具有硫胺素的二氢槲皮素制剂的制作方法

1.本发明涉及作为用于口服施用的剂型、特别是作为膳食补充剂的具有硫胺素的二氢槲皮素(taxifolin)的制剂。


背景技术：

2.酒精中毒和与其相关的损伤、以及饮酒后第二天的副作用是难以控制的广泛存在的问题。这是部分地由于饮用酒精(乙醇)的复杂作用机制。与例如作为非常小的分子的苯二氮平类(benzodiazepines)不同，酒精能够在负责受体的各种结合位点处发挥其作用。特别地，gabaa受体负责大部分的酒精作用。该亲离子型受体由五个亚基组成(两个α，两个β，一个γ/δ/ε/θ/π)，其中由δ亚基分别与两个α4或α6和两个β3亚基组合组成的紧张性受体对乙醇的反应特别敏感。


技术实现要素：

3.基于类黄酮二氢槲皮素的结构，某些类黄酮对饮酒具有积极效果，特别是在神经损伤以及例如宿醉症状等酒精相关的后遗症方面。这是由于与乙醇-敏感性gabaa受体的相互作用，由此首次发现这些类黄酮特异性地起到负调节剂的作用。为了该目的，类黄酮分别地以与β-环糊精的复合物的形式使用，或作为基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体使用，因为令人惊讶地，仅在这种制剂中可以发现显著的效果。
4.现在令人惊讶地，发现可以通过添加硫胺素来显著改善口服形式的营养应用。
5.硫胺素也称为维生素b1，以辅因子焦磷酸硫胺素(tpp)的形式，在例如糖代谢等重要代谢过程中起作用。目前已发现硫胺素和二氢槲皮素的组合提供显著的优点，其中两点在这方面起到重要作用。
6.首先，在饮酒之前、之后、或期间，硫胺素和二氢槲皮素的施用具有协同作用，特别是关于酒精相关的后遗症。这是由于分别地作为α-酮戊二酸脱氢酶复合物的组分的硫胺素或tpp的效果与二氢槲皮素的效果的组合。
[0007][0008]
如果硫胺素或tpp的水平分别太低，该过程进行的效率较低并且导致α-酮戊二酸(akg)的累积，这也发生于星形胶质细胞的神经组织中。现在akg越来越多地被谷氨酸合成酶代谢为神经递质l-谷氨酸盐，因此其也以增加的浓度累积，包括在cns中。
[0009][0010]
酒精相关的后遗症以及酒精相关的神经损伤与饮酒期间的gabaa受体密度的减少和酒精分解后相关神经元的过度兴奋(反弹)直接相关。由于兴奋性神经递质谷氨酸盐抵消了神经递质gaba的抑制效果，该效果通过增加的谷氨酸盐浓度而进一步增强。这导致神经细胞的过度兴奋，从而在一方面由于兴奋性毒性而发生细胞死亡，并且在另一方面还可以发生负面后遗症(“宿醉症状”)。因此，硫胺素和二氢槲皮素的组合对于该应用是特别地营养上有利的。
[0011]
此外，二氢槲皮素和硫胺素的组合是有利的，因为令人惊讶地首次发现硫胺素可以还原氧化的二氢槲皮素，由此增强和延长类黄酮的体内效果。二氢槲皮素的氧化最初发生在不稳定的邻苯二酚基团处，形成邻醌；由此，类黄酮丧失其生理作用。
[0012][0013]
现在，硫胺素可以在体内有效地将氧化的邻醌基团还原为具有邻苯二酚基团的活性类黄酮二氢槲皮素。为此，首先通过打开噻唑环、由氢氧根离子将硫胺素转化为硫醇形式，然后通过形成二硫桥来还原邻醌。这可以抵消类黄酮的氧化，提高功效。
[0014][0015]
这是令人惊讶地，因为硫醇通常通过迈克尔(michael)加成加成至邻醌，由此使类黄酮最终无效。例如，对于氨基酸l-半胱氨酸和三肽谷胱甘肽可以越来越多地观察到该结合，不能有效地还原氧化的二氢槲皮素并由此延长体内效果。
[0016][0017]
此外，发现硫胺素不能有效地还原在2、3位处具有双键的氧化的类黄酮如槲皮素。硫醇形式的硫胺素也通过迈克尔加成越来越多地加成至这些氧化的类黄酮/邻醌，这是为什么这些类黄酮和硫胺素的组合的功效在体内实际上甚至降低的原因。
[0018][0019]
因此，二氢槲皮素和硫胺素之间的该协同作用对于类黄酮类的物质来说是令人惊讶并且不寻常的。饮酒期间组合摄取这两种活性物质是非常有利的。
[0020]
然而硫胺素和二氢槲皮素之间的氧化还原反应也可在贮存期间意外地发生，这导致制剂的硫胺素含量减少并且对保质期有负面影响。为了确保最大贮存稳定性，制备了类黄酮的各种盖仑制剂，包括具有典型药物聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯共聚物、聚丙烯酸)以及各种生物聚合物(例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、麦芽糊精、虫胶、胶原蛋白水解物、壳聚糖、结冷胶、黄原胶和海藻酸盐)的固体分散体的制剂。此外，还以实验室规模进行与尿素、咖啡因和烟酰胺的共晶的制剂，与各种表面活性剂(例如卵磷脂、聚山梨醇酯80、维生素e tpgs、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠)的胶束的制剂，尽管在每种情况下，当与硫胺素混合时没有观察到稳定性的充分改善。
[0021]
因此，为了成功组合硫胺素和二氢槲皮素，需要具有赋形剂的制剂。
[0022]
令人惊讶地，仅发现两种类黄酮制剂可有效防止二氢槲皮素和硫胺素之间的不需要的相互作用。一种是a)二氢槲皮素与环糊精、特别是β-环糊精(e459)的复合物形成，另一种是b)类黄酮在基础聚甲基丙烯酸酯中、特别是在例如保护剂等批准用于食品用途的基础甲基丙烯酸酯共聚物(e1205)中的固体分散体中的制剂。
[0023]
因此，本发明的目的是提供用于口服施用的制剂，其包含
[0024]
(i)二氢槲皮素或其药学上可接受的盐、衍生物或前药，
[0025]
(ii)硫胺素或其药学上可接受的盐、衍生物或前药，和
[0026]
(iii)选自以下的至少一种赋形剂：a)β-环糊精及其衍生物，和b)甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的基础(共)聚合物，
[0027]
其中二氢槲皮素(a)作为与β-环糊精的复合物存在、或(b)作为与甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的基础(共)聚合物的固体分散体存在。
[0028]
