用于酶开发的超高通量微流体酶筛选平台

用于酶开发的超高通量微流体酶筛选平台
1.相关申请
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年4月13日提交的标题为“generic ultra-high-throughput microfluidic enzyme screening platform for enzyme development”的美国临时申请号63/008,870和2021年1月4日提交的标题为“generic ultra-high-throughput microfluidic enzyme screening platform for enzyme development”的美国临时申请号63/199,500的优先权，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。
技术领域
3.总体上描述了用于筛选酶的系统和方法。酶活性可以取决于辅因子的存在或者可以与辅因子的存在无关。


背景技术：

4.利用酶或其他生物催化剂以加速化学反应的生物催化是用于绿色和可持续合成的有用工具。与化学催化相比，生物催化具有无毒、温和的反应条件、高化学选择性、高区域选择性和高立体选择性以及经由级联反应进行一锅法多步合成的能力。因此，生物催化已经成为药物、食品和饮料、化妆品、香料和保健品行业、化学和生化制造以及合成生物学的重点关注领域。
5.对于生物催化在各个行业的成功应用，重要的是对于目标应用识别出具有高活性和期望选择性和稳定性的酶。尽管功能基因组学的进步已经允许从多种来源发现许多新酶，但由于细胞环境和工业环境之间的差异，大多数天然存在的酶并未针对实际应用进行优化。因此，涉及经由随机或靶向诱变产生酶变体以及随后筛选酶变体的方法例如定向进化已被用于微调酶用于实际应用。
6.传统的基于微量滴定板的酶筛选方法存在通量低和开发时间延长的问题。使用基于微流体的平台使得能够经由定向进化来进行高通量酶筛选以加速酶开发。然而，现有技术的基于微流体的技术大多数依赖于标记的反应底物(例如荧光团标记的底物)以在酶筛选过程中产生荧光信号。因此，需要改进的系统和方法。


技术实现要素：

7.总体上描述了用于筛选酶的系统和方法。酶活性可以取决于辅因子的存在或者可以与辅因子的存在无关。在一些情况下，本公开内容的主题涉及相互关联的产品、对特定问题的替代解决方案、和/或一个或更多个系统和/或制品的多种不同用途。
8.在一个方面中，描述了针对一种或更多种特性筛选酶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)产生复数个液滴，其中至少一个液滴包含：酶，反应底物，以及一种或更多种氧化还原辅因子或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中酶将反应底物转化为目标产物；(b)检测从液滴发射的信号，其中信号为荧光信号、生物发光信号或化
学发光信号，(i)其中所述信号是在当反应底物被酶转化为目标产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的，或者(ii)其中所述信号是在当目标产物被液滴中的一种或更多种检测试剂进一步转化为后续产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。
9.在另一个方面中，描述了针对一种或更多种特性筛选酶的方法，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包括孵育区域，所述孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室，其中复数个孵育室被配置成允许复数个液滴连续流动，所述步骤为：培养液滴中的细胞以形成复数个细胞，同时使细胞从第一孵育室流动至第二孵育室；使液滴在孵育区域中连续流动，其中液滴包含酶、反应底物以及一种或更多种氧化还原辅因子或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中酶将所述反应底物转化为目标产物；和从液滴中产生信号，其中信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号。
10.在另一个方面中，包括一种流体系统，所述流体系统包括复数个液滴，所述复数个液滴包括第一液滴，所述第一液滴包含氧化还原辅因子，其中液滴中的氧化还原辅因子的浓度大于或等于5μm；包含液滴的微流体通道；和与微流体通道流体连通的液滴分选区域，其中液滴分选区域包括与所述微流体通道相邻的电极组。
11.在另一个方面中，描述了流体系统，所述流体系统包括包含复数个液滴的微流体通道，其中至少一个液滴包含氧化还原辅因子和检测试剂；以及其中检测试剂被配置成与氧化还原辅因子的氧化还原对反应以产生发光信号。
12.在又一个方面中，描述了流体系统，所述流体系统包括：第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶；第二试剂室，其中第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与第一流体不混溶的第二液体，并且与至少第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将第一液体和第二液体合并；与合并区域流体连通的孵育区域，其中所述孵育区域包括：复数个孵育室，所述复数个孵育室包括流体中的第一孵育室和第二孵育室，其中第一孵育室和第二孵育室被配置成允许液滴在所述室之间连续流动；与孵育区域流体连通的液滴分选区域，其中液滴分选区域包括检测区，检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于所述液滴中组分的检测对复数个液滴进行分选，收集通道，和废物通道；以及定位在孵育区域与液滴分选区域之间的气泡捕集器。在一些实施方案中，根据前述权利要求所述的流体系统，还包括在液滴分选区域内的第二载液室。
13.在又一个方面中，描述了流体系统，所述流体系统包括第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶；第二试剂室，其中所述第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与第一流体不混溶的第二液体，并且与至少第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将第一液体和第二液体合并；与合并区域流体连通的孵育区域，其中所述孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室；检测区，所述检测区包括第一检测器，其中第一检测器被配置成确定第一波长的第一发光信号和第二波长的第二发光信号，其中第一波长和第二波长不同；与孵育区域流体连通的液滴分选区域；检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于液滴中的一种或更多种组分的检测对复数个液滴进行分选；收集通道；和废物通道。
14.在另一个方面中，提供了针对一种或更多种特性筛选酶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)产生复数个液滴，其中复数个液滴中的至少一者或更多者包含：酶，反应底物；以及一种或更多种氧化还原辅因子或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测酶，其中酶将反应底物转化为目标产物；(b)检测从每个液滴发射的信号，其中信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号，(i)其中所述信号是在当反应底物被所述酶转化为目标产物时一种或更多种氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的；或者(ii)其中所述信号是在当目标产物被液滴中的一种或更多种检测酶进一步转化为后续产物时一种或更多种氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的；(c)基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平针对一种或更多种特性筛选酶，其中与参照信号相比发射信号的水平变化表明酶具有一种或更多种特性；和(d)基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平来分离液滴。
15.在另一个方面中，本文提供了根据前述权利要求中任一项的用于筛选酶的方法用于提高其天然底物的转化、提高其非天然底物的转化、提高催化活性、提高立体选择性、提高热稳定性、提高在预定ph范围内的稳定性、或其组合的用途。
16.当结合附图考虑时，本公开内容的其他优点和新特征将从以下对本发明的各种非限制性实施方案的详细描述而变得明显。在本说明书和通过引用并入的文件包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。
附图说明
17.将参照附图以实例的方式描述本发明的非限制性实施方案，这些附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示出的每个相同或几乎相同的组分通常由单一数字表示。为清楚起见，在不需要图解来使本领域普通技术人员理解本发明的情况下，不是每个组分在每幅附图中都被标记，也不是本发明的每个实施方案的每个组分都被示出。在附图中：
18.图1a至图1b示出根据一些实施方案的包含含有与试剂合并的靶酶的细胞的液滴的截面示意性侧视图；
19.图1c至图1e示出了根据一些实施方案的举例说明在使用检测试剂的筛选中产生发光信号的截面示意性侧视图；
20.图1f示出了根据一些实施方案的举例说明在不使用检测试剂的情况下在液滴筛选中产生发光信号的截面示意性侧视图；
21.图2a示出根据一些实施方案的用于筛选酶的微流体装置的示意图；
22.图2b示出根据一些实施方案的用于筛选酶的在芯片上的微流体装置；
23.图3a至图3b示出根据一些实施方案的处于其中不分选液滴的关闭位置和处于其中分选液滴的打开位置的液滴分选区域的一部分的示意性侧视图；
24.图4示出了用于氧化还原辅因子依赖性或非依赖性酶的定向进化的超高通量微流体筛选系统的示意图。由目标生物转化产生的氧化或还原的辅因子使用红色荧光试剂、生物发光、量子点或生物传感器测定直接检测，或者通过酶促级联反应通过目标生物转化产物的转化来产生和检测。这些系统包括：a)具有全细胞的细胞内酶，以及经由利用另外的级联的酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的辅因子依赖性或非依赖性酶的检测。b)表面展示的辅因子非依赖性酶，以及经由利用另外的级联的酶促
反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的反应检测。c)具有裂解的细胞的细胞内辅因子非依赖性酶，以及经由利用另外的级联的酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的反应检测。d)表面展示的辅因子依赖性酶，以及氧化或还原的辅因子的检测。e)根据一些实施方案的具有裂解的细胞的细胞内辅因子依赖性酶，以及nad(p)h或nad(p)

