的N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、D-氨基葡萄糖和取代的D-氨基葡萄糖)的数量来表示。
有利的是，以N-乙酰基基团的数量相对于总氨基葡萄糖单元的数量表示，羧烷基壳聚糖的乙酰化度在40-80％之间。
根据一种替代实施方式，乙酰化度的范围为40％至50％。根据一种替代实施方式，乙酰化度的范围为50％至60％。根据一种替代实施方式，乙酰化度的范围为60％至75％。
羧烷基壳聚糖的乙酰化度可通过固相碳-13核磁共振、固相碳-13核磁共振或液相质子核磁共振来进行测定。该羧烷基壳聚糖有利地具有受控的乙酰化度。术语“具有受控的乙酰化度的壳聚糖”，是指其乙酰化度(即N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的比例)可以以受控的方式(特别是通过乙酰化反应)进行调节的产品。
优选地，羧烷基壳聚糖是再乙酰化的。
根据一个替代实施方式，制备根据本发明的羧烷基壳聚糖的方法包括制备真菌来源的壳聚糖，将该壳聚糖再乙酰化以及将再乙酰化的壳聚糖羧烷基化。因此，本发明涉及一种再乙酰化的羧烷基壳聚糖。特别地，本发明涉及一种阴离子羧烷基壳聚糖。
根据一个实施方式，从而可以将壳聚糖溶解在水性、优选略微酸化的介质中(例如，pH6)。在一个或多个步骤中可以将乙酸酐加入到壳聚糖溶液中。然后加入碱性试剂，如苏打和/或尿素。然后加入烷基化试剂，例如一氯乙酸钠(即氯乙酸的钠盐)或氯乙酸。然后将取代的壳聚糖纯化、回收和干燥。
根据一个替代实施方式，制备根据本发明的羧烷基壳聚糖的方法包括制备壳聚糖，将该壳聚糖羧烷基化以及接着将羧烷基化的壳聚糖再乙酰化。有利的是，这种方法允许精确控制最终羧烷基壳聚糖的乙酰化度，以特别是获得高乙酰化度，例如40％以上的乙酰化度。因此，本发明涉及一种再乙酰化然后羧烷基化的壳聚糖或一种再乙酰化的羧烷基壳聚糖。
根据一个替代实施方式，制备根据本发明的羧烷基壳聚糖的方法包括制备真菌来源的甲壳素，将该甲壳素羧烷基化，可选地将羧烷基化的甲壳素再乙酰化以获得根据本发明的羧烷基壳聚糖。
根据一个替代实施方式，制备根据本发明的羧烷基化壳聚糖的方法包括制备真菌来源的甲壳素，将甲壳素脱乙酰化，将甲壳素羧烷基化，以及可选地将羧烷基化的甲壳素再乙酰化，以获得本发明的羧烷基壳聚糖。
根据一个替代实施方式，羧烷基壳聚糖的平均分子量小于400000。
根据一个实施方式，该平均分子量在20000到60000之间。
根据另一实施方式，该平均分子量在60000到120000之间。
根据另一实施方式，该平均分子量在100000到400000之间。
根据另一实施方式，该平均分子量在120000到400000之间。
根据另一实施方式，该平均分子量在180000到400000之间。
优选地在本文中，该平均分子量是根据特性粘度计算得出的粘均分子量(Mv)。这种表示是本领域技术人员的习惯表示。根据欧洲药典2.2.9专论中的方法，用Ubbelohde类型的毛细管粘度计，通过毛细管粘度法测量特性粘度(η)。使用自动I-Visc粘度计(劳达Lauda)，通过适合的毛细管(Lauda，例如直径为0.53mm的Ubbelohde 510 01毛细管)测量溶液的流动时间。然后应用Mark-Houwink方程(η＝K*Mvα)来计算羧烷基壳聚糖的平均粘度质量，其中：
Mv为羧烷基壳聚糖的粘均分子量，
η是羧烷基壳聚糖的特性粘度，
如之前用MALLS检测器通过空间排阻色谱法针对(未取代的)壳聚糖所测定的，常数K和α的值分别为0.0686和0.7638。
因此，通常可以表示羧烷基壳聚糖的特性粘度。
可以水解壳聚糖来降低其分子量。
通常，在未交联的羧烷基壳聚糖中，氨基葡萄糖单元是D-氨基葡萄糖单元(D-氨基葡萄糖单元、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元，和被取代的D-氨基葡萄糖单元和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元中的至少一种)。
根据一个替代实施方式，取代的壳聚糖仅具有D-氨基葡萄糖单元的取代。
根据另一替代实施方式，取代的壳聚糖同时具有D-氨基葡萄糖和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元的取代，其中，根据仅壳聚糖的氨基基团的一个替代实施方式，或根据同时有壳聚糖的氨基和羟基基团的另一替代实施方式，羧烷基基团是共价键合的。
取代通常只是部分的，并不是所有的单元都必须被取代。
根据一个实施方式，以D-氨基葡萄糖单元的摩尔数相对于被取代壳聚糖的总单元(取代的或未取代的D-氨基葡萄糖单元和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元)的摩尔数来表示，D-氨基葡萄糖单元的取代度为30％-250％。
根据一个实施方式，以取代基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，所述羧烷基壳聚糖具有的羧烷基基团的取代度大于20％，例如大于50％，例如小于200％。
根据一个实施方式，以取代基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，羧烷基基团的取代度大于50％。
根据一个实施方式，以D-氨基葡萄糖单元的摩尔数相对于被取代壳聚糖的总单元(取代的或未取代的D-氨基葡萄糖单元和N-乙酰-D-氨基葡萄糖单元)的摩尔数来表示，D-氨基葡萄糖单元的取代度在50％-200％范围内，还优选地高于70％。
根据一个实施方式，以取代基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，羧烷基基团的取代度小于80％。
通常，取代是通过共价键合实现的。
根据一个替代实施方式，该羧烷基壳聚糖是N,O-羧烷基壳聚糖。在O-位(氨基葡萄糖单元和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的O3或O6)和/或在(氨基葡萄糖单元的)N-位，被羧烷基基团取代的单元比例可变化。因此，取代度可以大于100％。
有利地，使用配备有PH MAS VTN 400SB BL4 NP/H探针的布鲁克光谱仪(Avance III HD400MHz)，通过固相碳-13NMR来测量羧烷基壳聚糖的取代度(DS)和乙酰化度(DA)。例如，在室温、1到8秒之间的弛豫时间、64到512次之间的扫描次数下记录光谱。解卷积后测定碳信号的面积。所考虑的碳是：“CH3乙酰基”(取代的或未取代的N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的乙酰基基团的甲基碳)、“CX”(氨基葡萄糖和N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的x位碳，x范围为1-6)和“C＝O”(羧烷基取代基的羰基碳和取代的或未取代的N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的乙酰基基团的C＝O羰基碳)。为了测定给定羧烷基壳聚糖的DS，还应记录该羧烷基壳聚糖的前体壳聚糖的碳13NMR光谱。根据前体壳聚糖的光谱，计算出“CSU比”，即“CH3乙酰基”基团(N-乙酰基-氨基葡萄糖单元的乙酰基基团的甲基碳)的信号面积与“C＝O”(N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元的乙酰基基团的羰基碳)的信号面积之比。根据式1计算羧烷基壳聚糖的DA，根据式2计算DS，其中I表示所考虑的碳的信号面积。
式1：
[数学式1]
式2：
[数学式2]