在本发明的第一实施方案中，二氢槲皮素以与β-环糊精的包合复合物的形式存在。复合物形成提高了二氢槲皮素的溶解度(solubility)和溶出度(dissolution)，并显著提高其生物活性。然而，特别地，二氢槲皮素的不稳定的邻苯二酚基团被包埋，由此防止被氧化，如通过1h-nmr和ft-ir光谱所证明的。这防止了贮存期间通过二氢槲皮素的氧化而形成邻醌基团，这也防止了硫胺素通过形成二硫桥而分解。与专家意见相反，发现仅β-环糊精、而不是γ-环糊精能够包埋邻苯二酚基团。此外，通过dsc测量和尿素的添加，发现γ-环糊精趋于形成超分子复合物并且在最初良好的溶出行为之后沉淀。β-环糊精优选以β-环糊精:二氢槲皮素为0.5:2至2:0.5的摩尔比使用，优选以0.8:1至1.5:1的摩尔比使用。特别优
选β-环糊精:二氢槲皮素的摩尔比为约1:1。特别优选以通过喷雾干燥而形成的二氢槲皮素/β-cd包合复合物的形式使用。
[0029]
β-环糊精(β-cd)是一种由7个α-1,4-糖苷连接的葡萄糖分子构成的环状低聚糖。它可以以未衍生化或衍生化形式存在于根据本发明的制剂中，其中，例如，葡萄糖单元的一个以上的羟基带有取代基。例如，c6碳原子可以在β-环糊精的一个以上的葡萄糖单元上被烷氧基化或羟烷基化。例如，在一个以上的葡萄糖单元的c6碳原子上，羟基的氢原子可以被c1-18烷基或c1-18羟烷基取代。特别优选2,6-二-o-甲基-环糊精和2-羟丙基-环糊精。此外，磺烷基环糊精、特别是磺乙基-、磺丙基-和磺丁基-β-环糊精是感兴趣的。
[0030]
为了提高复合物的稳定性，含有β-环糊精和二氢槲皮素的根据本发明的制剂可以进一步包含一种以上的水溶性聚合物。这可以有效防止活性物质二氢槲皮素的重结晶，从而长时间维持高的初始浓度。为此，非常低的聚合物浓度通常足以实现期望的效果。水溶性聚合物优选以至少0.0025％w/v、特别是0.0025-1.0％w/v、进一步优选0.025-0.5％w/v、例如0.25％w/v的量存在于溶液中。关于二氢槲皮素，聚合物:类黄酮质量比优选在1:0.5和1:80之间、特别地在1:3和1:15之间。发现在1:6和1:8之间的范围内的质量比在实践中为最佳的。
[0031]
根据本发明的特别适合的水溶性聚合物的实例为聚乙二醇如peg 6000、聚乙烯醇、泊洛沙姆如泊洛沙姆188及其混合物，例如peg和pva的混合物(ir)。这些聚合物由环氧乙烷嵌段构成并且显示非常有前途的性质。与二氢槲皮素的羟基的相互作用没有那么强以至于发生沉淀，同时，聚合物也与β-环糊精的羟基相互作用。这提高了复合物稳定性。
[0032]
复合物稳定性的提高可由聚合物与活性物质和β-环糊精相互作用、从而稳定环糊精的空腔中的活性物质(三元复合物)这一事实来解释。在选择合适的聚合物时必须要考虑这一点，因为如果与活性物质的相互作用太强，聚合物-活性物质复合物絮凝并且ks降低。如果与环糊精的相互作用太强，聚合物和活性物质将竞争cd空腔并且ks也将降低。最后，重要的是确保聚合物必须不增加或必须仅略微增加溶液的粘度，否则cd复合物形成将劣化。
[0033]
为了改善溶出行为以及稳定性，具有β-环糊精或甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的基础(共)聚合物和二氢槲皮素的根据本发明的制剂可进一步包含胆碱盐/(2-羟乙基)-三甲基铵盐。在实验中，例如氯化胆碱、酒石酸氢胆碱或柠檬酸胆碱等这些化合物已令人惊讶地被证明为有用的添加剂。含有胆碱阳离子的制剂显示较快的溶出、较低的重结晶和较高的整体溶解度。这是由于两个机制：
[0034]
由于溶液中的季烷基铵基团，胆碱阳离子干扰氢键的形成，从而降低疏水作用。结果，较低亲水性的物质更容易溶解或者不从过饱和溶液沉淀出来(“盐化效应”)。具体地，首次发现仅胆碱阳离子的添加导致二氢槲皮素制剂的较好的溶出行为，这是由于较快的溶出以及减少的重结晶。此外，胆碱阳离子能够与二氢槲皮素/β-环糊精复合物形成三元复合物，从而提高复合物稳定性。仅对于胆碱阳离子发现该双重机制。
[0035]
基于胆碱阳离子的纯质量，优选以5:1至1:20的二氢槲皮素:胆碱质量比使用胆碱化合物。2:1至1:2.5的比例被证明为特别有利的，最佳为1:0.85。胆碱阳离子的所有盐可以用作胆碱化合物，具有有机的、多质子酸阴离子的化合物(酒石酸氢胆碱或酒石酸氢胆碱)由于其酸性作用是优选的。这使得在贮存期间打开噻唑环所需的氢氧根离子的浓度保持较
低，这可以进一步减少硫胺素因氧化而导致的分解。
[0036]
此外，胆碱化合物在肝细胞的甘油三酯代谢中具有重要作用，胆碱的缺乏导致增加的甘油三酯的产生。由于乙醇的代谢经由醇脱氢酶(adh)以及醛脱氢酶(aldh)、通过消耗nad 来发生，因此各种nad 依赖性过程
–
例如β-氧化
–
受到饮酒的抑制。这导致减少的甘油三酯的消耗，这可导致例如酒精性脂肪肝等疾病模式的发展。因此，摄取胆碱有利于防止甘油三酯的进一步的累积。目前已发现该作用可通过添加二氢槲皮素制剂以及硫胺素来增强。这最初是由于通过二氢槲皮素来抑制二酰基甘油-o-酰基转移酶(dgat)，因此在甘油三酯代谢的最后步骤中，由二酰基甘油没有形成脂肪分子，而是与胆碱化合物、作为细胞膜组分的磷脂酰胆碱一起形成，其不有助于脂肪肝的发展。现在可以通过与硫胺素的氧化还原反应来增强二氢槲皮素的效果。此外，二氢槲皮素作为β-环糊精复合物或作为基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体的使用是特别有利的，从而使二氢槲皮素的分解最少并且确保最佳释放、稳定性、和水溶性。以β-环糊精复合物的形式或作为基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体的形式使用二氢槲皮素也是十分重要的，从而确保与硫胺素组合的贮存稳定性。因此，胆碱化合物与硫胺素和二氢槲皮素组合(以β-环糊精复合物的形式或作为基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体)用于治疗和预防酒精相关的肝疾病和肝损伤是特别有利的。
[0037]