的检测；
25.图5示出了用于具有低活性和或低表达水平的氧化还原辅因子依赖性或非依赖性酶二者的定向进化的超高通量微流体筛选系统的示意图。由目标生物转化产生的氧化或还原的辅因子使用红色荧光试剂、生物发光、量子点或生物传感器测定直接检测，或者通过酶促级联反应通过目标生物转化产物的转化来产生和检测。这些系统经历了细胞生长和液滴合并的另外步骤，并且包括：a)具有全细胞的细胞内酶，以及经由利用另外的级联的酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的辅因子依赖性或非依赖性酶的检测。b)细胞外辅因子非依赖性酶，以及经由利用另外的级联的酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的反应检测。c)具有裂解的细胞的细胞内辅因子非依赖性酶，以及经由利用另外的级联的酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子而进行的反应检测。d)细胞外辅因子依赖性酶，以及氧化或还原的辅因子的检测。e)根据一些实施方案的具有裂解的细胞的细胞内辅因子依赖性酶，以及氧化或还原的辅因子的检测；
26.图6示出了在a)微量滴定板和b)直径为30μm的微流体液滴中在450nm处的直接nadh荧光检测信号与nadh浓度的校准曲线。在c)微量滴定板和d)直径为30μm的微流体液滴中在590nm处来自nadh的基于刃天青的荧光信号与nadh浓度的校准曲线。e)根据一些实施方案的用刃天青的nad(p)h的荧光检测的反应方案；
27.图7示出了具有不同nadh浓度的液滴的荧光(450nm至490nm)图像。使用互补金属氧化物半导体(cmos)相机以200ms的曝光时间进行检测。根据一些实施方案，将液滴保持在350nm下激发的聚二甲基硅氧烷(pdms)观察芯片中；
28.图8示出了a)用于nadh的生物发光检测的反应方案。根据一些实施方案，在b)微量滴定板和c)直径为30μm的微流体液滴中在不同nadh浓度下的生物发光信号的校准曲线；
29.图9示出了由光电倍增管(pmt)获得的包含丁二醇脱氢酶(bdha)、1-苯基-1,2-乙二醇(100μm)和在磷酸钾(kp)缓冲液中的nad (ph 7.5，50mm)的液滴的生物发光检测。根据一些实施方案，基于从包含反应混合物和生物发光试剂盒试剂的液滴流中获得的pmt信号绘制数据；
30.图10示出了a)基于量子点的nadh传感器的结构。合成了cdse-核cds(2ls)/cd0.5zn0.5s(3l)/zns(2ls)多壳量子点，并用3-巯基丙酸溶解。水溶性量子点用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)和尼罗蓝进一步修饰。b)基于nadh量子点的传感器的工作原理。传感器通过fret被尼罗蓝有效地淬灭。尼罗蓝染料帮助nad(p)h辅因子的氧化。根据一些实施方案，在nadh的存在下，染料被还原为不能够吸收可见光谱中的光子的不同形式，从而停止淬灭并恢复荧光；
31.图11示出对微流体系统的nadh感测。记录pmt信号。a)淬灭的qd-尼罗蓝的pmt信号。b)荧光qd-bsa的pmt信号。c)根据一些实施方案，经500mm nadh处理的qd的pmt信号，1000mm nadh的pmt信号作为对照记录；
32.图12示出a)nad

生物传感器的工作原理。b)根据一些实施方案，说明了在微流体系统中利用生物传感器的nad

检测；
33.图13示出了a)nad

量子点传感器，cdse-核cds(2ls)/cd
0.5
zn
0.5
s(3l)/zns(2ls)多壳量子点的合成方案。b)根据一些实施方案的基于nad

量子点的传感器的工作原理；
34.图14示出了微流体中的nad

检测量子点传感器。a)通过光电倍增管(photomultipliertube，pmt)检测到的由与各种浓度的nad

混合的qd传感器获得的液滴信号。b)根据一些实施方案的混合液滴的荧光显微图像，比例尺＝100μm；
35.图15示出了荧光液滴的pmt信号。根据一些实施方案，采样率可以达到300khz；
36.图16示出了根据一些实施方案的微流体分选芯片设计的示意图；
37.图17示出了液滴分选芯片的分选性能。分选样品由包含红色荧光的10％阳性液滴和90％空(或空白)液滴组成。a)当脉冲触发器关闭时，液滴流向废物通道。b)当脉冲触发器打开时，液滴流向收集通道。c)分选之后从废物通道收集的液滴。d)分选之后从收集通道收集的液滴。比例尺为50μm。根据一些实施方案，使用其在450nm处的直接荧光检测对nad(p)h进行分选之后的荧光图像，e)收集器中的液滴，和f)废物通道中的液滴；
38.图18示出了根据一些实施方案的分选之后在收集通道中和废物通道中的包含表达来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)的大肠杆菌的荧光液滴的图像；
39.图19示出a)微注射装置的操作示意图。b)根据一些实施方案，如用两个正交荧光信号确定的用于液滴合并的装置的性能；
40.图20a示出了根据一些实施方案的用不同变体的裂解细胞的外消旋2-辛醇(1mm)的氧化的时间进程；
41.图20b示出了(r)-2-辛醇与纯化的野生型cpsadh或突变体的氧化的反应过程。反应在24℃下在1ml包含纯化的cpsadh或突变体(1.5μm)、(r)-2-辛醇(1mm)和nad

(2mm)的磷酸盐缓冲液(100mm，ph8.0)中进行。根据一些实施方案，nadh浓度用紫外分光光度计在340nm处确定；
42.图21示出对于nad

再生在5ml反应体积中在24℃下在丙酮(2％v/v)的存在下利用表达cpsadh或突变体的大肠杆菌细胞(5gcdw/l)的外消旋-2-辛醇(10mm)氧化为酮2a的转化持续4小时和24小时。根据一些实施方案，2-辛醇和2-辛酮的浓度通过gc分析确定；
43.图22示出了根据一些实施方案的通过经由级联反应的nadh产生和检测的环氧化物水解酶(eh)作为辅因子非依赖性酶的活性测定的示意图；
44.图23示出了根据一些实施方案的由a)液滴中环己烯环氧化物的级联水解和氧化以及b)液滴中苯乙烯氧化物的级联水解和氧化产生的nadh；
45.图24示出了根据一些实施方案的对于通过单细胞封装的苯乙烯氧化物的异构化和经由级联反应的nadh产生的苯乙烯氧化物异构酶(soi)的活性测定的示意图；
46.图25示出了根据一些实施方案，a)对于通过单细胞封装和表面展示酶的2-辛醇的氧化的醇脱氢酶(cpsadh)的nadh依赖性活性测定，以及b)大肠杆菌细胞中cpsadh的表面展示系统的质粒构建的示意图；
47.图26示出了通过细胞生长策略的酶筛选。a)p450单加氧酶(p450pyr)催化的烷烃羟基化和经由级联反应产生的nadh的检测的示意图。b)根据一些实施方案，实现可检测的反应转化率所需的细胞数量；以及
48.图27示出a)封装的大肠杆菌(p450pyr)细胞在液滴中的生长。b)根据一些实施方案，在不同生长条件下的液滴中的细胞计数。
具体实施方式
49.本文描述了用于筛选酶的系统和方法。这些系统和方法可以用于筛选复数种酶变体，每种酶变体包含在液滴内的细胞中。虽然存在一些用于筛选酶的微流体系统，但这些系统存在显著缺陷。例如，某些现有的基于微流体的筛选平台使用标记的底物或辅因子(例如nadh)的比色检测以筛选酶。然而，这种方法灵敏度低并且需要预先添加高浓度的nadh，导致在识别阳性酶变体中的准确性低。这样的现有系统需要酶包含辅因子。此外，这些现有筛选过程的通量可能是低的，并且还可能基于特定液滴的吸光度。这种方法还需要酶产生nadh以产生比色信号，但对于不产生nadh的酶促反应无效。
50.相比之下，本文公开的系统(例如，流体系统、微流体装置)和方法可以筛选辅因子(例如，nadh)依赖性或非依赖性的酶促反应。当筛选辅因子非依赖性酶时，可以配置检测试剂例如检测酶以与目标产物反应(例如，在辅因子依赖性的反应中)以产生信号(例如，发光信号，荧光信号)。在这样的情况下，酶促反应可以不依赖或不包含辅因子，而检测试剂被配置成包含辅因子。例如，在一些实施方案中，检测试剂为检测酶，该检测酶与目标产物反应以产生后续产物，并且还可以与辅因子反应或相互作用(例如，经由氧化还原反应)以产生辅因子的氧化还原对。后续产物可以被配置成产生发光信号以筛选液滴内的靶酶的酶促反应(或以其他方式检测、分选和/或分离产生发光信号的液滴)。以这样的方式，检测酶将靶酶的酶促反应的活性与通过检测酶和后续产物产生的发光信号间接地联系起来。在包含靶酶(和检测酶)的液滴内产生的这种发光信号(或者两个或更多个发光信号)可以用于将这种目标液滴与不包含期望酶活性或者不包含靶酶(或者靶酶的变体，即空白液滴)的不期望的液滴进行分选。
51.信号可以为发光信号，例如荧光信号、生物发光信号或化学发光信号。有利地，使用发光信号用于筛选或检测避免了基于比色或吸光度的检测方法的缺点，例如低灵敏度。即，基于发光的检测和筛选通常比比色检测更灵敏，因此与某些现有的酶筛选系统和装置相比，本文描述的系统和方法对于筛选或检测包含目标酶变体的液滴可以更灵敏或更具选择性。在一些实施方案中，可以在相同(或不同)液滴内产生两个或更多个不同的发光信号(例如，第一发光信号、第二发光信号)，并且每种发光信号可以提供关于液滴(或者系统的其他组分，例如流体)的不同信息(例如液滴内的细胞数量)，和/或与辅因子相关的信息(例如，辅因子浓度、酶活性)。
52.图1a至图1e提供了示出通过酶(例如靶酶、酶变体)和一种或更多种检测试剂产生发光信号的示意图。在图1a中，液滴110布置在微流体通道111内，液滴110包含单细胞112并且单细胞112包含针对特定特性(例如，如本文别处所述的一种或更多种特性)被筛选的靶酶114。还布置在微流体通道111内的是反应底物116a、辅因子120a和检测试剂122。这些试剂可以合并(例如，在合并区域内)到液滴中。例如，在图1b中，液滴110包含反应底物116a、辅因子120a和检测试剂122以及细胞112。在一些实施方案中，合并电极组可以促进将一种或更多种试剂引入和/或合并到液滴中(未图示)。
53.为了促进发光信号的产生，在一些实施方案中，细胞可以在液滴内被裂解(例如，
使用裂解缓冲液)，使得细胞的组分(包括靶酶)可以与添加至液滴的试剂反应或相互作用。液滴内的细胞的裂解可以在将另外的试剂引入至液滴之前或之后发生，以及也可以在细胞的孵育之前或孵育之后发生。在一些实施方案中，在细胞裂解之前和/或之后将另外的试剂引入至液滴中。然而，应该理解，在一些实施方案中，一种或更多种试剂可以能够扩散至细胞中(经由其细胞膜)，使得并不总是需要细胞的裂解。此外，在一些实施方案中，靶酶可以展示在细胞表面上，使得对于靶酶与试剂或另外的试剂反应或相互作用，不需要裂解。
54.在图1c中，细胞112已经裂解，使得靶酶114可以与反应底物116a相互作用。靶酶114被配置成对反应底物116a转化为目标产物116b进行催化。有利地，将细胞封装在液滴内可以防止细胞的内容物与包含用于筛选的酶的其他细胞不期望的合并(例如，细胞的合并或融合)。以这种方式，每个液滴可以充当待表达的单个靶酶或酶变体的环境，而不受包含在其他液滴(例如，包含具有其他靶酶的其他细胞的其他液滴)中的其他靶酶或酶变体的不期望的影响。然而，应注意尽管图1a至图1b示出了单个细胞在液滴内的封装，但也可以将复数个细胞封装在液滴内(未示出)。在液滴包含复数个细胞的这样的实施方案中，在每个细胞内(直接或间接地)的每种靶酶可以产生发光信号。可以将复数个细胞封装在液滴中，或者可以将单个细胞封装在液滴中并增殖(例如，繁殖)成复数个细胞，每个细胞均包含靶酶。在一些这样的实施方案中，可以裂解细胞，这样液滴的发光信号可以为液滴内的每个细胞的每个靶酶的发光信号的平均值(例如，细胞归一化平均值)或累积(也未示出)。
55.靶酶可以在辅因子非依赖性的反应中将反应底物转化为目标产物。例如，在图1c中，靶酶114对反应底物116a转化为目标产物116b进行催化。在一些实施方案中，靶酶114的酶促反应不涉及或不依赖于与辅因子120a的相互作用。在目标产物116b不直接地产生发光信号的情况下，可以将一种或更多种检测试剂例如检测试剂122配置成在一个或更多个反应中利用目标产物116b以产生发光信号。
56.在一些实施方案中，检测试剂被配置成与靶酶的目标产物反应(或者对反应进行催化)，并且还可以被配置成与一种或更多种辅因子反应或相互作用。即，在一些这样的实施方案中，虽然靶酶可以对不直接涉及辅因子的反应进行催化，但是检测试剂可以被配置成直接与辅因子反应或相互作用。以这种方式，所公开的系统和方法可以用于筛选不直接涉及辅因子的靶酶(即，靶酶对不依赖于辅因子的存在的反应进行催化)。例如图1d示意性地示出了通过检测试剂122(例如检测酶)和辅因子120a将目标产物116b转化为发光产物116c，发光产物116c产生了发光信号140。辅因子120a在检测试剂122与目标产物116b反应时伴随地被氧化或还原为氧化还原对120b。氧化还原对120b与辅因子120a相关，因为两者是彼此的氧化还原对(即，经由一个或更多个氧化还原反应彼此相关)。
57.在一些实施方案中，辅因子的氧化还原对可以与检测试剂反应或相互作用。例如图1e示意性地示出了其中氧化还原对120b与检测试剂122反应以从检测试剂122中产生发光信号140的实施方案。例如，检测试剂122可以为经配体功能化的量子点，其可以与辅因子相互作用以产生(或淬灭)荧光信号。应该理解，在一些实施方案中，在液滴110中可以存在多于一种检测试剂，使得图1e中所示的氧化还原对120b可以通过检测酶产生(例如，如图1d中所示)。在一些实施方案中，图1e中所示的氧化还原对120b可以通过靶酶产生(例如，如图1f中所示)。如下面更详细讨论的，发光信号140可以用于筛选、检测和/或分离包含目标靶酶的液滴。
58.在一些实施方案中，筛选、检测和/或分离酶(例如，靶酶、酶变体)涉及不需要检测试剂来产生发光信号的酶促反应。即，靶酶可以在辅因子的氧化或还原时直接产生荧光信号。通过图示的方式，在图1f中，靶酶114对反应底物116a转化为目标产物116b进行催化，伴随辅因子120a的氧化或还原以形成氧化还原对120b，氧化还原对120b被配置成发射发光信号140。在一个示例性实施方案中，辅因子为nad 以及氧化还原对为nadh，其可以在从nad