可以使用其它已知的方法来测定羧烷基壳聚糖的DA和DS，例如使用磁共振波谱仪在水性介质中通过质子NMR来测定，例如根据Liu等人(Carb Polym 137,600,2016)描述的方法，例如，在分析前向其中添加氘化盐酸浓溶液来事先水解羧烷基壳聚糖。
如果另一种NMR方法更有利于可靠地估算DA和/或DS，则这种方法适合于使用。上述方法应该由技术人员相对于样品制备和待积分的信号(特别是关于用于计算取代度的信号的分辨率、稳健性和质子位置)进行调整。
以羧烷基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，壳聚糖的羧烷基化程度可以有利地在20-250％范围内，优选在50-200％范围内，以及例如在70-170％范围内。
根据一个替代实施方式，以羧烷基的摩尔数相对于总单元的摩尔数来表示，壳聚糖的羧烷基化程度可以有利地在40-130％范围内，例如在70-130％范围内。
壳聚糖的取代度通常与反应开始时反应物与壳聚糖的质量比有关。羧烷基化试剂的例子包括酰氯化物(或其盐，例如，一氯乙酸钠)，例如带有一个或多个羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧丁基等基团的那些酰氯化物。
根据一个替代实施方式，本发明涉及一种羧烷基壳聚糖，其中羧烷基的烷基部分是直链或支链的C1-C5。
根据一个实施方式，本发明涉及羧甲基壳聚糖。
根据该替代实施方式，取代的壳聚糖是N-羧烷基壳聚糖。
根据该实施方式，取代的壳聚糖是O-羧烷基化的壳聚糖。
根据该替代实施方式，取代的壳聚糖是N-羧烷基化的和O-羧烷基化的壳聚糖。
根据第二方面，本发明涉及一种壳聚糖衍生物，该壳聚糖衍生物具有氨基葡萄糖单元、N-乙酰基-氨基葡萄糖单元和被羧烷基基团取代的氨基葡萄糖单元，所述羧烷基壳聚糖具有在pH 7.5下测量的，小于或等于-10mV，优选小于或等于-15mV的ζ电势。尤其是，这种壳聚糖衍生物能够限制通常通过滴注、注射或植入对其施用予壳聚糖衍生物或包括它的组合物的受试者的免疫反应。
有利地，在pH 7.5下测量的ζ电势小于或等于-18mV。
有利地，该羧烷基壳聚糖具有在pH 7.5下测量的，小于或等于-22mV，优选小于或等于-24mV的ζ电势。
根据一个具体的替代实施方式，取代的壳聚糖优选具有150000至220000的平均分子量和50％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖优选120000至150000的平均分子量和70％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据一个具体的替代实施方式，取代的壳聚糖优选具有220000至300000的平均分子量和70％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有220000至300000的平均分子量和50％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有300000至500000的平均分子量和50％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有300000至500000的平均分子量和70％至200％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖优选具有120000至150000的平均分子量和20％至50％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有220000至300000的平均分子量和20％至50％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有300000至500000的平均分子量和20％至50％的取代度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有20％至80％，优选40％至60％的取代度，并且具有40％至80％，优选50％至75％的乙酰化度。
根据具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有50％至200％，优选70％至200％的取代度，并且具有40％至80％，优选50％至75％的乙酰化度。
根据另一具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有90％至200％，优选90％至150％的取代度，并且具有40％至80％的乙酰化度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
根据具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有90％至200％，优选90％至150％的取代度，并且具有40％至60％，优选50％至60％的乙酰化度。
根据一个具体的替代实施方式，取代的壳聚糖具有90％至200％，优选90％至150％的取代度，并且具有50％至75％的乙酰化度。
根据一个具体的替代实施方式，取代的壳聚糖优选具有220000至300000的平均分子量，90％至200％，优选90％至150％的取代度，以及50％至75％的乙酰化度，该分子量优选表示取代之前的分子量。
通过对壳聚糖进行取代，可以制备可溶于pH值在宽范围内变化的水性溶液中的羧烷基壳聚糖的溶液，而未取代的壳聚糖仅在pH值低于5.5-6.5时是可溶的。因此，由于羧烷基基团的存在改变了其溶解度曲线(profile)，羧烷基壳聚糖显示出在不同的pH下溶解的能力，并且特别是在生理pH下或在病理(例如炎症病理)改变的生理液体的pH下溶解的能力。
所谓“可溶于水”，是指将羧烷基壳聚糖置于水性溶液中时，不会呈现任何肉眼可见的混浊。更具体地，通过小于0.5，优选小于0.2的光密度能够确认在水或缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中浓度例如为1％(m/m)的羧烷基壳聚糖溶液的可溶性(即不存在混浊)，其中光密度是相对于仅包含测量样品所使用的水性溶剂而不存在取代的壳聚糖的参比池，在500nm波长下通过UV-可见光谱法测量的。另一种方法是根据欧洲药典第2.9.20专论进行目视检查。当壳聚糖未被充分取代时，该组合物在室温下，在令人满意的pH范围(例如pH 5.5至pH 8.5)内是不可溶的。
根据一个实施方式，羧烷基壳聚糖是无菌的。
所谓“通过羧烷基壳聚糖链之间的共价键交联”，尤其理解为，壳聚糖主链(也称壳聚糖骨架链)与一条或多条主壳聚糖链共价键合。有利地，由此获得壳聚糖分子的三维网络。本发明不限于特定的共价交联方法，但是优选使用作为交联剂的化学分子(也称为交联剂)的方法。
根据本发明，羧烷基壳聚糖是交联的。
根据一个替代实施方式，通过形成所述共价键的交联剂形成交联。
因此，若干条壳聚糖链可以例如通过与一种或多种交联剂反应来进行交联，该一种或多种交联剂例如选自用于交联多糖的交联剂，诸如1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1-溴-3,4-环氧丁烷、1-溴-4,5-环氧戊烷、1-氯-2,3-环硫丙烷、1-溴-2,3-环硫丙烷、1-溴-3,4-环硫丁烷、1-溴-4,5-环硫戊烷、2,3-二溴丙醇、2,4-二溴丁醇、2,5-二溴戊醇、2,3-二溴丙硫醇、2,4-二溴丁硫醇、2,5-二溴戊烷-硫醇环氧氯丙烷、2,3-二溴丙醇、1-氯-2,3-环硫丙烷、二甲基氨基丙基碳二亚胺、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素、单宁酸、京尼平或甚至二异氰酸酯化合物，诸如六亚甲基二异氰酸酯或甲苯二异氰酸酯，或甚至二乙烯砜。