在本发明的第二实施方案中，存在具有甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的基础聚合物或共聚物的固体分散体。以这种方法，实现了二氢槲皮素的良好水溶性和高生物利用度。合适的聚甲基丙烯酸酯的实例为e、保护剂或smartseal。
[0038][0039]
观察到的溶解度的改善是由于甲基丙烯酸酯的羰基和二氢槲皮素的羟基(或类似基团)之间的分子间相互作用。这使二氢槲皮素稳定在其无定形形式，这显著改善水溶性。与例如pvp等其它聚合物不同，eudragit的阳离子氨烷基在质子化状态时为阳离子，使聚合物为水溶性的，即使当其与二氢槲皮素强地相互作用时也是这样。
[0040]
此外，通过形成二氢槲皮素在甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯聚甲基丙烯酸酯的基础(共)聚合物中的固体分散体，可以防止二氢槲皮素和硫胺素之间的不希望的相互作用。这是由于二氢槲皮素与这些聚合物发生离子相互作用，特别是在聚合物的氨烷基残基和类黄酮的邻苯二酚基团的羟基之间，如通过ft-ir光谱所表明的。这也可以防止贮存期间通过二氢槲皮素的氧化而形成邻醌基团，这也避免了硫胺素由于形成二硫桥而分解。对于任何其它聚合物，没有发现这些离子相互作用，因此其它聚合物对硫胺素和二氢槲皮素之间的相互作用没有任何显著影响。二氢槲皮素和甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的基础
(共)聚合物之间的优选重量比在1:1至1:3的范围内，特别优选为约1:2。优选地，固体分散体通过将聚合物与类黄酮熔融挤出来制备，或通过将聚合物和类黄酮溶解于例如乙醇或丙酮等常见溶剂中、随后例如通过喷雾干燥来去除溶剂来制备。
[0041]
令人惊讶地，为了进一步防止贮存期间硫胺素和二氢槲皮素之间的相互作用，硫胺素的微胶囊化被证明是非常有用的。各种包衣材料可用于此目的，例如氢化脂质，例如来自植物油如棕榈油、棕榈蜡或蜂蜡的氢化脂质、纤维素衍生物如乙基纤维素、阿拉伯胶、脂肪酸、甘油二酯或甘油单酯、淀粉或淀粉衍生物以及聚甲基丙烯酸酯。氢化棕榈油脂质、棕榈蜡、脂肪酸、甘油二酯和甘油单酯、酸性/中性聚甲基丙烯酸酯以及乙基纤维素已被证明为特别合适的。因此，防止了贮存期间硫胺素由于形成二硫桥而分解。
[0042]
此外，由于二氢槲皮素通过与肠道中的肠道硫胺素转运蛋白相互作用来抑制硫胺素的再吸收，因此开发合适的盖仑制剂以解决该问题也是本发明的一部分。已显示二氢槲皮素的速释制剂与硫胺素的缓释制剂的组合导致两种药物的最佳吸收。这是因为尽管类黄酮在施用的几分钟内以溶解状态存在于胃中并且在胃肠道的前部区域中被再吸收，但是硫胺素以延迟的方式在较长时间段内并且在胃肠道的后部区域中被再吸收，这不引起任何负面相互作用。
[0043]
已发现，二氢槲皮素的速释制剂的最好方式是与β-环糊精形成包合复合物或形成基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体。硫胺素的缓释制剂的最佳选择是微胶囊化，特别是用氢化棕榈油脂质、棕榈蜡、脂肪酸、甘油二酯和甘油单酯、中性/酸性聚甲基丙烯酸酯、和乙基纤维素作为包衣材料。
[0044]
硫胺素优选以分离的形式作为硫胺素单硝酸盐或硫胺素盐酸盐使用。特别优选硫胺素盐酸盐，因为在实验中显示，硝酸根基团通过形成亚硝酸盐可以将二氢槲皮素氧化为邻醌，这反过来导致硫胺素的分解。另一方面，氯离子为惰性的，因此优选。由于硝酸盐还原为亚硝酸盐依赖于ph并且越来越多地在胃的酸性环境中发生，因此对于硫胺素硝酸盐，缓释制剂是特别有利的。
[0045]
二氢槲皮素可任选地以药学上可接受的盐、衍生物或前药形式使用，特别是在oh基团的位置处具有糖基、醚基或酯基。糖苷的实例为单糖类和低聚糖类。合适的醚类包括，特别地，烷基醚、芳基醚和羟烷基醚。合适的酯类包括，例如，碳酸酯、氨基甲酸酯、氨基磺酸酯、磷酸酯/膦酸酯、中性或阴离子羧酸酯、和氨基酸酯。这些衍生物在体内通过酶裂解转化回主要活性物质二氢槲皮素。
[0046]
根据本发明，单糖基和低聚糖基残基优选包含己糖基残基，特别是鼠李糖基(ramnosyl)残基和葡萄糖基残基。合适的己糖基残基的进一步实例包括阿洛糖基(allosyl)、阿卓糖基(altrosyl)、半乳糖基、古洛糖基(gulosyl)、艾杜糖基(idosyl)、甘露糖基和塔罗糖基(talosyl)。可选地或另外地，单糖基残基和低聚糖基残基可包括戊糖基残基。糖基残基可以与主体α-或β-糖苷连接。例如，优选的二糖是6-o-(6-脱氧-α-l-甘露吡喃基)-β-d-吡喃葡萄糖苷。
[0047]
此外，可以将二氢槲皮素的酚羟基与各种醛(例如，乙醛)转化为半缩醛。该半缩醛的羟基目前可以以与酚羟基相同的方式被衍生化。其实例是膦酰氧基烷基前药。
[0048]
二氢槲皮素优选以来自破碎的落叶松木材的提取物的形式使用，因为在所述木材、特别是在树桩中发现高浓度的该类黄酮。此外，其它类黄酮以相对高的浓度存在，其也
可被硫胺素有效地还原。在本文中特别感兴趣的是香橙素和圣草酚。如二氢槲皮素，这些类黄酮的特征在于在2,3位置处具有单键。来自落叶松木材的提取物是明显优选的，因为与也含有二氢槲皮素的大部分植物提取物不同，其仅具有非常小部分的在2,3处具有双键的类黄酮如槲皮素。优选地，使用了兴安落叶松(larix gmelinii)的提取物，其可通过乙醇-水提取来获得，并且具有至少88％的二氢槲皮素含量，优选具有90％和97％之间的纯度，最优选具有90％-93％的纯度。这是重要的，因为仅在充分高的二氢槲皮素含量的情况下，可以有效地进行作为β-环糊精复合物或基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体的配制。来自ametis jsc的品牌提取物和来自balinvest ltd.的已被证明为特别优选的。
[0049]
总二氢槲皮素剂量可以总计在10mg至500mg的范围内(优选30-400mg、特别优选50-150mg、任选为100mg)。硫胺素剂量可以在0.1mg至250mg的范围内(优选1-100mg、更优选5-50mg、任选为10mg)。总剂量可以分为多个剂量单元。
[0050]