还原至nadh时产生发光信号(例如，荧光信号)。
59.图2示出了用于筛选包含在液滴内的细胞内的酶(例如，靶酶、酶变体)的系统的示意图。微流体装置200包括第一试剂室210和第二试剂室212。第一试剂室可以包含或被配置为配置成包含细胞(例如，单个细胞)，其中每个细胞包含靶酶或靶酶的酶变体。在一些实施方案中，第一试剂室还可以包含其他试剂，例如表面活性剂、缓冲剂、辅因子和/或用于培养和/或增殖细胞的试剂。第二试剂室可以包含或被配置成包含反应底物，其中每个靶酶或酶变体被配置成对反应底物向目标产物的酶促反应进行催化。在一些实施方案中，第二试剂室还可以包含其他试剂，例如表面活性剂、缓冲剂、辅因子和/或用于培养和/或增殖细胞的试剂。
60.微流体装置200还可以包括载液室214。载液室可以包含或被配置成包含载液，例如油。在一些实施方案中，选择载液使得其与第一试剂室和/或第二试剂室的试剂(或包含该试剂的液体)不混溶。例如，如果第一试剂室或第二试剂室包含水溶液或基于水的试剂，则载液室可以包含与水不混溶的油。载液的非限制性实例包括油，例如烃油、矿物油、氟化油和/或有机硅油。其他载液也是可能的。在另一些实施方案中，载液可以与一些或所有试剂或者包含一些或所有试剂的液体混溶，如本公开内容所如此限定。
61.如以上和本文其他地方所述，可以将包含酶的每个细胞封装至液滴中，并且液滴还可以包含其他试剂(例如，辅因子、培养试剂)以促进反应底物转化为目标产物并用于检测目标产物(例如，经由一种或更多种检测试剂)。液滴可以形成在合并区域(例如，第一试剂室和/或第二试剂室的试剂流体与载液接触的地方)处或合并区域内。
62.在一些实施方案中，将电极组邻近合并区域定位以促进试剂(例如，检测试剂)合并至液滴中。例如，在图2a中，合并电极218与合并区域216相邻。合并电极可以通过控制相对于液滴和/或试剂由电极施加的电势来促进对在液滴内合并的试剂的体积的控制。
63.在另一些实施方案中，液滴可以在芯片外产生，然后随后被引入至系统或方法中。
64.其中至少一些包含具有靶酶的细胞的复数个液滴可以流入孵育区域以提供时间用于靶酶对反应底物的反应进行催化。例如，在图2a中，孵育区域220包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室222和第二孵育室224。如图中所示，孵育区域的室可以通过具有较小的最大截面横向尺寸的通道连接，随着通道朝向较大面积的相邻室移动，后接具有较大的最大截面横向尺寸的相邻室。这样的配置可以用于调节对每个液滴内的细胞孵育提供的时间。在某些现有的微流体系统中已经避免了这样的配置(例如，具有相对大的最大截面横向尺寸的通道与具有相对小的最大截面横向尺寸的通道直接相邻)，因为认为它可能导致形成气泡或不利地影响流量和/或导致装置堵塞，但在本公开内容的上下文中已经认识到并理解，这样的配置可以用于在液滴内充分地孵育细胞，并且在一些情况下，用于调整孵育区域内液滴的孵育时间。在一些情况下，细胞可以在孵育区域内培养和/或增殖(例如，生长)。在一些实施方案中，细胞可以在孵育区域和/或装置中的流体和/或液滴的连
续流动期间培养和/或增殖。有利地，本文所述的孵育区域的配置还可以提供为以相对连续的次序筛选液滴。例如，如果复数个液滴(其中至少一些包含靶酶或酶变体)以特定顺序进入孵育区域，则当复数个液滴离开孵育区域时，该顺序可以至少部分地保留。孵育区域还可以包括另外的孵育室(例如，第三孵育室、第四孵育室、第五孵育室等)，例如图2a中所示的另外的孵育室226。鉴于本公开内容的教导，本领域技术人员将能够基于期望的孵育时间和/或培养步骤选择孵育区域内的孵育室的适当数量和尺寸。
65.在一些实施方案中，包含复数个液滴的流可以例如在离开孵育区域之后穿过气泡捕集器。在一些这样的实施方案中，气泡捕集器可以有利地去除和/或减小在孵育区域(或孵育室)中细胞的流动或孵育期间形成的任何气泡的尺寸。通过图示的方式，在图2a中，气泡捕集器227邻近孵育区域并在孵育区域的下游定位。在这样的配置中，气泡捕集器227可以在流从孵育区域220流向液滴分选区域230时从该流中去除气泡。任选地，气泡捕集器227可以包括用于附接至真空229的真空端口228。真空可以用于将气泡捕集器置于减压下以促进从系统200内的流(flow)或流(stream)中去除气体。在一些实施方案中，气泡捕集器包括膜、压痕、突起、表面活性剂或可以去除和/或减小通道中气泡尺寸的任何其他合适特征。气泡捕集器可以例如位于通道中、通道上和/或邻近通道。
66.液滴分选区域可以用于将以适当阈值或高于适当阈值包含靶酶的液滴(即，目标液滴、包含具有一种或更多种特性的酶的液滴)与不期望的液滴或不表达靶酶的液滴、不以足够的阈值表达靶酶(例如，不具有一种或更多种特性的酶)的液滴、和/或不包含任何细胞的液滴(例如，空白液滴)分离。例如，在图2a中，液滴分选区域230与孵育区域220和气泡捕集器227相邻并且在孵育区域220和气泡捕集器227的下游。在孵育之后，包含各自具有靶酶的一个或更多个细胞的一个或更多个液滴可以进入液滴分选区域，在其中它们可以相应地被筛选和分选。液滴分选区域包括检测区232用于检测穿过检测区的复数个液滴中的每个液滴内的发光信号(例如，荧光信号)。液滴分选区域还包括分选电极组240用于将目标液滴朝向收集通道250吸引或推动，如通过由包含靶酶的液滴产生的发光信号(或发光信号的比率)所确定的。检测区232可以与分选电极组240电子通信以便提供信号以分选(或不分选)液滴。检测区232还可以与控制器(例如，微控制器)和/或位于上游或下游位置的一个或更多个检测器电子通信。在一些实施方案中，检测区包括两个或更多个检测器，包括第一检测器和第二检测器。在一些情况下，第一检测器定位在分选电极的上游，并且第二检测器定位在分选电极的下游。在另一些实施方案中，两个检测器均定位在分选电极的上游。其他配置也是可能的。
67.在一些实施方案中，分选区域230可以任选地包括间隔流体室，所述间隔流体室包含或被配置成包含间隔流体。间隔流体室可以在交叉处与包含液滴的通道合并。有利地，间隔流体室可以提供或引入用于间隔或分离进料液滴的间隔流体，这可以促进或改善发光信号的检测或液滴的分选。如果存在的话，间隔流体可以与载液室内的载液相同或不同。
68.不含目标靶酶(例如具有一种或更多种特性的酶)的液滴可能不产生合适的发光信号。例如，在图3a中，不包含目标靶酶的液滴可以不被吸引至分选电极240并且将通过废物通道260。然而，在一些情况下，没有被吸引至分选电极240的液滴可以转到系统或微流体装置的不同部分，例如上游部分用于进一步孵育(未图示)。关于液滴分选的另外细节在本文别处描述。
69.应注意，本文所述的各种区域、区和/或室可以经由区域、区和/或室之间的液滴和液体可以流动通过的一个或更多个通道、室或导管而彼此连接和/或流体连通。例如，第一通道(例如，收集通道)可以与分选区域连接并且与其流体连通，以及第二通道(例如，废物通道)也可以与分选区域连接并且与其流体连通。然而，可以存在另外的通道或导管。例如，通道可以将孵育区域与分选区域连接，分选区域可以具有连接上游位置的通道以允许液滴更多的时间用于孵育，和/或导管可以将合并区域与孵育区域连接。当然，区域、区和/或腔室(和/或系统内的其他通道)之间的其他连接是可能的，并且鉴于本公开内容的教导，本领域普通技术人员将能够选择在本文描述的各种区域、区和/或腔室之间的合适的通道或导管。