京尼平是一种天然存在的交联剂，用于交联多糖，特别是羧甲基壳聚糖(Yang et al.Acta Pharmacol Sin，31，1625，2020)。京尼平使水凝胶呈深蓝色至黑色，这在一些适应症中会是一个优势。
优选地，交联剂是聚环氧化合物类型，例如双官能的试剂。优选使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为交联剂，因为它们已经用于制备应用于人类的生物材料，特别是用于皮内、关节内或眼内给药的透明质酸水凝胶。根据一个替代实施方式，该交联剂是二乙烯砜。
有利地，本发明的组合物还可以包括交联羧烷基壳聚糖以外的生物聚合物。根据有利的替代方式，该生物聚合物是氧化的或未氧化的、通过共价键交联的或未交联的多糖，例如糖胺聚糖，且特别是透明质酸，诸如透明质酸或透明质酸钠。
将交联羧烷基壳聚糖与一些其它聚合物结合或交联的优点是增加它们的生物和物理化学特性，或甚至产生协同效应。
根据一个替代实施方式，根据本发明的基质包括交联羧烷基壳聚糖和透明质酸、硫酸软骨素和/或羧甲基纤维素。迄今为止，还没有交联羧烷基壳聚糖(如本发明所定义的)与透明质酸结合的水凝胶。本发明的目的之一是将这两种聚合物结合，以便能够将例如透明质酸公认的保湿特性和壳聚糖的抗氧化应激的保护特性结合。
根据一个替代实施方式，该基质包括至少一种透明质酸。
有利地，根据本发明的基质包括单独的交联羧甲基壳聚糖或与交联或未交联的透明质酸结合的交联羧甲基壳聚糖。这使得可以调整所需的特性。
所述基质包括至少一种羧甲基壳聚糖和透明质酸。
根据一个替代实施方式，如通过毛细管粘度法测定的，透明质酸的生物平均分子量小于500万，且优选大于100万，优选大于200万。透明质酸的分子量有时通过其密度进行表示，因为它们通过线性关系而相关。透明质酸可具有高达4.25m3/kg的密度，并且例如可被指定为具有低密度(例如，约1至2m3/kg)透明质酸或高密度(例如约2至4m3/kg)透明质酸。
根据一个替代实施方式，透明质酸是通过(例如用链球菌)发酵获得的。根据另一替代实施方式，它是通过从公鸡峰(rooster peak)中提取来生产的。
根据一个替代实施方式，该基质包括通过共价键交联的至少一种透明质酸。
因此，交联透明质酸包括在不同的透明质酸链之间的共价键。
不同类型的透明质酸(诸如不同分子量的透明质酸或不同的透明质酸盐)可以相互交联。
本发明还涉及制备交联羧烷基壳聚糖的方法。
根据一个替代实施方式，制备根据本发明基质的方法包括：
使羧烷基壳聚糖与至少一种交联剂接触，接触优选在碱性水性相中进行；
用交联剂交联羧烷基壳聚糖；以及
得到包括交联的羧烷基壳聚糖的基质。
根据一个替代实施方式，在碱性水性相中(例如在氢氧化钠(NaOH)溶液存在下)交联该羧烷基壳聚糖。
有利地，以羧烷基壳聚糖的重量相对于碱性水性相的体积计，初始存在于水性相中的羧烷基壳聚糖的浓度在1％-30％(w/v)的范围内，优选在5％-20％(w/v)的范围内。
有利地，以交联剂的重量相对于聚合物的重量来表示，交联剂和聚合物之间的质量比为0.1％-30％。
优选地，以交联剂的重量相对于聚合物的重量来表示，特别是当使用BDDE时，交联剂和聚合物之间的质量比为0.5％-20％。
通常，在加热(例如在25-60℃，例如50℃)下进行反应，持续例如30分钟至48小时，例如1小时至5小时的时间。通常，通过中和和稀释，例如通过加入酸，例如通过加入醋酸或盐酸，来停止交联。
有利地，使用磷酸盐缓冲液通过渗析去除反应残留物。
由此获得包括本发明基质的水凝胶。
另一方面，羧烷基壳聚糖是一种在植入/注射/滴注到体内后比透明质酸更耐降解的外源性分子。
因此，本发明涉及一种包括基于具有不同分子量的这两种聚合物的三维网络的基质。因此，有利地，提供了一系列生物力学特性、原位产物持续时间和治疗持续时间，同时保留了羧烷基壳聚糖清除自由基的能力。
本发明涉及一种包括至少一种透明质酸的基质，该透明质酸通过共价键与羧烷基壳聚糖共交联。
根据一个替代实施方式，制备包括与另外的生物聚合物(优选透明质酸)共交联的羧烷基壳聚糖(优选如根据本发明定义的羧烷基壳聚糖)的基质的方法，所述方法包括：
使羧烷基壳聚糖和其它生物聚合物(优选透明质酸)的混合物与至少一种交联剂接触，接触优选在碱性相中进行；
用交联剂交联羧烷基壳聚糖和其它生物聚合物(优选透明质酸)；
得到羧烷基壳聚糖和其它生物聚合物(优选透明质酸)的共交联基质。
根据一个替代实施方式，根据本发明的基质是无菌的。
提供来自根据本发明的基质的水凝胶是有利的。
因此，本发明涉及一种水凝胶，并且有利地形成一种内聚的水凝胶。
因此，本发明涉及交联羧烷基壳聚糖水凝胶，其中羧烷壳聚糖具有高乙酰化度(DA)(大于40％)，并且优选还具有高取代度(DS)(大于20％，优选大于50％，且通常地小于200％)。
本发明涉及一种组合物，该组合物包括至少一种根据本发明定义的基质。
根据优选的替代实施方式，在水性介质中配制根据本发明的基质以形成水凝胶形式的组合物。
有利地，以聚合物的质量相对于组合物的总质量(特别是水凝胶的总质量)(m/m)计，聚合物(有或没有其它生物聚合物(诸如透明质酸)的羧烷基壳聚糖)的浓度小于10％，例如小于或等于5％。
根据一个替代实施方式，以聚合物的质量相对于组合物的总质量(特别是水凝胶的总质量)(m/m)计，聚合物(有或没有其它生物聚合物(诸如透明质酸)的羧烷基壳聚糖)的浓度小于4％，例如小于或等于3％。
质量比(m/m)[羧烷基壳聚糖/透明质酸]为例如5％-95％，例如10％-90％，以及还例如30％-70％。质量比(m/m)[透明质酸/羧烷基壳聚糖]为例如5％-95％，例如10％-90％，以及进一步地例如30％-70％。根据一个替代实施方式，质量比(m/m)[羧烷基壳聚糖/透明质酸]为1:1(即50％壳聚糖和50％透明质酸)。
该水性介质可以是水、水性溶液，其pH和渗透度例如使用添加盐和/或可选的多元醇(山梨醇、甘露醇、甘油)的酸/碱缓冲体系进行调节。
根据一个替代实施方式，在水脂(hydrolipidic)介质中配制根据本发明的基质，使得形成单重或多重、直接或反向的乳液。
根据一个实施方式，该基质的组合物的渗透度为100mosm/kg-700mosm/kg，优选为120mosm/kg-500mosm/kg。
有利地，该基质的组合物的渗透度为250mosm/kg-400mosm/kg，优选为270mosm/kg-330mosm/kg。
根据一个替代实施方式，该基质的组合物具有适合于关节(joint)的渗透度。
根据一个替代实施方式，该基质的组合物具有与眼部或眼内表面相容的渗透度。
根据一个替代实施方式，该基质的组合物具有与真皮或粘膜相容的渗透度。
根据一个替代实施方式，优选该基质的组合物的渗透度在100mosm/kg至400mosm/kg之间，更具体地在120mosm/kg至380mosm/kg之间。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物是无菌的。
有利地，根据本发明的组合物容纳在注射、植入或滴注设备(例如注射器或小瓶)中。
有利地，注射设备(诸如注射器)例如然后可以经历蒸汽灭菌。这种设备(诸如注射器)然后可以优选地以灭菌的或无菌的方式被包装。它也可以是用于滴注根据本发明的组合物的袋、安瓿瓶(flapula)或小瓶，在对制剂灭菌后无菌填充这些袋、安瓿瓶或小瓶，或在填充后直接对这些袋、安瓿瓶或小瓶灭菌。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物，特别是根据本发明的水凝胶，在填充注射装置、植入装置或滴注装置(如注射器或小瓶)之前，通过过滤和/或蒸汽灭菌来灭菌。