二氢槲皮素:硫胺素之比在700:1至1:1之间已被证明是有用的，特别是在100:1至3:1之间。最佳比例是在20:1和5:1之间的范围内，其中在10:1的范围内的比例是最佳范围。
[0051]
用于口服施用的根据本发明的制剂可进一步包含一种以上的药理学上可接受的赋形剂和/或载体、和/或一种以上的其它成分。
[0052]
其它成分的实例包括维生素(特别是维生素b)及其药学上可接受的盐、衍生物和前药，例如维生素核黄素、烟酸、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、氰钴胺素、抗坏血酸、视黄醇、胆钙化醇、生育酚、叶绿醌。此外，也可以包含各种矿物质和微量元素、及其药学上可接受的盐和复合物，例如钙、镁、钾、钠、铬、铜、锰、钼、硒、锌、钴、硅、碘和氟。最后，可以包含其它类维生素(vitaminoid)、及其药学上可接受的盐、衍生物和前药，例如胆碱、辅酶q10(泛醌-10)、左旋肉碱，以及各种氨基酸、其药学上可接受的盐、衍生物和前药，例如甘氨酸、l-脯氨酸、l-酪氨酸、l-谷氨酰胺、l-半胱氨酸、l-天冬酰胺、l-精氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-缬氨酸、l-丙氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸和l-丝氨酸。
[0053]
将根据本发明的制剂设计成口服施用。制剂可以为用于口服施用的粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、包衣片剂、袋装剂(sachet)或溶液/悬浮液的形式，并且剂量的总量可以分为多个剂量单元。特别优选压制片剂、薄膜衣片剂、咀嚼片剂以及泡腾片剂的形式的剂型。
[0054]
在制剂的制备中，可以使用可与组合物的活性物质混合的合适的赋形剂，特别是聚乙二醇、聚乙烯醇、二氧化硅、淀粉衍生物如麦芽糊精、马铃薯淀粉或羧甲基淀粉钠金属硬脂酸盐如硬脂酸镁、表面活性剂如月桂基硫酸盐、二氧化钛、碳酸盐、糖类和糖醇类、滑石、纤维素衍生物如羟丙基纤维素、微晶纤维素、甲基纤维素或羧甲基纤维素、和本领域技术人员已知的其它赋形剂和添加剂。组合物可以以常规方法混合、造粒和/或压制，或以片剂形式压片/压制，其中所述片剂优选用膜包衣(膜包衣片剂)。可以以本领域技术人员熟悉的常规方法进行此类制剂的制备。
[0055]
除了活性物质以外，用于口服施用的固体制剂可以包含常规赋形剂和载体，例如，稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如硅酸盐、滑
石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐、或羧甲基淀粉钠、发泡混合物；着色剂；甜味剂；湿润剂，例如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐；和其它常规制剂佐剂。
[0056]
用于口服施用的液体制剂可为例如分散体、糖浆剂、乳剂、和悬浮液。例如，糖浆剂可以包含蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。悬浮液和乳剂可以包含载体，例如天然树脂、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。
[0057]
根据本发明的制剂可以用于预防和/或治疗酒精中毒、与饮酒相关的后遗症和疾病、或酗酒。
[0058]
如本文所用的术语“酗酒”包括对酒精的身体和/或心理依赖性(成瘾综合征)。已发现施用根据本发明的制剂可以抵抗成瘾综合征的发展，因此可以用于预防酗酒。在已存在酗酒的情况下，可以通过使用根据本发明的制剂来提供治疗，包括酒精去习惯化和/或酒精戒断。
[0059]
当饮酒减少或突然停止时，可发生戒断症状。戒断症状包括恶心、紧张、睡眠障碍、想喝酒、易怒、和抑郁。如果身体依赖性处于加重状态，发生出汗、颤动、流感样症状、癫痫和幻觉。通过使用根据本发明的制剂，可以预防或减轻这些和其它戒断症状。
[0060]
如本文所用，术语“酒精中毒”包括急性酒精中毒的所有阶段。取决于血液酒精浓度，可以区分为兴奋阶段(0.2-2.0
‰
)、催眠阶段(2.0-2.5
‰
)、昏迷阶段(2.5-4.0
‰
)、和窒息阶段(高于4.0
‰
)。式(i)的类黄酮由于在α4β3δ或α6β3δgabaa受体处的特异性结合，能够起到别构调节剂的作用，从而阻碍酒精在gabaa受体处的结合，因此使酒精无效。
[0061]
除了预防和治疗急性酒精中毒以外，本文公开的制剂可根据本发明使用以预防和/或治疗与饮酒相关的后遗症和预防继发性疾病。此类继发性疾病是由于长期酒精滥用而导致的疾病，例如，特别地，神经系统的损伤(由于轴突如脑和外周神经系统的髓鞘的破坏，例如神经心理虚弱、记忆障碍、意识受损、痴呆综合征、神经性疼痛等)和，特别地，肝损伤。
[0062]
与饮酒相关的后遗症进一步包括急性结果，例如，特别是宿醉。在本文中，宿醉被理解为过度饮酒导致的不舒服的感觉以及身体和精神表现的损害。宿醉主要包括以下的症状：头痛、胃痛、恶心和呕吐、难以集中注意力、出汗增多、胃痛和肌肉痛、抑郁情绪，以及在随后几天、特别是在过度饮酒后的第二天中的一般不适感。
[0063]
通过使用本文所述的制剂，与治疗前的频率相比，本发明成功降低饮酒的频率。类似地，本发明成功降低饮酒量。此外，本发明成功增加戒酒率。
[0064]
优选地，根据本发明的制剂以片剂形式口服施用。根据本发明的制剂的施用可以在饮酒之前、期间或之后进行。优选地，在开始饮酒前30分钟至120分钟施用。根据本发明的制剂与(高脂肪)食物一起施用显示是有利的。
[0065]
将通过以下附图和实施例进一步说明本发明，以下附图和实施例不旨在限制权利要求书的主题。
附图说明
[0066]
图1a.具有各种环糊精的二氢槲皮素复合物的1h-nmr光谱。
[0067]
图1b.相关叠加图。
[0068]
图1c.将光谱的峰分配给各种二氢槲皮素质子。
[0069]
图2：显示环糊精复合物的溶出行为的标记的溶出图
[0070]