70.在一些实施方案中，微流体装置200还包括收集室252和废物室262。收集室被配置成储存包含以期望阈值或高于期望阈值运行(例如，具有一种或更多种特性)的靶酶的液滴，而废物室被配置成储存不包含靶酶或不包含具有一种或更多种特性的靶酶的液滴。收集室还可以被配置成对每种靶酶进行测序(或包括用于对每种靶酶进行测序的试剂)。这可以有利地允许使用者对比其他变体(例如，收集在废物室中的没有以足够快的反应速率运行的酶变体)表现更好(例如，具有更快的反应速率)的酶变体进行测序。
71.如上所述，例如，当某些靶酶以特定速率或以特定活性运行时，本文所述的系统和方法可以用于筛选、检测、分选和/或分离包含特定靶酶的液滴(或包含在液滴中的细胞)。例如，根据一些实施方案，所公开的系统和方法可以用于筛选包含复数种酶变体的酶文库。每种酶变体可以以不同的速率催化反应(例如，将反应底物转化为目标产物)，并且可以期望筛选和/或分离例如以更快的速率反应的酶变体。因此，可以筛选和/或分选包含至少部分地基于酶变体的活性而产生(或淬灭)发光信号的靶酶的液滴，同时可以避免、拒绝包含不具有期望酶活性(因此不产生或淬灭发光信号)的靶酶的液滴或者对包含不具有期望酶活性(因此不产生或淬灭发光信号)的靶酶的液滴提供更多的孵育时间。
72.如上所述，本公开内容的系统和方法允许针对一种或更多种特性筛选酶。在一个实例中，酶的一种或更多种特性为酶活性、在各种温度和/或ph下的酶稳定性、酶特异性、立体选择性、转化非天然底物的能力。为了确定酶稳定性，可以将包含酶的液滴在各种温度或ph下孵育并针对活性而筛选酶。可以筛选的酶特性的其他实例包括但不限于化学选择性、区域选择性、在溶剂存在下的稳定性、温度稳定性、溶解性、在单一宿主生物体中的表达水平、在多种宿主生物体中的表达水平、新酶的发现和已知酶的新功能的发现。当然，其他特性也是可能的。
73.本公开内容还可以提供用于筛选酶的方法，用于提高其天然底物的转化、提高其非天然底物的转化、提高催化活性、提高立体选择性、提高热稳定性、提高在预定ph范围内的稳定性、或其组合。本公开内容还可以提供用于以下的方法：增加化学选择性、增加区域选择性、增加在溶剂例如水混溶性溶剂存在下的稳定性、增加溶解性、增加在单一宿主生物体中的表达水平、增加在多种宿主生物中的表达水平、新酶的发现、已知酶的新功能的发现、蛋白质和酶工程、定向酶进化或合理设计酶工程。
74.如上所述，在一些实例中，酶(例如，靶酶)是氧化还原辅因子依赖性酶。在一些这样的实例中，酶为氧化还原辅因子非依赖性酶，并且当在目标产物被检测酶进一步转化为后续产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射信号。例如在级联反应中，可以使用多于
一种检测酶。本领域技术人员通常将理解级联反应可以涉及多个步骤的酶促反应。检测酶可以为辅因子依赖性酶或辅因子非依赖性酶。当仅使用一种检测酶时，检测酶通常为辅因子依赖性酶。当使用多于一种检测酶时，至少一种检测酶为辅因子依赖性酶。在其他实例中，酶为氧化还原辅因子非依赖性酶。
75.检测酶的实例包括但不限于醇脱氢酶(adh)、醛脱氢酶、胺脱氢酶。通常将理解，选择的特异性检测酶取决于所产生的目标产物。如果使用多于一种检测酶，则可以选择一种或更多种依赖于特定辅因子的检测酶。
76.在一些实例中，酶在宿主细胞中表达并且复数个液滴还包含宿主细胞或其片段。宿主细胞可以为真核细胞、原核细胞、古菌细胞、真菌、原生动物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或藻类细胞。在一个实例中，宿主细胞为大肠杆菌细胞。宿主细胞的片段可以通过宿主细胞的裂解产生。
77.在一些实施方案中，目标产物被辅因子依赖性检测酶转化为后续产物。当在目标产物被辅因子依赖性检测酶转化为后续产物时辅因子被氧化或还原时发射信号。
78.在各种实施方案中，目标产物可以被第一检测酶转化为第一后续产物，其中第一检测酶是辅因子非依赖性酶，并且第一后续产物被第二检测酶进一步转化为第二后续产物酶，其中第二检测酶是辅因子依赖性酶。当在第一后续产物被第二检测酶进一步转化为第二后续产物时辅因子被氧化或还原时发射信号。
79.在一些实施方案中，酶(例如，靶酶)是氧化还原辅因子依赖性酶，并且当在反应底物被酶转化为目标产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射信号。
80.在一些实施方案中，酶(例如，靶酶)是细胞内酶、表面展示酶或细胞外酶。本领域技术人员将理解，可以通过本公开内容的方法筛选任何酶。酶可以为天然酶或合成酶。在一些实例中，酶是近平滑念珠菌(candida parapsilosis)(cpsadh)，来自鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas sp.)hxn-200的环氧化物水解酶(speh)、苯乙烯氧化物异构酶(soi)、p450单加氧酶(p450pyr)、来自红球菌属(rhodococcus)的胺脱氢酶(amdh)、或者丁二醇脱氢酶(bdha)，但不限于此。
81.在一些实施方案中，酶(例如，靶酶)是选自酶变体文库或选自多种单一酶文库的酶变体。酶变体文库可以是预先存在的酶变体文库或者可以是基于已经用本公开内容的方法筛选的酶产生的酶变体文库。应理解，来自本公开内容的经筛选的酶可以用于产生酶变体文库，其中该产生的文库的变体使用本公开内容的方法进行另一轮筛选。可以进行多轮筛选和文库产生。
82.在另一个实施方案中，酶是选自不同酶的组的酶。例如，不同酶的组可以为宏基因组文库或来自数据库的合成序列。因此，本公开内容的方法可以用于筛选用于蛋白质和酶工程或定向酶进化的酶变体，或者为了酶发现而筛选不同酶。
83.在一些实施方案中，所述系统和方法包括一个或更多个微流体液滴。本公开内容的方法中使用的液滴可以为油包水液滴、水包油包水液滴、水包油液滴和水凝胶液滴。
84.本文所述的液滴可以具有任何合适的尺寸(例如，直径)。在一些实施方案中，液滴的直径大于或等于10μm、大于或等于20μm、大于或等于30μm、大于或等于40μm、大于或等于50μm、大于或等于60μm、大于或等于70μm、大于或等于80μm、或者大于或等于90μm、或者大于或等于100μm。在一些实施方案中，液滴的直径小于或等于100μm、小于或等于90μm、小于或
等于80μm、小于或等于70μm、小于或等于60μm、小于或等于50μm、小于或等于40μm、小于或等于30μm、小于或等于20μm、或者小于或等于10μm。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于10μm且小于或等于100μm)。其他范围是可能的。
85.本文所述的各种实施方案可以包括一种或更多种辅因子。在一些实施方案中，辅因子可以经历一种或更多种化学反应(例如，氧化-还原反应)以形成辅因子的氧化还原对。在一些实施方案中，辅因子可以直接产生发光信号或可以间接参与一种或更多种化学反应以产生发光信号或引起另一种化学物质产生发光信号。在一些实施方案中，辅因子选自nad