本领域技术人员知道对水凝胶进行灭菌以获得所需无菌水凝胶的技术。他们具有用于加热或蒸汽灭菌的几种类型的设备，并且可以使用去除微生物负荷的几种类型的循环。
本发明更具体地涉及包括根据本发明的基质(优选以水凝胶的形式)的可注射组合物。
本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包括至少一种根据本发明的基质(优选以水凝胶的形式)。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物用作可注射的、可植入的或可滴注的药物组合物，或者可注射的或可植入的或可滴注的医疗设备。
本发明进一步地涵盖干燥形式的，尤其是冻干形式的根据本发明的组合物。冻干产品在使用前尤其可以被(再)分散，并且优选地被溶解。
本发明更具体地涉及根据本发明的组合物用于治疗性治疗中，该治疗性治疗例如包括通过皮下、皮内、眼内，或关节内、粘膜内、肌肉内途径注射所述组合物，例如以修复、再生或填充至少一种需要修复或填充的身体组织/液体。
对于预期的应用，使用具有足够纯度的壳聚糖是有利的。
使用纯度足以满足预期应用的透明质酸是有利的。
根据本发明的组合物所寻求的生物力学特性可根据适应症在性质幅度上变化，例如根据水凝胶将被整合在其中的组织、作用机制或旨在确保对患者有益的效果，和效果的持续时间在性质幅度上变化。
有利地，根据适应症调整根据本发明的组合物的特性，特别是根据本发明的水凝胶的特性。为了调整这些特性，尤其是通过交联剂/聚合物的质量比，和/或离子的性质和/或量，和/或聚合物的初始分子量，聚合物(羧烷基壳聚糖和/或其它生物聚合物(如透明质酸))的最终浓度和/或交联速率例如是变化的。
特别地，本发明涉及高弹性水凝胶(尤其是当必须确保在皮肤、皮下或骨膜处的体积持续增加(用于隆起或重塑)时)或粘弹性凝胶，尤其是以使得既能够减震又具有在关节处的润滑效果。尤其是当需要减少两个生物表面(例如关节中的两个软骨表面，或眼睛中的眼表和眼睑)之间的摩擦时，本发明涉及润滑水凝胶。本发明的组合物可具有根据适应症调节的可变的弹性水平，并且特征在于通过流变测定法测量弹性模量。
优选地，基质通过清除自由基而具有抗氧化能力，尤其是具有大于0.30，优选大于0.50，甚至更优选大于0.80，例如大于0.90的标准化的抗氧化能力。
本发明涉及一种可注射的组合物，其特征在于它包括至少一种根据本发明定义的基质。
本发明涉及一种药物组合物，其特征在于它包括至少一种根据本发明定义的基质。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物用作可注射的、可植入的或可滴注的、或可局部给药的药物组合物，或可注射的或可植入的或可滴注的、或可局部给药的医疗设备，例如用于治疗性治疗方法(例如包括通过皮下、皮内、粘膜、眼部、眼内、或关节内、骨内途径局部滴注或施用或注射所述组合物)，例如以修复或填充需要修复或填充的至少一个身体组织。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物用于治疗、修复或填充需要修复或填充的至少一种体液或身体组织的方法中，例如，该身体组织选自属于声带、肌肉、韧带、肌腱、粘膜、性器官、骨骼、关节、眼睛、真皮或它们的任意组合的组织，特别是真皮、软骨、滑膜、皮肤伤口，甚至眼表。
本发明涉及根据本发明的组合物用于治疗骨关节炎或修复软骨缺损的方法中，例如通过注射到生物流体(例如滑液)中，或在与生物流体(例如血液)混合后植入软骨中。生物流体是指身体来源的流体，该身体来源的流体经过或没有经过改变其组成的处理。
本发明涉及医疗设备(例如医疗植入物)，其特征在于它包括根据本发明定义的组合物或由根据本发明定义的组合物组成。
本发明特别涉及根据本发明的组合物用于治疗性治疗、手术治疗或整容治疗，特别是包括风湿病学、眼科、妇科、美容医学、整形手术、开放手术、骨科手术、妇科中的治疗以防止术后组织粘连，以及皮肤病学中的治疗。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗性治疗干眼症、角膜损伤或眼部或关节炎症。
本发明进一步涉及通过滴注在眼表上以预防或对抗角膜损伤或干眼症(特别是为了润滑或再生眼表的目的)的根据本发明的组合物的应用。
因此，本发明还涉及包括根据本发明定义的羧烷基壳聚糖的滴眼剂组合物。
根据一个替代实施方式，受试者患有炎性病症(例如骨关节炎、关节炎、干眼症)。
本发明更特别地涉及根据本发明的组合物用于治疗关节病、关节炎或修复软骨缺损，例如通过注射到滑液腔中或通过在软骨缺损处植入。
本发明更特别地涉及一种医疗设备，例如医疗植入物，其特征在于它包括根据本发明的组合物或由根据本发明的组合物组成。
根据一个优选的替代实施方式，本发明因此涉及一种医疗设备，该医疗设备包括容纳干燥形式(尤其是冻干形式)的根据本发明组合物的腔室，以及可选地包括容纳一种或多种活性产品、添加剂或赋形剂的一个或多个其它腔室。
根据本发明的组合物还可包括用于所需适应症的一种或多种活性剂，和/或用于调节根据本发明的组合物的特性的一种或多种添加剂或赋形剂。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗性治疗方法中。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗关节病或修复软骨缺损的方法中，例如通过注射到滑液囊中或在与血液混合后植入软骨/骨头中。
本发明还涉及根据本发明的组合物通过真皮填充(“真皮填充”)或唇部填充用于美容治疗或美容护理方法中。这尤其涉及例如皮下、皮内、粘膜内或肌内注射根据本发明的组合物。
本发明还涉及根据本发明的组合物，用于根据本领域技术人员公知的常规美索疗法对皮肤(通过多次皮内注射)或其他组织进行表层治疗的方法中。此类组合物通常可用于皮肤病学，作为用于美容目的的治疗。这种方法的目的是，例如，使皮肤丰满以使其外观没有皱纹(治疗皱纹和/或细纹)。这种治疗可以用于希望使他/她的皮肤恢复活力的外观的受试者。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗方法中，其中该组合物是黏性补充剂。此处，例如，关节内注射本发明的组合物，尤其以限制关节软骨表面的摩擦。
本发明还涉及根据本发明的组合物用作一种或多种细胞类型和/或一种或多种活性剂的细胞载体。从药学或生物学的角度来看，这些可以是活性剂。本发明的组合物确实可以与细胞，优选活细胞的存在相容。感兴趣的活细胞的例子包括：软骨细胞(关节软骨)、纤维软骨细胞(半月板)、韧带成纤维细胞(韧带)、皮肤成纤维细胞(皮肤)、腱细胞(肌腱)、肌成纤维细胞(肌肉)、间充质干细胞、红细胞(血液)和角质细胞(皮肤)。本发明的组合物还可以作为治疗载体，用于靶向递送和/或控释递送至少一种治疗剂。
根据一个替代实施方式，血液、或血浆、或血小板裂解物、或富含血小板的血浆、或任何生物流体与本发明的组合物一起加入，例如用于提高产品的性能。
根据一个替代实施方式，根据本发明的组合物被配制成固体形式(例如，膜或多孔泡沫)，其一旦被植入(例如，泪道栓塞、敷料)就会膨胀/润湿。
根据一个替代实施方式，组合物被配制成可雾化组合物(喷雾剂)的形式。
本发明还涉及根据本发明的组合物，用于治疗或整容护理受过高温度影响(如在烧伤的情况下)的一种或多种组织或器官的方法中。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗软骨修复(例如，通过植入在软骨缺损上以促进其再生)的方法中。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于预防性治疗手术后组织粘连的方法中，将该产品在手术(例如妇科、腹部、内脏、骨科等)结束时施用于组织上。