3：二氢槲皮素/β-cd复合物
[0071]
2：e固体分散体
[0072]
1：二氢槲皮素(参照)
[0073]
图3：具有二氢槲皮素和硫胺素的各种组合物的薄层层析分离。
具体实施方式
[0074]
实施例
[0075]
1.各种环糊精复合物的h
1-nmr光谱研究
[0076]
为了定性检测水性溶液中的复合物形成，使用了1h nmr光谱法。这允许确定二氢槲皮素和环糊精的特征光谱。当形成复合物时，发生某些信号的偏移。此外，可以确定复合物的精确三维结构和类黄酮在环糊精空腔中的构象。
[0077]
为了实现溶液中的复合物形成，将二氢槲皮素和各种环糊精(β/cavamax w7、hp-β或γ)以1:1的摩尔比称重，溶解于d2o/dmso(80/20v/v)中，并在室温和600rpm下搅拌3小时。然后，测量样品。参照溶液(二氢槲皮素、β-cd、hp-β-cd和γ-cd)仅溶解于d2o/dmso(80/20v/v)，然后进行测量。结果示于图1。
[0078]
讨论：由于信号偏移，结果清晰地表明溶液中的复合物形成。然而，该结果也可以用于准确预测类黄酮在cd空腔中的位置。这是因为由于复合物形成而表现信号偏移的质子包埋在cd空腔中。此处，β-cd/hp-β-cd和γ-cd之间有明显差异。
[0079][0080]
在β-cd和hp-β-cd中，质子h2’、h5’和h6’的信号偏移，表明环b包埋在cd空腔中。这也与普遍观点一致，即β-cd由于其环尺寸而主要包括单环芳烃。基于1h-nmr光谱，可以预测类黄酮在β-cd/hp-β-cd空腔中的以下构象：
[0081]
[0082]
然而，有趣的是注意到在hp-β-cd复合物中，质子h6和h8的信号组合以形成共同的峰。这可能是由于环糊精的羟丙基残基和环a上的各种残基之间的氢键。
[0083]
在γ-cd中，特别地，质子h6和h8的信号偏移，然而，尽管较不明显，质子h2和h3的那些信号也偏移。这表明环a和c部分地包埋cd空腔中。这也与普遍观点一致，即γ-cd由于其环尺寸而主要包括多环芳烃。基于1h-nmr光谱，可以预测类黄酮在γ-cd空腔中的以下构象：
[0084][0085]
类黄酮在cd空腔中的不同位置自然影响了类黄酮与硫胺素的相互作用。仅与β-环糊精的复合物可以预防贮存期间的不期望的氧化还原反应，而γ-环糊精对此无影响。
[0086]
2.环糊精/二氢槲皮素复合物的制备
[0087]
检验和比较了制备复合物的不同方法：
[0088]
喷雾干燥β-cd(sdβ).
[0089]
以1:1的摩尔比分别称出10000mg的二氢槲皮素和37300mg的β-环糊精并置于共用烧杯中。现将相应的940ml的蒸馏水(25℃，5％w/v)添加至β-cd-二氢槲皮素混合物，然后用高剪切搅拌器(3000min-1)在25℃下搅拌30分钟直至形成浓缩悬浮液。在不存在氧的情况下，在600rpm和25℃下将该悬浮液搅拌24小时以完成复合物形成。将溶液真空过滤(0.45μm膜过滤器)以去除未溶解的类黄酮和环糊精剩余物，然后将滤液喷雾干燥。
[0090]
参数：v＝900ml，t(in)＝125℃；泵送率：20％；抽吸器：100％，喷雾气体：55mm；t(out)＝71℃。
[0091]
冷冻干燥β-cd(fdβ).
[0092]
以1:1的摩尔比分别称出1000mg的二氢槲皮素和3730mg的β-环糊精并置于共用烧杯中。然后，相应地，将94ml蒸馏水添加至β-cd/二氢槲皮素混合物(5％w/v)，并用均质器(3000min-1)在30℃下搅拌30分钟直至形成悬浮液。在不存在氧的情况下，在600rpm和25℃下将该悬浮液搅拌24小时以完成复合物形成。将溶液真空过滤(0.45μm膜过滤器)以去除未溶解的类黄酮和环糊精剩余物，然后在离心管中将滤液冷却至-80℃持续24小时以将其冷冻。然后，将管置于冷冻干燥机中，将压力调节为0.05mbar并将温度调节为-30℃。在这些条件下，将溶液冷冻干燥96小时。
[0093]
冷冻干燥γ-cd(fd-γ).
[0094]
以1:1的摩尔比分别称出1000mg的二氢槲皮素和4266mg的γ-环糊精并置于共用烧杯中。然后，相应地，将265ml蒸馏水(2.5％w/v，25℃)添加至γ-cd-二氢槲皮素混合物，并用均质器(3000min-1)搅拌30分钟直至形成澄清溶液。将溶液真空过滤(0.45μm膜过滤器)以去除未溶解的类黄酮和环糊精剩余物，然后在离心管中将滤液冷却至-80℃持续24小时以将其冷冻。然后，将管置于冷冻干燥机中，将压力调节为0.05mbar并将温度调节为-30
℃。在这些条件下，将溶液冷冻干燥96小时。
[0095]
β-cd和γ-cd各自的1:1物理混合物
[0096]
以1:1的摩尔比称出二氢槲皮素和β-环糊精或γ-环糊精并在研钵中混合在一起。
[0097]
3.环糊精复合物的dsc分析
[0098]
为了能够定量确定包封方法的效率，各种测量方法是可用的。一种非常普遍的方法是差示扫描量热法(dsc)，这可用于基于特征吸热峰(对于二氢槲皮素为约240℃)来确定游离活性物质的剩余含量。由于活性物质/环糊精复合物具有不同的分解点或熔点，因此不存在“活性物质峰”可用于间接推测高的包封效率。
[0099]
因此，样品峰与纯活性物质、纯环糊精和等摩尔物理混合物(物理混合物1:1)的峰的比较是特别重要的。后者起到用于样品的参照的作用，因为在物理混合物中，药物以其游离的、未复合的形式存在(包封效率＝0％)。在240℃处完全不存在药物峰相当于100％的包封效率。基于各个样品的特征药物峰的面积，它们可以彼此比较以及与物理混合物比较。一方面，该测量方法的主要优点在于非常高的精度，尤其是测量固体状态的样品的可能性。这防止复合物平衡受到水或其它溶剂的影响或重新调节。
[0100]
在β-环糊精样品sdβ和fdβ的情况中，无法再检测到特征药物峰。此外，与参照样品(物理混合物1:1)相比，70℃和100℃之间的宽吸热峰的强度显著降低。这表明在加热期间，较少的水从β-环糊精空腔逸出，因为该空腔被类黄酮占据。因此，从dsc热谱图看出，在这些样品中类黄酮完全作为β-cd复合物存在并且包封效率接近100％。
[0101]