、nadh、nadp

、nadph、nad

和nadp

以及nadh和nadph。然而，其他辅因子也是可能的，因为本公开内容不限于此。通常应理解，当氧化还原辅因子为nad 或nadp 或两者时，当nad 或nadp 或两者被还原时发射信号。类似地，当氧化还原辅因子为nadh或nadph或两者时，当nadh或nadph或两者被氧化时发射信号。在一个实例中，检测到的信号为nadph或nadh或两者的荧光。
86.如本文别处所述，复数个液滴中的每个液滴还可以另外包含一种或更多种检测试剂，所述一种或更多种检测试剂与氧化或还原的氧化还原辅因子反应以产生发射信号。本领域技术人员将理解所使用的检测试剂取决于液滴中的氧化还原辅因子。在一些实施方案中，检测试剂为被配置成与辅因子(或辅因子的氧化还原对)反应以产生发光信号的荧光染料。在一些实施方案中，检测试剂为被配置成与靶酶的目标产物反应的检测酶。在一些实施方案中，检测试剂包含配置有分子(例如，配体，l)的量子点，其可以与辅因子(或辅因子的氧化还原对)相互作用以产生发光信号。
87.可以使用能够与辅因子(或辅因子的氧化还原对)相互作用的任何合适的荧光染料。在一个实例中，当氧化还原辅因子为nadh或nadph或两者时，一种或更多种检测试剂为刃天青和心肌黄酶。nadh和/或nadph在心肌黄酶存在下与刃天青反应以得到试卤灵。然后检测由试卤灵发射的信号。然而，其他荧光染料也是可能的，因为本公开不限于此。
88.可以选择检测酶使得其与靶酶反应的目标产物反应。在一个实例中，当氧化还原辅因子为nadh或nadph或两者时，一种或更多种检测试剂为前萤光素(proluciferin)、萤光素酶、还原酶、atp和mg
2
。前萤光素在nadh和/或nadph的存在下被还原酶还原为d-萤光素，并且d-萤光素在mg
2
和atp的存在下被转化为氧化荧光素。然后检测到由氧化荧光素发射的信号。然而，其他检测试剂(例如，检测酶)也是可能的，因为本公开内容不限于此。鉴于本公开内容的教导，本领域普通技术人员将能够选择合适的检测试剂以产生用于筛选一种或更多种靶酶的发光信号。
89.在一些实施方案中，检测试剂包含量子点(即，纳米晶体)。量子点可以被配置或功能化以在与辅因子或辅因子的氧化还原对反应或相互作用之后产生或淬灭荧光信号。例如，在一些实施方案中，氧化还原辅因子为nadh、nadph、nad 、nadp 、nad 和nadp 或者nadh和nadph，一种或更多种检测试剂为量子点。量子点的非限制性实例包括cds、cdse、zns、znse和/或cdzns。其他量子点也是可能的。
90.量子点可以被功能化(例如，表面功能化)或与配体l缀合，其可以与辅因子反应(例如，氧化、还原)或相互作用以产生或淬灭荧光信号。不希望受任何特定理论束缚，配体可以经由荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，fret)机制与量子点相互作用。辅因子可以接近或接触配体和/或量子点并使量子点与配体之间的fret激
活或失活，从而产生(或淬灭)信号，该信号可以被检测器(例如，在检测区或分选区域中的检测器，在分选区域上游的检测器)利用以启动或停止液滴分选。
91.在一个示例性实施方案中，量子点的配体包括尼罗蓝(即[9-(二乙基氨基)苯并[a]吩嗪-5-亚基]氮硫酸盐)或其类似物。在一些实施方案中，配体包含式(i)：
[0092][0093]
其中r1选自包括以下或者由以下组成的组：酰氨基、氨基和二氨基；r2选自包括以下或者由以下组成的组：烷基(例如甲基、乙基)、羧基(例如乙酰基)和磺酰基(例如-ch2ch2so3h)；r3选自包括以下或者由以下组成的组：烷基、羧基(例如乙酰基)和磺酰基(例如-ch2ch2so3h)；r4选自包括以下或者由以下组成的组：氢和羟基；r5选自包括以下或者由以下组成的组：氢和磺酰基(例如-so3h)。在一些实施方案中，r1还可以将配体与量子点键合或缀合。在一些实施方案中，尼罗蓝的类似物包含式(i)。
[0094]
在一些实施方案中，检测试剂包括生物传感器(例如蛋白质生物传感器)作为生物传感器的一个非限制性实例。生物传感器可以被配置成与辅因子(或辅因子的氧化还原对)反应以产生(或淬灭)发光信号。发光信号的产生(或淬灭)可以用于检测、筛选和/或分离含有靶酶的液滴。在一个实例中，蛋白质生物传感器包括荧光芯结构域和二分nad 和/或nadp 结合结构域。荧光芯结构域的激发在488nm处，发射在520nm处。在存在nad 和/或nadp 的情况下，来自芯结构域的荧光通过nad 和/或nadp 与二分结合结构域的结合而淬灭。
[0095]
在一些实施方案中，液滴内的酶(例如，靶酶)的活性直接或间接引起发光信号的产生。发光信号可以为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号。在一些实施方案中，发光信号可以用于筛选、检测和/或分离包含目标酶(例如，靶酶)的液滴。例如，包含靶酶的液滴(其中靶酶进行期望反应)可以产生发光信号并被分选至收集室中。然而，在一些情况下，关于参照信号，可以不存在发光信号以触发筛选和/或分选。
[0096]
在一些实施方案中，参照信号为来自参考酶的信号。参考酶可以为野生型酶、突变酶、嵌合酶(chimeric enzyme)或酶变体。在一些实施方案中，参照信号为已知强度或水平的信号，例如来自荧光团的荧光信号或生物发光信号。在一些实施方案中，参照信号为具有大于或小于参照的预定强度或水平的信号。在一些实施方案中，确定导出信号(例如，第一发光信号与第二发光信号的比率)。在一些实施方案中，将导出信号跟参照信号进行比较。在另一些实施方案中，参照信号可以为无信号、不可检测的信号或者无法与噪声区分的信号。
[0097]
在一些实施方案中，可以在液滴内(例如，从液滴内的检测试剂、从液滴内的辅因子)产生两个或更多个不同的发光信号。即，可以在液滴内产生第一波长的第一发光信号和第二波长的第二发光信号，其中第一波长和第二波长不同。有利地，在发光为荧光的情况下，产生两个或更多个不同的发光信号可以例如通过减少从激发源(例如，激发光、激发激光)产生的背景噪声来提高检测靶酶的灵敏度，并且可以使用激发源以产生荧光信号。
[0098]
在一些实施方案中，两个(或更多个)不同的发光信号(例如，在相同或不同的液滴内产生的)可以确定液滴的两种(或更多种)不同的特性。例如，第一发光信号可以确定液滴内的细胞数量，以及第二发光信号可以指示液滴内辅因子的存在(例如浓度)。也可以确定其他特性。如本文所述，可以使用单个检测器或者两个或更多个检测器来检测两个或更多个信号。在一些实施方案中，第一发光信号和/或第二发光信号(或其微分)可以指示液滴的特性和/或用信号表示涉及液滴的系统或方法的功能。在一些实施方案中，第一发光信号和第二发光信号的比率可以指示液滴的特性和/或或用信号表示涉及液滴的系统或方法的功能，例如液滴是如何分选的。可以用信号表示其他功能。
[0099]
如本文别处所述，检测器可以用于检测发光信号(例如，荧光信号)。检测器可以测量发光信号的强度或强度大小。虽然检测器可以位于分选区域的检测区内，但一个或更多个检测器也可以位于分选区域的上游或下游位置。一个或更多个检测器(或者与检测器可操作地相关联的控制器)可以数字化或以其他方式电子转换信号，例如第一发光信号、第二发光信号和/或第一发光信号与第二发光信号的比率，其可以提供例如用于如本文别处更详细讨论的对液滴进行分选的信息。例如，第一发光信号、第二发光信号或(例如，来自单个液滴的)第一发光信号和第二发光信号的变形(例如，比率)可以被传输至反馈控制或控制器(例如，微控制器)，其将发光信号与预编程信号或预定信号进行比较。在一些这样的实施方案中，比较可以使流体系统或公开的方法的液滴分选或一些其他功能或步骤激活或失活。例如，比较可以确定是否将电压施加至分选电极组以(例如经由电泳力)开始分选(例如，包含靶酶的)目标液滴。在一些实施方案中，用施加至分选电极组的电压确定目标液滴是否分选至第一通道(例如，收集通道)或第二通道(例如，废物通道)中。在一些实施方案中，向合并电极组施加电压以促进一种或更多种试剂(例如，检测试剂)合并至液滴中。其他功能可以通过信号(例如第一发光信号、第二发光信号和/或第一发光信号与第二发光信号的比率)的比较成为可能，因为本公开内容不限于此。