本发明涉及一种生理组合物，该生理组合物通过注射或植入进行局部给药，以与经受过氧化应激的一个或多个活组织接触，例如：
-关节内注射(通过滑液补充、软骨润滑、关节处的减震、滑膜再生)以治疗骨关节炎；关节内植入以促进软骨缺损修复；
-骨内植入以促进骨修复(骨诱导/骨传导)；
-皮下和/或皮内注射，用于填充或再生皮肤或毛囊，以在脂肪萎缩的情况下增加体积；
-眼部滴注以缓解眼表症状或预防改变，例如治疗干眼症和角膜病变，以及施用活性成分；
-眼内注射，例如，作为白内障手术的佐剂，用于优化青光眼手术或玻璃体补充的效果，以使前部或后部眼组织再生，以及眼内施用活性成分；
-施用在内部组织和器官(膜)上，以防止术后粘连；
-施用在诸如皮肤、骨骼、软骨、角膜、肌腱、半月板……的组织和器官的伤口、裂缝、撕裂、空洞……上，以促进它们的修复或再生；
-注射到外阴粘膜用于治疗外阴痛。
本发明还涉及形成人工滑液的根据本发明的组合物。
通过寻求例如改善其润滑能力以减少关节处的摩擦和/或其减震特性(可通过弹性模量G'确定)，根据本发明的组合物可以模拟健康滑液或改善健康或有缺陷的滑液，同时易于注射，例如以填充注射器，或注射到人体或动物体内。作为指征，健康滑液的弹性模量G'在40～100Pa之间，其损耗模量G\"在1～10Pa之间。
有利地，对于关节内注射，根据本发明的组合物易于在室温下通过细针(例如21号直径的针)注射。“易于”注射优选是指施加在这类注射器上的力小于50牛顿(以10mm/min的速度)来使根据本发明的组合物流过21号针头，优选地力小于20牛顿。
有利地，对于皮内注射，根据本发明的组合物易于在室温下通过细针(例如25号或更小直径的针)注射。“易于”注射，优选地是指施加在这类注射器上以喷射到空气中的力小于30牛顿(以10mm/min的速度)来使根据本发明的组合物流过27号针，优选地力小于20牛顿。
本发明还涉及包括根据本发明的羧烷基壳聚糖的作为人工泪液的组合物。
通常，该组合物的渗透度和pH值的范围是适合的，并且通常接近与根据本发明的组合物接触的组织的渗透度和pH值。
有利地，根据本发明的组合物是无菌的。非常有利地，通过升温对根据本发明的组合物灭菌，优选在高压釜中灭菌。
根据一个实施方式，根据本发明实施例的试验，基质具有低摩擦系数(COF)(例如小于20，以及例如小于10)的润滑能力。
根据一个替代实施方式，本发明的组合物是透明的或半透明的。
“半透明”是指当其组合物置于观察者的眼睛和物体之间时可以识别出该物体。“透明”是指当组合物置于观察者的眼睛和所观察的字符之间时，可以识别出字母数字字符。一般来说，在组合物厚度约为1cm的情况下进行这种评估。也可采用欧洲药典专论2.9.20用于目视检查的方法。也可以测量组合物的光密度，例如通过UV-可见光谱法在500nm处测量，并确保光密度相对于参比溶剂小于0.5，优选小于0.2。
根据一个替代实施方式，本发明的组合物不呈乳白色或仅呈轻微乳白色。
“乳白色”是指：例如通过根据诸如欧洲药典专论2.9.20的方法的目视检查并通过与欧洲药典的不同乳光水平的参比溶液进行比较，溶液产生肉眼可见的光衍射。根据一个替代实施方式，本发明的组合物是无色的，即特别地，肉眼观察者不会为组合物指定特定颜色。根据一种替代实施方式，乳光低于预期应用所容许的最大限度。
本发明特别涉及优选地无菌的制品或包装，其包括一个或多个预先填充有根据本发明的组合物(特别是水凝胶形式的组合物)的滴注或注射设备。这些通常是用于以滴剂或预填充注射器的形式滴注产品的设备。
本发明的组合物可以有利地被储存，优选地被储存在适合其适应症的制品或包装中，并且优选地被储存数月。
有利地，可以对本发明的组合物进行灭菌。因此，本发明涉及一种经灭菌的交联羧烷基壳聚糖。因此，该交联羧烷基壳聚糖是无菌的，尤其是用于需要它的应用中。
根据一个替代实施方式，根据本领域技术人员已知的和/或欧洲药典推荐的方法，对本发明的组合物进行蒸汽灭菌。
根据另一个替代实施方式，可以使用用于此目的的过滤器(例如孔隙小于或等于0.2μm的过滤器)通过过滤来对组合物进行灭菌。
有利地，根据一个优选的实施方式，在蒸汽灭菌后，交联羧烷基壳聚糖的特性粘度的损失小于40％。
本发明还涵盖用于治疗性治疗的方法，该方法包括注射根据本发明的组合物。
本发明还涵盖根据本发明的组合物用于制备药物组合物(特别是用于治疗性治疗，例如如本发明更具体地定义的)的用途。
本发明还涵盖了一种用于美容(换言之，非治疗性)治疗的方法，该方法包括注射根据本发明的组合物。这是，例如，为了美容的目的而填充皱纹或填充(例如由于事故或外科手术而导致的)一个或多个损坏的可见组织区域。
组织是聚集在功能单元中、相同来源的相似细胞的群组，即它们都有助于相同的功能。在这些组织中可以提及：真皮组织(例如上皮组织)、结缔组织、肌肉组织和神经组织。
“根据本发明的组合物”或等效术语是指如本发明中定义的组合物，独立地或以其任意组合的方式包括根据任一替代实施方式、具体的或特定的实施方式所述的组合物，包括根据优选特征的组合物。
在阅读解释性说明后，本领域技术人员将更清楚本发明的进一步目的、特征和优点，该解释性说明参考了仅用于说明目的而绝不用于限制本发明范围的实施例。
这些实施例是本发明的组成部分，并且根据整个说明书(包括实施例)，相对于任何现有技术具有新颖性的任何特征在其功能和通用性方面都是本发明的组成部分。
因此，每个实施例都有通用的范围。
另一方面，在实施例中，除非另有说明，所有百分比均以质量为单位，且除非另有说明，温度以摄氏度表示，并且除非另有说明，压力为大气压。
实施例
ζ电势的测量方法
将待分析的制剂稀释在磷酸盐缓冲液中，以获得0.05％的聚合物的最终浓度，然后缓慢地搅拌直到均质化。接着将溶液分成多份，并且通过加入0.1N的氢氧化纳或0.1N的盐酸将每份的pH调节至所需的值(pH 4至pH 8)。利用“Nano-Z”装置(Zeta-Sizer系列，马尔文仪器)来测量每份的ζ电势。
壳聚糖聚合物的溶解度范围的测量方法
通过制备浓度为1％和pH为9的待测聚合物溶液，通过将其分成若干份及将每份的pH调节为9至1的范围内不同的pH值，来确定溶解度范围。对于每一份，根据欧洲药典专论2.9.20的目视检查方法检查聚合物的溶解度，即其不形成浑浊。记录聚合物可溶或不可溶的pH范围。
通过流变测定法测定生物力学概况
在37℃的温度、3.98rad/s的频率、0.1％至10％范围的变形幅度下，使用配备有与珀尔帖间隔700μm的20mm平面几何体的DHR-2混合型流变仪(TA仪器)对样品的生物力学概况进行表征。每次测量进行三次，然后计算这三次测量的弹性模量(G')、粘度(G\")和tanδ(G\"/G')的平均值。
润滑能力
通过两个表面之间的摩擦系数(COF)表征润滑能力。根据下列方法进行摩擦系数的测量，根据预期的产品和适应症选择该方法的参数。
用于粘度补充剂的方法
基于用于制造疏水眼内透镜(如专利EP 1830898中所述)的聚丙烯酸酯生物材料的两个盘(直径为16.15毫米)通过在60℃的水中浸泡约2小时来进行预先润湿，然后固定在DHR-2流变仪(TA仪器)的上下几何体上。将大约100μL体积的待测样品放置在下盘上，然后降低上几何体直到两盘之间接触，施加的法向力达5牛顿。根据改编自Waller等人描述的方案(参见：J 47Rheumatol 39,7,1473,2012)的方案，在恒定的法向力(5N)，1.256rad/s的振荡频率，约0.05弧度的变形角下，在25℃下进行摩擦系数测量，持续时间为150秒。激活选项“遵守振荡运动的零起点”。在每个测量点，记录扭矩值，然后根据以下公式计算摩擦系数(COF)：COF＝扭矩/(1/3×盘直径×法向力)。对于每种制剂，重复5次测量。通过在每个COF相对于时间曲线的开始处的截距(COF0)的外推5来报告摩擦系数的值。