γ-cd复合物的热谱图与β-cd复合物的热谱图完全不同。尽管γ-cd复合物样品也不具有与物理混合物(物理混合物1:1)一致的特征药物峰。这表明完全包封，因为无法再检测到游离的类黄酮。但相反，该样品显示245℃
–
250℃的范围内的宽峰，其面积明显超过物理混合物的面积。该峰表明超分子复合物附聚物的分解。这些附聚物导致不良的溶出行为，由于超分子附聚物的形成而发生“弹簧降落伞效应(spring parachute effect)”，从而复合物在溶出后从溶液中沉淀出来。
[0102]
4.环糊精复合物在蒸馏水中的饱和溶解度(hplc)
[0103]
比较制造方法的最后最重要的一点是在蒸馏水中的溶解度。这是因为复合物的溶解度对生物利用度具有直接影响，因为仅溶解的复合物/活性物质可以穿过胃肠道的上皮细胞。此外，可对样品分析相关物质以检测制备过程期间的活性物质的可能的分解。
[0104]
方法：
[0105]
参照测量(二氢槲皮素)
[0106]
将10mg的二氢槲皮素(98.9％纯度)添加至含有5ml蒸馏水的小瓶以产生饱和溶液并且振荡60分钟。然后通过具有hplc过滤器(0.22μm)的注射器将溶液转移至小瓶，在未稀释状态下进行测量(hplc dad-254nm)。
[0107]
样品测量
[0108]
将500mg的样品添加至含有6ml蒸馏水的小瓶以产生饱和溶液并且振荡60分钟。然后使用具有hplc过滤器(0.22μm)的注射器将溶液转移至小瓶，用蒸馏水10:1稀释以避免过饱和，然后进行测量(hplc dad-254nm)。基于考虑到稀释的峰面积，以mg/ml计算二氢槲皮素浓度。
[0109]
结果
[0110][0111]
类黄酮的饱和溶解度通过与β-cd的包合复合物而增加，并且通过与γ-cd的包合复合物而较小程度地增加。该效果在喷雾干燥的sdβ制剂中特别明显。然而，γ-cd复合物的饱和溶解度显著低于β-cd复合物的那些。
[0112]
物理1:1混合物也提供非常好的结果，这归因于溶液中的复合物形成。物理混合物实际上表示溶解度增加的最大可能上限，因此，此处复合物可以在最大饱和度、即最佳条件下形成。
[0113]
然而，sdβ制剂的二氢槲皮素浓度超过该值。这可能是由于小粒径和由此大的材料的表面积导致的溶液的过饱和。
[0114]
5.与γ-cd的复合物中的附聚
[0115]
特别是对于γ-环糊精，要考虑的一个重点是复合物的可能的附聚。该问题对产物的溶解度和溶出行为有极大影响。在该情况下，复合物以固体晶体结构将它们自己排列成超分子复合物。这大大减少表面积以及单个复合物的水合。因此，即使理论上复合物的溶解度高，也形成浑浊的、特征性乳白色的悬浮液。
[0116]
为了能够正确说明通过附聚而导致的溶解度限制，用离液物质进行实验。这些物质阻碍氢键的形成，氢键使复合物稳定在高度有序的结构。同时，溶剂水的高度有序的结构被破坏，因此疏水作用降低。
[0117]
具体地，再次制备γ-cd复合物的乳白色悬浮液(250mg的γ-cd复合物粉末在20ml蒸馏水中)，然后添加10g的尿素。在不升高温度的情况下，在600rpm下搅拌仅10min后，悬浮液完全澄清。通过破坏聚集体，可以相当多地增加溶解度。
[0118]
这些附聚物不存在于β-cd中，因此仅β-cd适用于确保类黄酮和硫胺素的最佳再吸收。这是因为该制剂的速释行为，由此可以降低二氢槲皮素与肠道硫胺素转运蛋白的负相互作用。
[0119]
6.三元复合物β-环糊精
[0120]
为了检验哪些水溶性聚合物特别适用于改善类黄酮-环糊精复合物的稳定性和溶出能力，进行了筛选。为此，首先，通过添加过量的等摩尔二氢槲皮素/β-cd复合物、然后加热至35℃并滤出而制备过饱和的二氢槲皮素/β-cd复合物溶液。然后，添加各种水溶性聚合物(0.25％w/v)，并且添加酒石酸氢胆碱以及酒石酸左旋肉碱(二氢槲皮素:胆碱/肉碱阳离子比1:0.85)来分别检验聚合物/烷基铵阳离子对复合物形成和溶解度的影响。将溶液静置96小时，然后将重结晶与参照溶液相比较。
[0121][0122]
结果清楚地显示具有显著h桥受体的聚合物(pvp、pvp/va、eudragit e100和纤维素衍生物)由于与药物过强的相互作用而导致分解。聚合物-药物复合物沉淀并且ks降低。此外，对于典型生物聚合物，其与活性物质或与环糊精均没有检测到相互作用，因此不改变活性物质的溶出行为。
[0123]
相反，peg 6000、kollicoat ir和泊洛沙姆188是特别感兴趣的。这些聚合物由环氧乙烷嵌段构成并且显示非常有前途的性质。与类黄酮的羟基的相互作用不会过强而发生
沉淀。同时，聚合物也与环糊精的羟基相互作用。这提高了复合物稳定性。对于聚乙烯醇(pva)也是如此。然而，聚合物的羟基与类黄酮和环糊精的相互作用与环氧乙烷聚合物相比较不明显。
[0124]
这显示了使用水溶性聚合物可以增加复合物稳定性和改善溶出行为。
[0125]
此外，当添加酒石酸氢胆碱时观察到显著的改善，然而对于结构上相关的左旋肉碱并非如此。因此，表明了不是所有的烷基铵阳离子、而是仅胆碱阳离子适用于该目的。这可以通过烷基铵基团对溶剂的氢键的结构破坏影响和相关单盐效应来解释。另一方面，关于肉碱，羟基以及羧基起到可形成h桥并抵消烷基铵基团的效果的结构形成元件的作用。另一方面，发现在胆碱化合物中，结构破坏组分是主要的并且分别导致溶解度和物理化学性质的改善，特别是在二氢槲皮素/β-cd制剂中以及在二氢槲皮素/基础聚甲基丙烯酸酯的固体分散体中。
[0126]
为了实现这种积极效果，以口服剂型将水溶性聚合物/胆碱化合物和最终的类黄酮/cd复合物物理混合或组合已经足够，因为，分别地，在溶液中溶出后形成三元复合物并且展示出胆碱阳离子的积极效果。然而，聚合物的整合也可以在复合物形成之前或期间发生。例如，可以在喷雾或冷冻干燥前将少量的聚合物添加至复合物溶液。
[0127]
7.使用e制备固体分散体
[0128]
常规溶剂蒸发2:1(cse 2:1)
[0129]
称出2000mg的e100并溶解于30ml的乙醇。然后，称出1000mg的二氢槲皮素并溶解于15ml的乙醇。随后，将两种溶液混合并在室温下、在600rpm下搅拌30分钟。之后，在避光的干燥的地方将澄清的浅琥珀色溶液干燥。在粉末化后，将固体分散体密封和避光贮存。
[0130]
xrd分析