[0100]
例如，在一些实施方案中，可以将第一发光信号和/或第二发光信号(或其微分)传输至反馈控制或控制器(例如，微控制器)以确定(例如，在孵育区域中的)液滴的流量是否应该被调整。例如，孵育时间可以通过这样的控制机制来调整：其中反馈控制或控制器与流动源(例如，诸如泵或真空的压力源)电连接。因此，在液滴中检测到的信号可以提供对液滴的流量和/或孵育时间的反馈控制。
[0101]
如上所述，本文所述的系统和方法可以用于筛选液滴内的产生(或淬灭)发光信号的酶(例如各自在复数个细胞内的酶变体、各自在复数个液滴内的酶变体)同时拒绝不包含靶酶或者其中靶酶不具有一种或更多种特性并因此不产生(或淬灭)发光信号的液滴。为了检测包含靶酶的液滴，检测器可以感测或检测发光信号或以一些特定阈值(例如，预定值)的发光信号的变化。高于此阈值的液滴可以被收集，而低于此阈值的液滴可以被废弃(反之亦然)或者返回上游通道，例如上游孵育区域或孵育通道。在一些实施方案中，检测器耦合
至分选电极组，其可以在低于特定阈值“关闭”并且在高于特定阈值打开”。这样，可以从低于特定阈值的液滴中分选出高于特定阈值的液滴。图4a和4b说明了该特征。图4a是分选区域的一部分的示意图。在图4a中，分选电极340关闭，使得目标液滴410和不期望的液滴420在它们流向收集通道350和废物通道360时不被分选。然而，在图4b中，当电极打开时(例如，通过从检测器接收的信号)，目标液滴410经由由分选电极340产生的吸引力流至收集通道360，同时不期望的液滴420不被吸引至分选电极340并且相反流向废物通道360。不希望受任何特定理论的束缚，电极可以将高于特定阈值的液滴吸引(例如，经由静电力、介电泳)至收集通道或收集室，同时低于特定阈值的液滴不被分选至收集通道或收集室。
[0102]
可以使用任何合适的检测器来检测发光信号。检测器可以被配置成检测电磁辐射(即光)，例如由发光(例如荧光、生物发光、化学发光)产生的电磁辐射。在一些实施方案中，检测器被配置成检测多于一种波长。在示例性实施方案中，检测器包括光电倍增管(pmt)检测器。在一些实施方案中，检测器能够和/或配置成接收两个或更多个发光信号，例如双通道荧光检测器。然而，其他检测器也是可能的。在一些实施方案中，检测器还可以包括激发源例如以在激发能够发荧光的分子之后随后产生荧光信号。检测可以进一步包括或被配置成连接到镜头或照相机(例如，单色照相机)，其可以收集或帮助收集发光信号的强度。
[0103]
在一些实施方案中，检测器可以被配置成接收来自相同(或不同)液滴的两个或更多个单独的信号。例如，检测器可以被配置成从液滴接收至少两个信号(例如，在两个不同的波长下)，这可以用于为分选液滴提供更多信息。接收两个或更多个单独信号的细节在下文和本文别处更详细地讨论。
[0104]
在一些实施方案中，检测器可以被配置成将信号转换(例如，数字化)以与系统的其他组件进行电子通信。在一些这样的实施方案中，检测器可以包括一个或更多个控制器或与一个或更多个控制器进行电子通信，其还可以与系统的其他组件进行电子通信。在一些实施方案中，检测器(或检测器的控制器或与检测器电子通信的控制器)与分选电极组电子通信并且进一步配置成使电极打开或关闭(即，通过施加电压)以开始或停止对高于或低于特定检测阈值的液滴的分选。基于本公开内容的教导，本领域技术人员将能够选择特定的检测阈值以用于靶酶的期望筛选、分选和/或分离。
[0105]
在一些实施方案中，系统和方法可以涉及反馈控制，其中来自系统中的一个位置，例如下游位置(例如，检测区)的信号可以用于提供信息或(至少部分地)控制系统中另一个位置(例如上游位置)的功能(例如，孵育、流量)。在一些情况下，系统和方法可以涉及反馈控制，其中来自上游位置(例如，第一检测器上游的第二检测器)的信号可以用于为下游位置中的功能提供信息或(至少部分的)控制。例如，检测器(例如，第一检测器)可以从下游位置获得信号(例如，发光信号、荧光信号)，并且上游位置的功能(例如，流量、孵育时间)可以(至少部分地)基于来自下游信号而修改。作为另一个实例，在上游位置的第二检测器可以接收信号(例如，参照信号)并且检测区(例如，检测区内的第一检测器)可以接收来自第二检测器的信号，并且(至少部分地)基于从第二检测器接收的信号修改或控制下游功能(例如，检测、分选)。当然，其他反馈配置也是可能的。在一些实施方案中，控制器(例如，微控制器)可以与一个或更多个检测器和/或一个或更多个在系统中被控制的组件电子通信，并且可以传送信号和/或控制本文所述的实施方案的一个或更多个功能。
[0106]
在一些实施方案中，反馈控制涉及检测系统或方法中发生的一个或更多个信号
(例如，发光信号)、事件或过程。检测可以涉及例如确定靶酶的至少一个特性、流体内的组分、流体的特征、系统的区域内的组分之间的相互作用、和/或系统的区域(例如，分选区域)内的条件(例如，流量、分选阈值、温度、压力)。例如，检测可以涉及检测液滴的发光信号、液滴中一种或更多种组分的浓度、液滴内部或外部的一种或更多种流体的体积、一种或更多种流体(或流体内的液滴)的流量，以及第一发光信号和第二发光信号的检测之间的平均时间段，但不限于此。在一些实施方案中，一个或更多个特性、条件或事件的检测可以导致产生一个或更多个信号，所述一个或更多个信号可以任选地被进一步处理并传输至控制系统(例如，使用微控制器)。如本文更详细描述的，一个或更多个信号可以与预编程到反馈控制中的一个或更多个其他信号、值或阈值进行比较，并且可以用于向系统或方法提供反馈。
[0107]
在一些实施方案中，连续执行对来自一个或更多个检测器的信号的检测。在另一些实施方案中，周期性地执行对来自一个或更多个检测器的信号的检测。在一些实施方案中，检测器位于系统中的多个区域或不同区域(例如，与多个孵育室相邻)以监测液滴随时间的变化。例如，可以确定细胞生长随时间的变化。在一些情况下，检测到的信号可以用于提供系统内的另一个过程的反馈控制(例如，控制孵育时间、流量和/或分选)。
[0108]
可以使用本文描述的系统和方法产生和/或确定(例如，测量)多种信号或信号模式。在一些实施方案中，信号为发光信号或荧光信号。在一组实施方案中，信号包括强度分量。强度可以指示或用于指示例如以下中各项中的一者或更多者：液滴中组分的浓度、所检测的酶类型的指示、液滴中组分的量以及液滴的体积。在一些实施方案中，强度可以包括来自液滴内的一种靶酶或检测试剂的信号(例如发光信号)。在另一些实施方案中，强度可以包括来自液滴内的两种或更多种靶酶或检测试剂的信号。在一些这样的实施方案中，信号的强度可以为液滴内每个单独发光信号的平均值。在一些情况下，强度为来自液滴的发光信号的发光强度。其他强度的确定是可能的。
[0109]
在一些实施方案中，信号的频率可以由一个或更多个发光信号产生和/或确定。例如，可以通过检测器测量各自具有一定强度(例如，高于或低于阈值强度)的一系列信号。可以将该数字与预编程至反馈控制或其他单元(例如，微控制器)中的多个信号或值(具有高于或低于阈值强度的强度)进行比较。至少部分地基于该比较，反馈控制可以启动、停止或改变系统或方法内的功能例如流体流动的调整或液滴分选的激活/失活。
[0110]
在一些实施方案中，产生和/或确定信号(例如，发光信号)的持续时间。信号的持续时间可以指示或用于指示例如以下中的一者或更多者：分选、流体的流量、流体内的组分特性(例如，组分具有特定特性或活性(例如化学发光、荧光等)的时间多长)，以及特定液滴处于系统或方法的特定区域(例如，孵育区域)中多长时间。
[0111]
在一些实施方案中，产生和/或确定相对于随时间的第二位置或相对于另外的过程或事件(例如，在系统或方法中已经发生的)的随时间的信号位置。例如，可以在特定液滴穿过检测器(例如，包含具有一种或更多种特性的酶的液滴)时对检测器进行检测，并且该信号的时间可以与随时间的第二位置相关(例如，当启动检测时；过程发生之后的一定时间等)。在另一个实例中，可以在系统的组件(例如，分选电极组)被激活之后(或之前)在特定液滴穿过检测器时对检测器进行检测。
[0112]
在另一组实施方案中，产生和/或确定信号或事件之间的平均时间。例如，可以测量两个信号之间的平均时间段，其中各信号可以独立地对应于本文所述的一种或更多种特