用于人工泪液的方法
基于用于制造疏水眼内透镜(如专利EP 1830898中所述)的聚丙烯酸酯生物材料的两个盘(直径为16.15毫米)通过在60℃的水中浸泡在约2小时来进行预先润湿，然后固定在DHR-2流变仪(TA仪器)的上下几何体上。将大约100μL体积的待测样品放置在下盘上，然后降低上几何体直到两盘之间接触，施加的法向力达5牛顿。根据改编自Waller等人描述的方案(参见：J 47Rheumatol 39,7,1473,2012)的方案，在恒定的法向力(5N)，1.256rad/s的振荡频率，约0.05弧度的变形角下，在25℃下进行摩擦系数测量，持续时间为150秒。激活选项“遵守振荡运动的零起点”。在每个测量点，记录扭矩值，然后根据以下公式计算摩擦系数(COF)：COF＝扭矩/(1/3×盘直径×法向力)。对于每种制剂，重复5次测量。通过在每个COF相对时间曲线的开始处的截距(COF0)的外推5来报告摩擦系数的值。
经由针的弹射力
使用配备100N压缩单元的MultiTest 2.5-i压缩测试仪(Mecmesin)进行测量。将合适的针适配到包含样品的注射器。将注射器定位在测试仪上，以恒定的速度(例如10mm/min或80mm/min)推动注射器的活塞，测量弹射所需的力。该装备所能承受的最大力约为70牛顿。
体外抗氧化能力(ABTS试验)
为了测量羧烷基壳聚糖制剂的抗氧化活性并将其与商业化产品进行比较，进行了体外‘ABTS’试验。该试验在于测定物质捕获2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS·1)阳离子自由基的能力，其为一种以阳离子自由基形式最大吸收位于波长734纳米处的发色团。使用Nunclon 96型聚苯乙烯微板(Thermo Fisher Scientific)和英菲尼特M200微板阅读器(Tecan Life Sciences)，进行改编自Valyova等人(Int J Applied Res Nat Prod,5,19,2012)描述的方法的方案，以测量吸光度。
每个试验系列分4个步骤进行。
1)将1g 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)稀释在K2S2O8的均质溶液中(2.45mM在MilliQ水中)以获得7mM ABTS的浓度。将该混合物避光并在室温下搅拌24小时，需要此时间来产生适量的ABTS·1自由基阳离子。通过取600μL搅拌后的混合物并将该量稀释在MilliQ水中至415μM的浓度，来最终获得ABTS·1工作溶液。
2)通过与参比抗氧化分子(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)Trolox比较，建立自由基清除能力的校准曲线。通过在MilliQ水中稀释15mg Trolox在5mL 100％甲醇中的原液，获得浓度为30、60、90、120、150、180和210μM的Trolox溶液。在将50μL ABTS·1工作溶液和50μL的每种Trolox溶液混合后1小时，在波长734nm处进行吸光度测量。读出线性区中吸光度与Trolox浓度之间的关系。线性区中的最小吸光度值对应于检测限。
3)待测产品或者在其初始浓度下原样被表征，或在MilliQ水中被稀释(根据待测产品来决定，以使得具有ABTS·1溶液的混合物的吸光度高于检测限)。将50μL的工作溶液和50μL的测试产品溶液混合。室温下孵育1小时后，在波长734nm处测量吸光度。如果吸光度值在仪器的检测范围内，则保留该值并通过校准曲线计算Trolox当量，表示为“trolox当量抗氧化能力”TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity)。
4)使用阳性对照以标准化的方式表示一个系列到另一个系列的抗氧化能力，该阳性对照为0.02mg/mL(20μg/mL)的溶液中的抗坏血酸(维生素C)。首先，测量0.005-0.05mg/ml的抗坏血酸溶液的TEAC。经验证，0.02mg/mL抗坏血酸溶液的吸光度在线性区。最后，通过TEAC(产品)/TEAC(0.02mg/mL的抗坏血酸)的比率表示被测试产品的标准化抗氧化能力。
实施例1
使用以示例的方式给出的表1a中的反应参数，根据以下方法经由羧甲基化和乙酰化反应制备羧甲基壳聚糖。此外，还可以使用其它反应参数来调节羧甲基壳聚糖的分子结构。
步骤1：壳聚糖的羧甲基化。
将双孢蘑菇Agaricus bisporus来源的30g壳聚糖分散在600ml异丙醇、41ml水和163ml50％氢氧化钠(m/v)中。将135g烷基化剂一氯乙酸(MCA)溶解于135ml异丙醇中，并加入到壳聚糖悬浮液中。在35℃下持续反应23小时。通过在乙醇中沉淀来回收聚合物，然后通过在水中溶解和在乙醇中沉淀的数次循环来纯化该聚合物。在通风烘箱中干燥后，收集羧甲基壳聚糖(参考号CC4，表1b)。
步骤2：羧甲基壳聚糖的乙酰化。
将21g质量的CC4分配到570ml水中，并调节溶液的pH值至pH>7。加入体积为10ml的乙酸酐，并将溶液在25℃下搅拌30分钟。将溶液的pH值调节至pH>7，然后加入10ml酸酐。在均质化后(室温下搅拌约30分钟)，将pH值调节至约pH 7.5。通过在乙醇中沉淀来回收聚合物，然后通过在水中溶解和沉淀的数次循环来纯化该聚合物。在通风烘箱中干燥后，收集羧甲基壳聚糖(参考号CC3，表1b)。
表1b中描述了用于制备实施例2-11的基质的羧甲基壳聚糖。CC1到CC6是由源自真菌壳聚糖的羧甲基壳聚糖，并且是根据上述方法制备的。
CC7是由Kraeber公司提供的商业化的源自甲壳类动物的羧甲基壳聚糖(产品代码5313009900，埃勒贝克，德国)。
[表1a]
[表1b]
a：通过固相碳-13NMR测量(式2)；b：通过电位滴定测量；c：通过毛细管粘度法测量；d：通过碳-13NMR不能检测到乙酰基基团信号(低DA)。
实施例2—羧甲基壳聚糖的基质
使用交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(CAS 245-79-8，BDDE)通过共价交联进行合成试验以提供羧甲基壳聚糖的基质。使用根据实施例1的方法由考麦德制药公司生产的双孢蘑菇Agaricus bisporus来源的几种羧甲基壳聚糖。它们的特征见表1。BDDE(96％，比重1.049)由Alfa Aesar阿法埃莎(赛默飞世尔，坎德尔，德国)提供。
实施例2a
在调整反应参数后，由羧甲基壳聚糖CC3制备交联基质(表2a，参考号M1-A)。通过碳-13NMR(式2)测量，CC3的乙酰化度为55％，羧甲基化度为87％。渗析后，将由基质形成的水凝胶转移到3ml玻璃注射器中，该玻璃注射器经过了在SYSTEC-DX-65高压釜中短循环(条件“A2”)蒸汽灭菌。通过质量平衡确定所得经灭菌的水凝胶(M1-A)的最终聚合物浓度。通过水试验分析水凝胶的内聚特性，通过流变测定法测定水凝胶的粘弹性水平(等级为1-4)。分数越高，形成水凝胶的基质的粘弹性越大。得出的结论是，在调整反应参数后，可以获得BDDE交联的羧烷基壳聚糖的基质，根据水试验该基质形成内聚水凝胶。该水凝胶的弹性分数为1。它可以通过皮内针(27G 13毫米)注射。
然后将这些相同的反应参数应用于不同分子结构且乙酰化度低于40％(表1b)的两种羧甲基壳聚糖：真菌来源的CC4(考麦德制药公司)和甲壳类动物来源的CC7(Kraeber)。
[表2a]
*A2：短循环(SYSTEC DX-65高压釜)；**弹射速度为10mm/min时，弹射力小于30牛顿。
根据水试验，在与基质M1-A相同的条件下分别获得的基质M1-B和M1-C(表2a)没有形成内聚水凝胶。相反，基质M1-A能够形成内聚水凝胶，从而满足本发明的这一目的。