[0131]
xrd方法被认为是检测聚合物基质中活性物质的完全的无定形包埋的选择方法。为此，确定样品的结晶度，这提供了关于活性物质的分子的排列的结论。由于与活性物质相反，聚合物基质是无定形的，因此结晶峰表明不完全包埋。然而，如果样品是无定形的，则存在固溶体。
[0132]
此外，无定形样品通常显示比结晶性样品显著更好的溶出行为，这就是为什么用无定形样品可以增加生物利用度的原因。
[0133]
结果：从衍射图可以看出，二氢槲皮素和二氢槲皮素/e100的物理混合物二者均为结晶性的。如所预期的，聚合物是无定形的。物理混合物也显示二氢槲皮素和e100的叠加的x射线衍射图。此外，所有三种制剂都是无定形的并且与参照聚合物没有区别。
[0134]
讨论：xrd分析的结果表明固体分散体以cse 2:1存在，其中类黄酮二氢槲皮素完全包埋在聚合物基质中。
[0135]
fitr分析
[0136]
ft-ir光谱用于分析类黄酮的官能团和基础聚甲基丙烯酸酯之间的分子相互作用。
[0137]
首先，峰在3435cm-1
处变宽，这是由于存在质子化铵基，因为r-n -h伸缩振动正好
在该区域吸收，从而使带变宽。这表明聚合物的叔氨基以质子化形式存在。此外，关于在2770cm-1
和2820cm-1
处的峰，发生强度的显著损失或甚至完全消失，这意味着聚合物的叔氨基涉及与类黄酮的离子相互作用。
[0138]
聚合物的叔氨基和类黄酮的酚羟基之间存在强的离子相互作用，使得叔氨基质子化为阳离子铵基团，并且类黄酮的羟基去质子化为共振稳定的酚盐离子。
[0139]
8.具有eudragit e的固体分散体的溶解度
[0140]
比较制备方法的最后最重要的一点是模拟胃液中的溶解度。复合物的溶解度对生物利用度具有直接影响，因为仅溶解的活性物质可穿过胃肠道的上皮细胞。
[0141]
参照测量(二氢槲皮素)
[0142]
将10mg的二氢槲皮素(98.9％纯度)添加至含有5ml 0.1n hcl的小瓶以产生饱和溶液并且振荡60分钟。其后，借助具有hplc过滤器(0.22μm)的注射器将溶液转移至小瓶，然后进行测量。
[0143]
样品测量
[0144]
在室温下在0.1摩尔hcl溶液中制备样品的饱和溶液。然后，借助于具有hplc过滤器(0.22μm)的注射器将溶液转移至小瓶，相应地稀释，并通过hlpc确定溶液的二氢槲皮素浓度。
[0145][0146]
讨论：通过用基础聚甲基丙烯酸酯配制固体分散体，可以增加二氢槲皮素的饱和溶解度。这尤其是因为在所有三种制剂中，类黄酮以无定形形式包埋在聚合物中，这通过ft-ir和xrd分析来证实。
[0147]
9.具有环糊精或基础聚甲基丙烯酸酯的制剂的溶出行为
[0148]
为了检验最终制剂的溶出行为，针对纯二氢槲皮素，进行了环糊精和eudragitol制剂的溶出研究。此处，预期速释制剂显著改善类黄酮的溶出行为，因为纯二氢槲皮素由于其稳定的晶体结构和低水溶性而溶解地非常缓慢。
[0149]
由于具有e的固体分散体，晶体结构溶解(参见xrpd分析)，由此水溶性增加。在cd复合物的情况下，晶体结构也通过包封每个单独的二氢槲皮素分子来溶解，同时，通过cd起到“特洛伊木马(trojan horse)”的作用来增加水溶性和润湿性。二者可导致溶出行为的改善。
[0150]
当85％的药物在最初的15分钟内溶解时，速释制剂被认为是最佳的。由于禁食时的胃排空是一级反应(10-20分钟内50％排空)，在最初15分钟内85％溶出，可以假设该制剂表现得像溶液，因此表现最佳。因此，可以确保当同时施用时硫胺素和二氢槲皮素的最佳吸收行为。
[0151]
方法：为了确定溶出行为，选择常规药典过程。
[0152]
usp apparatus ii(桨装置)；100rpm；介质：500ml 0.1n hcl；每个样品2个容器(n
＝2)；7个采样点：0min、5min、10min、15min、20min、30min、60min；重量：对应于100mg的二氢槲皮素，作为粉末的制剂；通过hplc来检测。
[0153]
测试以下制剂：
[0154]-二氢槲皮素(ametis98.8％纯度)
[0155]-e固体分散体制剂
[0156]-β-环糊精制剂
[0157]
此处，纯二氢槲皮素表示参照值。
[0158]
结果:
[0159]
二氢槲皮素释放(参照)
[0160][0161]
释放二氢槲皮素/β-cd复合物
[0162][0163]
释放e固体分散体
[0164][0165]
注意：在采样时间5min时，在小瓶2中，通过过滤器抽取颗粒，其在测量前溶解。因此，未考虑该测量点。
[0166]
讨论：游离形式的二氢槲皮素显示具有连续释放的典型溶出行为。结果示于图2。然而，15分钟后的释放仅为60％，因此不满足速释制剂的要求(15分钟后最少85％)。这意味着预期降低的硫胺素再吸收。e中的固体分散体和β-环糊精制剂均满足要求，因此被认为是最佳速释制剂。
[0167]
β-cd非常快速地释放类黄酮并且在第一测量点已实现100％释放。此外，不存在如在γ-cd复合物中发生的“弹簧降落伞效应”的意义上的重结晶，但释放始终是100％。
[0168]
e制剂也实现了类黄酮的非常快速的释放，在第一测量点处，82.2％的类黄酮已在溶液中。此处，也没有重结晶，并且没有二氢槲皮素从溶液中沉淀，但二氢槲皮素的释放限于最大85％。
[0169]
因此，两种制剂满足最佳速释制剂的要求，允许二氢槲皮素/硫胺素组合的制剂。
[0170]
此外，通过能够避免贮存期间二氢槲皮素和硫胺素之间的不期望的氧化还原反
应，两种制剂均具有良好的贮存稳定性。这是由于在β-cd制剂中包含邻苯二酚基团，而邻苯二酚基团的羟基和聚合物的氨基烷基部分之间的离子相互作用在基础聚甲基丙烯酸酯中的固体分散体中是决定性的。
[0171]
10.稳定性实验硫胺素
[0172]
进行稳定性实验以更详细地研究硫胺素和二氢槲皮素之间的相互作用以及盖仑制剂的影响。与二氢槲皮素的分解相反，硫胺素的分解不伴有颜色变化，因此更难以检测。然而，可能的分解产物、特别是硫胺素二硫化物以及在某些条件下的硫色素(thiochrome)具有完全不同的物理化学性质，这可被薄层层析法利用。
[0173]