性或条件。在另一些实施方案中，确定一系列相似信号的第一个和最后一个之间的平均时间(例如，穿过检测器的一系列洗涤流体之间的平均时间)。
[0113]
在一些实施方案中，产生和/或确定信号模式。信号模式可以包括例如以下中的至少两者(或者，在另一些实施方案中，至少三者或至少四者)：信号强度、信号频率、信号持续时间、相对于随时间的第二位置或相对于微流体系统中正在发生的(或者已经发生的)另外的过程或事件的随时间的信号位置，以及两个或更多个信号或事件之间的平均时间段。在另一些实施方案中，信号模式包括以下中的至少两者(或者，在另一些实施方案中，至少三者或至少四者)：第一信号的强度、第一信号的持续时间、相对于随时间的第二位置的随时间的第一信号位置、第二信号的强度、第二信号的持续时间、相对于随时间的第二位置的随时间的第二信号位置、以及第一信号与第二信号之间的平均时间段。在一些实施方案中，信号模式可以指示特定事件或过程是否在微流体系统内适当地发生。在另一些实施方案中，信号模式指示特定过程或事件是否已经在微流体系统中发生。在又一些实施方案中，信号模式可以指示事件的特定顺序。
[0114]
多种信号或信号模式(例如上文和本文中描述的那些)可以被产生和/或确定，并且可以单独或组合使用以提供反馈用于控制系统内的一个或更多个过程，例如分选的调整。即，在一些实施方案中，反馈控制或任何其他合适的单元可以至少部分地基于信号模式来确定是否使系统内的液滴分选激活或失活。例如，确定是否分选可以至少部分地基于信号模式，该信号模式包括第一信号(例如，第一发光信号)的强度以及相对于随时间的第二位置的第一信号随时间的位置，可以涉及使用这两种碎片信息以决定是否将液滴分选为收集物或废物。例如，可以将这些信号与可以预编程或预设至反馈控制中的一种或更多种参照信号(例如，阈值强度或强度范围，以及相对于随时间的第二位置的随时间的阈值位置或者随时间的位置范围)进行比较。如果每个测量信号落入各自的阈值或范围内，则可以做出关于是否对液滴进行分选的决定。仅所考虑的参数中的一者(例如，仅第一信号的强度或仅第一信号的随时间的位置)满足阈值或范围对决定是否进行对液滴进行分选可能不是足够的信息，因为它可能无法为本文所述的目的提供关于发光信号或产生信号的组分的足够信息。例如，在一些情况下，除非考虑信号模式，否则对于本文所述的目的，检测到的发光信号可能无法被充分识别。
[0115]
在一些实施方案中，处理或操纵一种或更多种测量信号(例如，在传输之前或之后，和/或在与参照信号或值比较之前)。因此，应当理解，当信号被传输(例如，至控制系统)、比较(例如，与参照信号或值)或以其他方式用于反馈过程时，可以使用原始信号或可以使用(至少部分地)基于原始信号的处理/操纵信号。例如，在一些情况下，可以计算(例如，使用微分器或任何其他合适的方法)测量信号的一种或更多种微分信号并将其用于提供反馈。在其他情况下，信号被归一化(例如，从背景信号中减去测量信号)。在一组实施方案中，信号包括斜率或平均斜率，例如强度随时间变化的平均斜率。
[0116]
反馈控制可以用于连续地将目标液滴分选至第一通道(例如，收集通道)中，同时将不期望的液滴分选至第二通道(例如，废物通道、到流体系统的上游位置的通道)中。例如，位于分选区域的上游位置的检测器可以检测一个或更多个液滴的指示液滴内细胞的存在或数量的第一发光信号。检测器还可以检测指示辅因子特性(例如辅因子浓度)的第二发光信号。任选地，检测器(或与检测器可操作地相关联的控制器)可以计算涉及每个液滴的
平均信号强度(即液滴的总信号强度除以液滴中的细胞数量)的导出信号。在一些实施方案中，确定第一发光信号和第二发光信号的比率(或信号的强度)。然后可以(例如，经由微控制器)将来自上游检测器的信号(或导出信号)传输到下游位置。在一些实施方案中，将第一发光信号、第二发光信号和/或导出信号跟(例如，预编程至微控制器中的)预编程信号或预定信号进行比较。然后，微控制器可以至少部分地基于来自上游检测器的信号来确定电压或使电极组致动以开始分选或停止分选。
[0117]
在一些实施方案中，检测器是从系统分离的分析器的一部分(或“芯片外)，并且系统可以被配置成插入至分析器或以其他方式通过分析器分析。分析器可以以多种方式使用以处理和分析放置在分析器内的系统。在一些实施方案中，在配置成与系统连接的机械组件被适当地装载到分析器中之后，分析器读取并识别关于系统的信息(例如，发光信号)。分析器可以被配置成将信息与存储的数据(例如，存储在微控制器内的数据、存储在反馈控制系统内的数据)进行比较。在一些实施方案中，分析器包括检测器。作为举例说明而非限制的方式，分析器可从发光信号接收信息并(单独地或部分与系统的其他部分，例如微控制器或反馈控制一起)确定是否应激活分选(在分选区域内)或系统是否需要更长的孵育时间。
[0118]
分选电极可以施加电压以将目标液滴(例如，包含特定特性的靶酶的液滴)朝向第一通道(例如，收集通道)吸引或推动。在一些实施方案中，通过分选电极施加大于或等于1v、大于或等于10v、大于或等于25v、大于或等于50v、大于或等于100v、大于或等于250v、大于或等于500v、大于或等于750v、或者大于或等于1kv的电压。在一些实施方案中，小于或等于1kv、小于或等于750v、小于或等于500v、小于或等于250v、小于或等于100v、小于或等于50v、小于或等于25v、小于或等于10v、或者小于或等于1v的电压。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于1v且小于或等于1kv)。其他范围也是可能的。
[0119]
可以以任何合适的速度进行液滴分选，以将目标液滴(例如，包含具有一种或更多种特性的靶酶的液滴)与不期望的液滴区分开。在一些实施方案中，液滴分选速度大于或等于10滴/秒、大于或等于20滴/秒、大于或等于50滴/秒、大于或等于100滴/秒、为250滴/秒、大于或等于250滴/秒、大于或等于500滴/秒、大于或等于750滴/秒、大于或等于1000滴/秒、大于或等于2500滴/秒、大于或等于5000滴/秒、大于或等于10000滴/秒、大于或等于50000滴/秒、或者大于或等于100000滴/秒。在一些实施方案中，液滴分选速度小于或等于100000滴/秒、为50000滴/秒、10000滴/秒、500滴/秒、1000滴/秒、小于或等于750滴/秒、小于或等于500滴/秒、小于或等于250滴/秒、小于或等于100滴/秒、小于或等于50滴/秒、小于或等于20滴/秒、或者小于或等于10滴/秒。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于10滴/秒且小于或等于100000滴/秒)。其他范围也是可能的。
[0120]
可以通过本领域已知的各种方法来分离液滴。在一些实例中，使用荧光激活液滴分选(fluorescence-activated droplet sorting，fads)、荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，facs)或磁激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，macs)来分离液滴。在另一些实例中，使用声控制技术、磁控制技术、气动控制技术、热控制技术、电控制技术及其组合来分离液滴。
[0121]
在一些实施方案中，辅因子(例如，nad 、nadh)的检测可以在大于或等于1μm、大于或等于10μm、大于或等于100μm、大于或等于1000μm、大于或等于10mm、或者大于或等于100mm的浓度下进行。在一些实施方案中，辅因子的检测可以在小于或等于100mm、小于或等
于10mm、小于或等于1000μm、小于或等于100μm、小于或等于10μm、或者小于或等于1μm的浓度下进行。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于1μm且小于或等于100mm)。其他范围也是可能的。
[0122]
作为实例，nad 、nadp 、nadh或nadph可以在包括但不限于1μm至10μm、1μm至100μm、1μm至1000μm、1μm至10mm、100μm至1000μm的浓度下检测。本领域技术人员通常将理解，在本公开内容中可以使用除nad