实施例2b
进行尝试以调节交联羧烷基壳聚糖基水凝胶的生物力学特性，特别是它们的粘弹性(在0到4的等级内测量)。为此，通过改变羧烷基壳聚糖的分子量(以特性粘度表示)和交联反应的参数，由DA大于40％的CC1、CC5和CC6(表1b)制备基质。交联剂(BDDE)、介质、温度和反应时间以及中和与纯化条件皆与基质M1-A的相同。
[表2b]
*A2：短循环；A1：长循环
表明可以通过改变反应参数(特别是羧烷基壳聚糖的初始浓度或交联剂/羧烷基壳聚糖的比例，此处为BDDE/羧甲基壳聚糖)以及羧烷基壳聚糖的分子量来改变交联羧烷基壳聚糖基水凝胶的生物力学特性，尤其是粘弹性。
实施例3—共交联的羧甲基壳聚糖和透明质酸的基质
通过采用BDDE交联真菌来源且DA大于40％(表1b)的羧甲基壳聚糖和透明质酸的混合物(“共交联”)来获得基质。使用平均粘度分子量为2.2或2.3百万(HA1类型)和4.3百万(HA2类型)的透明质酸(HA)(表3a)。
[表3]
*供应商报告的值
交联反应的试剂(BDDE)、介质、温度和持续时间，以及中和与纯化条件与实施例2的基质M1-A的相同。根据循环A1或A2，如实施例2中所述通过高压釜对由基质形成的水凝胶进行灭菌。由于其它组合和/或参数也可能产生内聚水凝胶，因此以示例说明的方式描述了几种水凝胶。通过尺寸为27号、长度为13毫米的皮内针可以轻易地注射所有这些水凝胶。
实施例3a
试图证明可以将羧烷基壳聚糖(CC)与透明质酸(HA)共交联以形成内聚的水凝胶。为此，以75:25的CC/HA质量比(表3a)，由CC和HA的混合物制备基质。CC的参考号与前面的实施例一致。此外，通过调整交联反应的参数，试图将弹性水平从1调节到3(基于0到4的等级)。
[表3a]
*实施例2的条件
观察到：在相同的BDDE/聚合物比例(18％)和相同的最终聚合物浓度23mg/m下，与25％HA共交联的CC的水凝胶M2-B比实施例2中仅CC的水凝胶M1-A更有弹性。还可得出结论：通过改变HA的分子量、交联剂(此处为BDDE)的百分比，可以改变共交联的羧烷基壳聚糖和HA的水凝胶的粘弹性。
实施例3b
试图由以不同的比例共交联的羧烷基壳聚糖和HA来获得内聚水凝胶。
[表3b]
表明可以获得羧烷基壳聚糖和HA以不同比例共交联的内聚水凝胶，并且它们的弹性水平取决于羧烷基壳聚糖/HA的比例。
实施例4—与透明质酸相结合的交联羧甲基壳聚糖的基质
在此实施例中，试图评估由与HA相结合的交联羧烷基壳聚糖的基质形成内聚水凝胶的可能性。根据实施例1的方法首先采用BDDE交联羧烷基壳聚糖，然后向其中加入HA(HA1类型)溶液。然后经由循环A2通过高压灭菌对所得水凝胶进行灭菌。(表4)。
[表4]
很容易将HA掺入基于交联羧烷基壳聚糖基质的水凝胶中。根据水试验，所得水凝胶是内聚的，且粘弹性得分为3，同时易于通过27号皮内针注射。
实施例5—水凝胶的生物力学特性
在此实施例中，通过流变测定法对来自实施例2到实施例4的一些代表性CC水凝胶的生物力学特性进行表征(表5)。水凝胶是内聚的，可通过27G针注射，且具有1到3的弹性水平。将它们与用于皮内注射以达到美容目的的三种商业化交联透明质酸基产品进行比较(表5，参考号B1到B3)：根据水试验，B1是粘稠溶液(tanδ>1)，B2和B3是内聚的凝胶(tanδ<1)。
[表5]
证实了根据本发明的交联羧烷基壳聚糖基水凝胶具有可与用于美容医学皮内注射的商业化的交联HA基产品相媲美的生物力学特性，特别是弹性模量(G')。
实施例6—清除ABTS°1自由基的能力(体外)
试图使用称为“ABTS”的标准体外测试来验证交联羧烷基壳聚糖(CC)的基质能够清除氧化自由基，其中形成自由基ABTS°1并用抗氧化物质“Trolox”进行校准。将每个测试产品稀释以获得8mg/mL、4mg/mL和1mg/mL的聚合物Cp(CC、HA或CC和HA)的总浓度。核查结果以确保其在测试的检测区域内，然后以Trolox当量表示清除自由基ABTS°1的能力。还测量了20μg/mL抗坏血酸溶液(阳性对照)的抗氧化能力。按以下公式将每种被测试产品的抗氧化能力标准化：标准化抗氧化能力＝TEAC(产品)/TEAC(抗坏血酸20μg/mL)。
为了比较，测试了溶液中非交联羧烷基壳聚糖聚合物(CC2)和基于非交联HA溶液的商业化产品(参考号B6)。也表征了以美容为目的用于皮内注射的4种商业化产品：参考号B1至B3(仅基于交联HA，参见实施例5的表5)和B4(基于交联HA与包括抗氧化分子在内的几种小分子的复合物相结合的水凝胶)。
表6报告了所有产品在相同的聚合物总浓度(Cp)4mg/mL下获得的结果。
[表6]
观察到：无论是非交联CC的溶液(S1)还是交联CC的水凝胶(M1-E和M2-A)，所有CC-基组合物都能够显著清除自由基ABTS°1，因此可以用作抗氧剂。在相同的聚合物浓度下，仅有商业化HA的产品(B6、B1、B2和B3)没有表现出这种能力。
令人惊讶的是，水凝胶M1-E(CC)和M2-A(CC/HA 75:25)在所有测试产品(包括与未交联CC的溶液S1相比)中表现出最高的抗氧化能力。两种水凝胶都具有与20μg/ml的抗坏血酸相似的抗氧化能力。
在商业化HA基产品中，只有B4能够显著清除自由基ABTS°1，但其清除自由基ABTS°1的能力仅为M1-E和M2-A清除自由基ABTS°1的能力的一半。事实上，B4是与几种小分子的复合物相联合的交联透明质酸，这些小分子中包括抗氧化剂，该抗氧化剂是所观察到的效果的原因所在。然而，由于这些物质是水溶性小分子，因此很可能在皮内注射后它们会迅速扩散出B4水凝胶，然后水凝胶将失去其抗氧化能力。
实施例7—水凝胶在体外真皮细胞培养中降低氧化应激的能力
在标准体外测试中评估基于交联CC(参考号M1-E，参见实施例2)和共交联CC/HA(M2-A，参见实施例3)的两种水凝胶保护人类真皮细胞免受“ROS”(活性氧)自由基(其是氧化应激下皮肤组织中遇到的自由基物种)引起的损伤的能力。将其与非交联羧烷基壳聚糖溶液和以美容为目的用于皮内注射的基于交联透明质酸的商业化产品(参考号B3，参见实施例5)进行比较。
在含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基，Dulbecco's Modified Eagle Medium)中，在37℃和5％CO2气氛中以单层培养约40％的体外增殖潜能的人真皮成纤维细胞(NHDF)。将培养物转移到不含胎牛血清的DMEM中，然后分入孔中。将待测产品在DMEM中稀释至聚合物的总浓度为0.6和0.2mg/mL，然后加入孔中(每个待测产品加入到3个孔中)。与待测产品接触72小时后，加入在自由基作用下发荧光的2'-7'-二氯-二氢荧光素二乙酸酯探针30分钟。然后用HBSS冲洗每个孔中的培养物以去除待测产品，将细胞放回HBSS，然后用12.5J/cm2的UVA照射所有孔20分钟以产生ROS。
使用未经处理、未经辐照的培养物作为参照物。未经处理和辐照的培养物用作阴性对照，抗坏血酸处理(50μg/mL)和辐照的培养物用作阳性对照。在UVA照射结束时，测量与ROS含量成正比的荧光强度(激发波长485nm，发射波长520nm)，然后计算相对于未经辐照的参照物的相对ROS含量(表7)。然后计算相对于未经处理和未经辐照的对照的ROS含量的降低，该降低表征产品降低氧化应激的能力。
[表7]
*用于细胞处理的聚合物(CC、CC/HA或HA)的总浓度
在本试验的体外培养条件下，可以得出结论，CC基的组合物，无论是交联的(M1-E)还是非交联的(S2)，都具有良好的降低ROS含量的能力，即降低可能会改变细胞和真皮组织的氧化应激。该能力与抗坏血酸(50μg/mL，维生素C)的能力处于相同水平，且远高于商业化交联HA产品。含75％的CC，共交联的CC/HA的组合物M2-A也具有良好的降低氧化应激的能力。