方法：首先，在研钵中制备由以下组成的四种混合物：i)1000mg二氢槲皮素和127mg硫胺素盐酸盐ii)5266mg二氢槲皮素/γ-cd复合物(fd-γ)和127mg硫胺素盐酸盐iii)4730mg二氢槲皮素/β-cd复合物(fdβ)和127mg硫胺素盐酸盐和iv)3030mg二氢槲皮素/e cse 2:1和127mg硫胺素盐酸盐，其中各制剂包含1000mg二氢槲皮素和对应于100mg硫胺素的硫胺素盐酸盐(二氢槲皮素:硫胺素比10:1)。
[0174]
将混合物置于玻璃培养皿中，并在40℃和75％湿度下、在气候控制柜中开放贮存3个月(加速稳定性试验)。
[0175]
然后，将样品分为两份，在各个情况中称出对应于50mg硫胺素的量(564mg的二氢槲皮素/硫胺素，2697mg的fd-γ/硫胺素，2429mg fdβ/硫胺素和1579mg的e cse 2:1/硫胺素)。其后，用温度为45℃的50ml溶剂(对于纯二氢槲皮素、fd-γ和fdβ混合物为乙醇，并且对于e cse 2:1混合物为石油醚)提取各个样品以溶解硫胺素分解产物，然后过滤。最终溶液包含等量的50mg硫胺素/50ml溶剂的分解产物。
[0176]
此外，制备含有等效浓度的硫胺素二硫化物的参照溶液(分别地，50ml乙醇和石油醚中的53mg硫胺素二硫化物水合物)。
[0177]
然后，用5μl各样品装载硅胶dc板并与由乙醇:丙酮:乙腈4:2:1组成的流动介质一起置于dc室中。其后将板干燥并且用dragendorff试剂喷雾。选择dragendorff试剂是因为它含有四碘化铋钾(potassium tetraiodobismuthate)复合物而使碱性叔胺特异性染色。这使得允许硫胺素以及其分解产物硫胺素二硫化物和硫色素的选择性染色。
[0178]
结果：薄层层析法导致物质的清晰分离(图3)，特别是硫胺素二硫化物的清晰的半定量检测。二氢槲皮素与流动介质一起移动并且由于在空气中氧化而在流动中心线附近可见，但硫胺素盐酸盐由于其亲水性而保持在起始线。硫胺素二硫化物被清晰分离并且具有在0.22至0.27的最佳范围内的rf值。
[0179]
在二氢槲皮素/硫胺素和fd-γ/硫胺素混合物中可以检测到硫胺素二硫化物，从而在fd-γ中可以看到比在纯二氢槲皮素/硫胺素样品中更少的分解。相反，在fdβ样品或在e cse 2:1样品中不存在硫胺素二硫化物或其它分解产物。在uv光下，在任何样品中均没有检测到硫色素。
[0180]
讨论：具有β-cd和基础聚甲基丙烯酸酯的二氢槲皮素制剂是仅有的可以抑制硫胺素分解为硫胺素二硫化物的制剂。这是由于β-cd对邻苯二酚基团的包封或二氢槲皮素和基础聚甲基丙烯酸酯之间的离子相互作用。含有e的样品需要用石油醚提取，否
则聚合物也将溶解并被dragendorff试剂染色。通过该提取，在e样品中未发现聚合物、硫胺素盐酸盐或二氢槲皮素，因为它们对于提取剂石油醚而言极性太大，这与可在参照溶液中提取的亲脂性硫胺素二硫化物相反。此外，二氢槲皮素/硫胺素样品和fd-γ/硫胺素样品中的硫胺素盐酸盐比fdβ样品中的硫胺素盐酸盐流动得略微更远。这可能是由于硫胺素和β-cd之间的相互作用增加了维生素的亲水性。
[0181]
11.稳定性检验二氢槲皮素
[0182]
为了研究类黄酮二氢槲皮素的稳定性以及硫胺素和β-cd的影响，也在这方面进行了实验。由于二氢槲皮素在分解时形成红棕色低聚物，因此非常简单地进行检测。
[0183]
方法：在烧杯中制备了含有以下的三种水性溶液：i)100mg二氢槲皮素于150ml蒸馏水中ii)100mg的二氢槲皮素 13mg的硫胺素盐酸盐于150ml蒸馏水中和iii)100mg二氢槲皮素 13mg的硫胺素盐酸盐 373mg的β-cd于蒸馏水中。在室温下开放并避光贮存样品，每24小时检查溶液的颜色。
[0184]
结果：结果总结于下表中。
[0185]
样品颜色变化的时间溶液的颜色二氢槲皮素(参照)48h红棕色二氢槲皮素/硫胺素48h浅黄色，72h后棕色染色二氢槲皮素/硫胺素/β-cd96h黄褐色
[0186]
可以看到通过添加硫胺素或β-cd导致的二氢槲皮素氧化的延迟，氧化按如下顺序减少：二氢槲皮素(参照)》二氢槲皮素/硫胺素》二氢槲皮素/硫胺素/β-cd。
[0187]
讨论：添加硫胺素可以延迟二氢槲皮素的分解，在该过程中形成硫胺素二硫化物和各种分解产物和/或加合物，导致溶液的变黄。这也证明了体内的有益组合，其中硫胺素可以减少氧化的二氢槲皮素，由此延长效果。现在，添加β-cd可以在第一步中延迟二氢槲皮素氧化，导致硫胺素的延迟氧化。
[0188]
12.具有β-环糊精、硫胺素和胆碱的口服剂型
[0189]
对应于1片的剂量，每片的成分，长方形：
[0190][0191]
成品片剂的参数如下列出：
[0192]
参数结果
高度6.05mm宽度8.5mm深度20mm质量869mg用于生产的压力12kn片剂硬度(纵向)(n＝10)》280n崩解时间(n＝6)16.5min.磨耗/脆性(n＝10)0.023％
[0193]
结果说明可以容易地大规模生产具有β-cd、胆碱和硫胺素的二氢槲皮素制剂，参数在最佳范围内。此外，例如，目前硫胺素可以为微胶囊化形式。
[0194]
13.具有基础聚甲基丙烯酸酯和硫胺素的制剂
[0195]
对应于1粒硬胶囊的剂量，每粒硬胶囊(0号，明胶)的成分：
[0196]
200mg的基础甲基丙烯酸酯共聚物(eudraguard保护剂evonik nutrition&care gmbh)，100mg来自兴安落叶松的富含二氢槲皮素的提取物(来自ametis jsc的二氢槲皮素含量90.5％)，20mg的二氧化硅，13mg的硫胺素盐酸盐(食品级,basf)。
[0197]
具有基础聚甲基丙烯酸酯的制剂也容易实施并且可大规模生产。
[0198]
14.具有β-环糊精 硫胺素的制剂微胶囊化
[0199]
对应于1片的剂量，每片的成分，长方形21mm x 9mm：
[0200]
740mg的β-环糊精(食品级，cyclolab r&d ltd.)，兴安落叶松的富含二氢槲皮素的提取物200mg(ametis jsc，二氢槲皮素含量90.5％)，35mg的二氧化硅，30mg的微胶囊化的硫胺素(33.3％硫胺素盐酸盐 66.6％白色棕榈蜡)，20mg的聚乙二醇6000。