实施例8—用于眼部给药的基于羧烷基壳聚糖基质的流体水凝胶
在此实施例中，试图获得交联CC水凝胶，其粘度使其易于以清晰(well-defined)的液滴的形式滴注，同时具有适用于人工泪液适应症的良好润滑能力以用于眼表处理。
为此，通过将动态粘度的目标定在1到60mPa.s的范围(在10s-1的剪切速率下)来制备内聚的交联CC水凝胶(M8-B，表8a)。验证其可滴注性，并根据人工泪液的方法测量其在两个聚丙烯酸酯表面之间的润滑能力，以摩擦系数表示。
将该水凝胶的特性与用于眼表处理的基于非交联HA的两种商业化产品(参考号B7和B8，表8b)的特性进行比较。在与M8-B相同的测试系列中测量它们的润滑能力。
[表8a]
[表8b]
得出的结论是，可以获得内聚的、流体的且可滴注的交联CC水凝胶，该水凝胶具有与用于眼表处理的商业化产品相当的润滑能力。
实施例9—对兔子皮内植入后的局部效应(短期)
通过对兔子皮内给药进行评估三种基于CC基质的水凝胶：M1-A(交联的CC，参见实施例1)、M2-A和M2-B(共交联的CC/HA，参见实施例2)。将这些制剂装在1mL玻璃注射器(Hypak，BD医疗)中并进行灭菌。根据欧洲药典的方法D-专论EP 2.6.14测定的内毒素含量是令人满意的。还评估了以美容为目的用于皮内注射的基于交联透明质酸的两种商业化产品(B1和B2，参见实施例5)。
根据满足用于评估由皮内植入物诱发的原发性刺激的ISO10993-10标准的方案，用直径为27G的针通过皮内注射对兔子施用200μL体积的制剂。对六只兔子进行了共十二次的注射/每种产品。每天观察所有注射部位的局部效应，特别是红斑水平。
表9报告了注射后7天的平均红斑水平(评分等级为0到4)。还要注意在7天时是否可见丘疹(评分等级为0到4)。注射后7天实施安乐死的动物的注射部位的宏观分析或微观分析(皮肤组织学)用于评估产品的存在。
[表9]
水凝胶的皮内注射与轻度局部效应的出现有关，其特征是在7天时红斑平均的最大评分为1(等级为0到4)。这对应于轻度红斑水平，与针对两种商业化产品所观察到的相当。此外，在第7天对动物实施安乐死并进行组织学分析后，证明了真皮中存在产品。
实施例10—用于关节处粘性补充的水凝胶
在此实施例中，评估了基于交联CC(M1-E)和共交联CC/HA(M2-B)的两种水凝胶的粘弹性和润滑能力，并与通过关节处粘性补充用于治疗骨关节炎的基于交联HA的两种商业化产品(B9和B10，参见表10中的组成)的粘弹性和润滑能力进行了比较。根据用于粘性补充的方法，通过它们降低安装在流变仪上的两个聚丙烯酸酯聚合物盘之间的摩擦系数的能力，测定了水凝胶的润滑特性。
[表10]
*标准偏差高，表明两个表面之间的摩擦力大(被测试产品的润滑能力低)；**聚合物的总浓度
观察到：交联的CC和共交联的CC/HA水凝胶的弹性模量G'与B9的弹性模量的范围相同，而B10的弹性模量更高。观察到：CC和CC/HA水凝胶都表现出的显著的润滑能力(特征是两个表面之间的摩擦系数低)，与交联的HA粘度补充剂B10的润滑能力相当，并且优于交联的HA粘补剂B11的润滑能力。
在实施例11至14中，使用的聚合物CC和HA是表11a和表11b中描述的那些。
[表11a]
a：根据起始壳聚糖的DA进行评估的值：b：根据碳-13NMR测量的乙酰化后的CC的DS进行评估的值；c：通过固相碳-13NMR(式2)测量的。
[表11b]
实施例11—HA与乙酰化度小于40％的CC的共交联测试
试图验证是否有可能使用与实施例3的表3a中相同的条件，从具有小于40％的DA的CC(CC8，表11a)和HA1类型的HA(表11b)开始，通过共交联CC和HA获得内聚的水凝胶。所得制剂(参考号M2-I)的条件和特性记录在了表11c中，并与(根据发明的)实施例3的参考号为M2-A的水凝胶的条件和特性进行了比较。
观察到，如通过δ正切值(tanδ，由流变测定法测量)所确定，采用CC8，通过共交联和高压釜灭菌不会获得凝胶。实际上，M2-I制剂包括高于1的tanδ值1.6，表明是粘稠溶液的行为而不是凝胶的行为。相反，根据本发明，水凝胶M2-A的tanδ值为0.4，即小于1，表明是凝胶的行为。
[表11c]
*因为获得的制剂不是凝胶，所以水试验不适用。
实施例12—用于体积恢复或填充大的皮肤凹陷的水凝胶
此实施例示出了基于交联的CC的水凝胶通过皮下注射或注射到真皮的深层用于恢复面部体积或填充大的皮肤凹陷的用途。对于这两个适应症，寻求粘弹性水平为4的水凝胶，即水凝胶的弹性模量G'为约150Pa以上，同时水凝胶根据水试验是内聚的且易于通过直径为27号、长度为13mm的针注射。在这些适应症中，将两种商业化产品B11和B12(表12)作为参照，其中B11和B12是基于弹性水平为4的交联透明质酸的内聚的水凝胶。
通过用13％的BDDE使CC5和HA1类型的HA(CC/HA比例为25:75)在室温下共交联过夜来获得水凝胶M2-J。它具有295Pa的弹性模量(对应于所需弹性水平4)，同时保持内聚且易于注射，符合用于预期适应症的期望(表12)。
[表12]
实施例13—皮内注射共交联的CC/HA水凝胶1个月时间后的体积保持
根据实施例12的反应条件，通过共交联CC9(见表11a)和HA2制备水凝胶，其中CC/HA质量比为40:60。将得到的水凝胶(参考号M2-K)装入在1mL的玻璃注射器(Hypak，BD医疗)中并以与实施例9相同的方式进行灭菌。其聚合物的最终浓度为23mg/mL，且其是内聚的，可通过27G针注射，粘弹性水平为3。
根据类似于实施例9的方案，通过27号针将相同体积的水凝胶M2-K和商业化产品B12(参见表12，粘弹性水平为4)皮内注射到兔子体内。注射后在26天的时间内定期地评估局部反应，然后通过在0到4的等级内进行评分来评估由注射产品形成的在皮肤表面可见的丘疹的体积。丘疹的体积表明产品的存在以及它局部地增加皮肤组织体积的能力。
两种产品的注射在随访期间均未引起任何显著的局部反应。两种产品注射后，立即形成平均体积评分为3±0(在评估的20个注射部位中)的丘疹。在接下来的几天里，丘疹稍微消退，但实际上仍然存在。注射后26天，丘疹仍然存在，M2-L的丘疹体积的平均评分等于2.0±0.0，B12的丘疹体积的平均评分等于2.4±0.5(评估的20个部位)，这与它们的相对弹性水平一致。在这个时间点，水凝胶M2-K和B12提供的体积评分之间的差异并不显著。
因此，证实了对兔子进行皮内注射后至少26天的持续时间内，水凝胶M2-K实际上仍然存在于真皮中，且在其注射部位周围保持显著的增加体积的效果，正如对填充皮肤凹陷的适应症的预期。
实施例14—共交联的CC/HA水凝胶的保存
通过将共交联的CC/HA水凝胶置于40℃烘箱中的加速老化条件下并监测其生物力学特性的过程来评估保存其的可行性。只要水凝胶根据水试验仍然是内聚的且易于注射的，从生物力学的角度来看它被认为是可接受的，其包含凝胶状行为(tanδ值低于1)并且其粘弹性水平相对于t0时的初始水平保持不变，并符合预期的适应症。
为了获得为2的粘弹性水平，根据实施例12的反应条件通过以70:30的CC/HA比例共交联CC9(见表11a)和HA2来制备参考号为M2-L的水凝胶。这是以与实施例9相同的方式包装在1mL玻璃注射器(Hypak，BD医疗)中且经灭菌的产品。将注射器置于40℃的烘箱中6个月。表13给出了在3个月的储存时间时测量的特性。
[表13]
在40℃的加速老化条件下3个月后，产品M2-L仍然保持是水凝胶(因为tanδ<1)并且保持了其内聚性、易于注射性和粘弹性水平为2。因此，通过外推法来估计，在室温下这种共交联的CC/HA水凝胶应该能够保持对于预期适应症可接受的特性至少12个月。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