、nadh、nadp

、nadph、nad

和nadp

、以及nadh和nadph之外的辅因子。检测方法将根据所使用的辅因子而变化，并且可以基于辅因子或检测剂的谱特性。
[0123]
细胞可以直接在流体系统(例如，微流体装置)内孵育，或者与流体系统分开孵育。在一些实施方案中，可以培养细胞以促进细胞生长和/或增殖(例如，在液滴内)。在一个实例中，在本公开内容的本方法中产生或提供复数个液滴的步骤还包括例如在添加反应底物、检测酶、一种或更多种检测试剂、裂解缓冲液、氧化还原辅因子或其组合之前，用各液滴中的培养基孵育所述液滴中的宿主细胞以增加宿主细胞的数量。包括培养基、温度、氧浓度、培养持续时间在内的培养条件的选择将被理解为取决于宿主细胞并且适合宿主细胞的生长。在一些实施方案中，这种细胞生长和/或增殖发生在孵育区域中液滴或流体的连续流动期间。例如，包含细胞的液滴可以从一个孵育室连续地流至下一个孵育室，而无需停止系统的流动。
[0124]
在一些实施方案中，可以将包含细胞的液滴孵育大于或等于1分钟、大于或等于3分钟、大于或等于5分钟、大于或等于10分钟、大于或等于15分钟、大于或等于20分钟、大于或等于30分钟、大于或等于45分钟、大于或等于60分钟、大于或等于90分钟、或者大于或等于120分钟。在一些实施方案中，可以将包含细胞的液滴孵育小于或等于120分钟、小于或等于90分钟、小于或等于60分钟、小于或等于45分钟、小于或等于30分钟、小于或等于20分钟、小于或等于15分钟、小于或等于10分钟、小于或等于5分钟、小于或等于3分钟、或者小于或等于1分钟。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于1分钟且小于或等于120分钟)。其他范围也是可能的。在一些实施方案中，孵育区(例如，孵育区内的孵育室和/或通道)的配置和/或几何形状可以决定细胞的孵育时间。
[0125]
在一些实施方案中，细胞可以在孵育区域内孵育期间生长或增殖。在一些实施方案中，一个或更多个细胞可以在液滴内增殖(例如，再生、繁殖)。例如，可以最初将一个细胞封装在液滴中，并且该一个细胞可以生长为两个或更多个细胞。当然，每个子细胞也可以增殖为两个或更多个细胞。在一些实施方案中，一个细胞可以增殖为至少2个细胞、至少3个细胞、至少5个细胞、至少10个细胞、至少20个细胞、至少50个细胞、至少100个细胞、至少200个细胞、至少300个细胞、或至少500个细胞。在一些实施方案中，在液滴内增殖不超过500个细胞、不超过300个细胞、不超过200个细胞、不超过100个细胞、不超过50个细胞、不超过20个细胞、不超过10个细胞、不超过3个细胞、或不超过两个细胞。上述范围的组合也是可能的(例如，在液滴内增殖至少50个细胞并且在液滴内增殖不超过500个细胞)。其他范围也是可能的。在一些实施方案中，液滴内的试剂可以用于决定液滴内细胞的增殖。
[0126]
孵育区域内的复数个孵育室可以具有任何合适的尺寸。复数个室内的每个室的最大横截面尺寸可以相同或不同。在一些实施方案中，复数个室内的室的最大横截面尺寸大于或等于10μm、大于或等于20μm、大于或等于25μm、大于或等于30μm、大于或等于50μm、大于或等于100μm、大于或等于200μm、大于或等于300μm、大于或等于400μm、大于或等于500μm、
大于或等于750μm、大于或等于800μm、大于或等于900μm、或者大于或等于1000μm。在一些实施方案中，复数个室内的室的最大横截面尺寸小于或等于1000μm、小于或等于900μm、小于或等于800μm、小于或等于750μm、小于或等于500μm、小于或等于400μm、小于或等于200μm、小于或等于100μm、小于或等于50μm、小于或等于30μm、小于或等于25μm、小于或等于20μm、或者小于或等于10μm。前述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于10μm且小于或等于1000μm)。其他范围也是可能的。连接两个或更多个孵育室的通道也可以具有前述范围的尺寸或在前述范围内的尺寸。
[0127]
在一些实施方案中，连接两个相邻孵育室的通道相对于孵育室具有特定比率。可以调整这些比率以便在细胞移动通过孵育区域时控制细胞的孵育时间，并且还可以用于控制离开检测区域的液滴相对于它们在进入检测区域时的次序的相对顺序。在一些实施方案中，孵育室(例如，第一孵育室和/或第二孵育室)的最大截面尺寸与通道的最大截面尺寸的比率大于或等于2:1、3:1、5:1、10:1、13:1或15:1。在一些实施方案中，孵育室的最大截面尺寸与通道的最大截面尺寸的比率小于或等于15:1、13:1、10:1、5:1、3:1或2:1。还考虑前述范围的组合(例如，大于或等于2:1且小于或等于15:1)。其他范围也是可能的，因为本公开内容不限于此。
[0128]
孵育区域可以包括任何合适数量的孵育室。在一些实施方案中，孵育区域包括大于或等于2个孵育室、大于或等于3个孵育室、大于或等于5个孵育室、大于或等于10个孵育室、大于或等于15个孵育室、大于或等于20个孵育室、大于或等于25个孵育室、大于或等于30个孵育室、大于或等于40个孵育室、或者大于或等于50个孵育室。在一些实施方案中，孵育室包括小于或等于50个孵育室、小于或等于40个孵育室、小于或等于30个孵育室、小于或等于20个孵育室、小于或等于15个孵育室、小于或等于10个孵育室、小于或等于5个孵育室、小于或等于3个孵育室、或者小于或等于2个孵育室。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于2个孵育室且小于或等于50个孵育室)。其他范围也是可能的。孵育室可以串联或并联连接。
[0129]
在一些实施方案中，在系统或微流体装置内可以包括定位于孵育区域下游的气泡捕集器。气泡捕集器可以用于去除例如在复数个孵育通道中的细胞的孵育期间形成的气泡。因此气泡捕集器可以定位和/或附接于孵育区下游的室或通道，但当然，可以定位于流体系统的任何位置内以促进气泡从通道和/或室中去除。在一些实施方案中，气泡捕集器包括可以允许气体(例如，空气)扩散同时防止液体流过气泡捕集器的膜(例如，聚二甲基硅氧烷(pdms)膜)。任选地，气泡捕集器还可以包括真空端口(例如，入口和/或出口)，以通过向气泡捕集器施加减压来促进气体的去除。
[0130]
在一些实施方案中，复数个液滴中的至少一个或更多个还包含裂解缓冲液。裂解缓冲液使宿主细胞裂解以释放细胞内酶，从而将反应底物转化为目标产物。裂解缓冲液的实例包括但不限于蛋白酶-k、十二烷基硫酸钠(sds)、triton x-100、苯扎氯铵、氯己定二葡糖酸盐、溶菌酶-多黏菌素b和苯酚。
[0131]
然后可以对分离的液滴进行进一步测定或分析。例如，可以将分离的液滴中的dna或细胞进一步回收以用于进一步分析。在一个实例中，培养回收的细胞以允许宿主细胞生长，并且可以大规模(例如以微升到升的规模)测试酶的特性。在另一个实例中，对分离的液滴中的dna或酶进行测序以获得氨基酸序列、多核苷酸序列或两者。
[0132]
在一个实例中，使用经测序的酶来产生新的酶变体文库。本领域技术人员将理解产生酶文库的方法。例如，酶文库可以通过随机诱变或靶向诱变产生。与参照蛋白质或酶相比，酶文库中的每个变体都包含一个或更多个氨基酸的突变。突变也可以是用于密码子优化的沉默突变。也可以进行突变以改善随后被去除的信号肽的表达。
[0133]
如本文所用，术语“酶”是指能够对化学或生化反应进行催化的蛋白质或基于蛋白质的分子。酶完全或部分由一种或更多种多肽构成，但也可以包含核酸。酶的催化功能构成其“活性”或“酶活性”。酶的特异性主要取决于活性位点(在底物转化为产物之前酶与底物结合的区域)的特性。酶可以根据其执行的催化功能的类型进行分类。例如，酶包括但不限于氧化还原酶、转移酶、异构酶、水解酶、裂解酶和连接酶。酶还可以包括加氧酶、脱氢酶和脂肪酶。酶还可以根据其在宿主中的表达系统的类型进行分类。例如，酶可以包括细胞内酶、表面展示酶和细胞外酶。酶可以是辅因子依赖性或辅因子非依赖性的。辅因子依赖性酶需要辅因子的存在以便使酶对反应进行催化，而辅因子非依赖性酶不需要辅因子的存在。
[0134]
如本文所用，术语“底物”是指能够与酶的活性位点结合或相互作用的物质。酶对底物发挥其催化活性以产生产物。
[0135]
如本文所用，术语“辅因子”是指酶执行其酶活性所需的除底物之外的任何分子。辅因子包括但不限于无机离子、辅酶或酶活性所必需的其他因子。氧化还原辅因子是氧化还原酶对酶促反应进行催化所需的辅因子。氧化还原辅因子的实例包括nadp (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、nadph(即nadp 的还原形式)、nad (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和nadh(即nad 的还原形式)。其他氧化还原辅因子包括但不限于黄素腺嘌呤二核苷酸(fad和fadh2)、黄素单核苷酸(fmn和fmnh2)、维生素b12和辅酶q以及合成的仿生辅因子。在提及氧化还原辅因子nad 和nadp 的情况下，通常应理解“nad(p) ”是指“nad ”和/或“nadp ”。类似地，在提及氧化还原辅因子nadh和nadph的情况下，“nad(p)h”应理解为是指“nadh”和/或“nadph”。
[0136]
如本文所用，术语“筛选”在酶或酶变体的上下文中是指针对一种或更多种特性对酶进行分析或测试。筛选涉及针对特定特性对一组中的各个样品(例如不同的酶或酶变体)进行测试。
[0137]
如本文所用，术语“突变”在多核苷酸的上下文中是指对多核苷酸序列的修饰引起多核苷酸序列与参照多核苷酸序列相比发生变化。多核苷酸序列的突变可能会或可能不会引起编码的氨基酸序列发生变化。例如，不改变氨基酸序列的突变可以用于密码子优化以达到表达目的。可以通过包括但不限于以下的方法将突变引入到多核苷酸中：随机诱变、位点特异性诱变、寡核苷酸定向诱变、基因改组、定向进化技术、组合诱变和位点饱和诱变。术语“突变”在蛋白质的上下文中是指对氨基酸序列的修饰引起蛋白质的氨基酸序列与参照氨基酸序列相比发生变化。突变可以涉及一个或更多个氨基酸残基并且可以选自替代、插入、缺失、截短及其组合。氨基酸残基可以是天然的或非天然的。如本文所用，“变体”或“突变体”是与参照蛋白质相比包含一个或更多个氨基酸的突变的蛋白质或酶。与参照蛋白质相比，“变体”还可以包含另外的氨基酸延伸。延伸可以包括信号肽、蛋白质标签和荧光标签。蛋白质标签的实例包括his标签、flag标签和myc标签。
[0138]
在本技术的上下文中，术语“微流体”是指对处理可以是微升、纳升或皮升数量级的小体积流体的装置和方法进行设计、制造和配制的科学。微流体装置或系统包括微米级
的通道，并且能够实现高水平自动化、减少的处理时间以及较低的样品和试剂消耗。
[0139]
如本文所用，术语“荧光”是指其中原子或分子在从较高电子态到较低电子态的量子跃迁期间发射可测量的辐射的发光类型。荧光团是可以在光激发时重新发光的荧光化学化合物。具体地，荧光团吸收特定波长的光能，从而引起荧光团的电子的激发，并且荧光团随后在电子返回其基态时在更长的波长下重新发射吸收的光能。
[0140]
如本文所用，术语“化学发光”是指由于化学反应而产生和发射光。化学发光的一个实例为生物发光。
[0141]
如本文所用，术语“生物发光”是指通过由酶、蛋白质、蛋白质复合物或其他生物分子催化的化学反应产生和发射光。在生物发光中，发光化合物是存在于活生物体中的化合物。生物发光化合物的实例包括细菌萤光素酶和萤火虫萤光素酶。
[0142]
如本文所用，术语“荧光共振能量转移”(fret)是指当两个光敏分子例如发色团和荧光团紧密靠近时能量在这些分子之间转移的过程。最初处于其电子激发态的供体荧光团可以通过非辐射偶极-偶极耦合将能量转移至受体荧光团。然后受体荧光团在不同波长下发光。该荧光发射波长可以根据两个荧光团的距离和状态而不同。
[0143]
在本技术的上下文中，术语“量子点”是指半导体纳米晶体。量子点可以基于其组成和结构进行分类，并且包括但不限于核型量子点、核-壳量子点和合金化量子点。量子点也可以是水溶性或水不溶性的，并且可以包括ii-vi族半导体材料、iii-v族半导体材料、iv族半导体材料或其组合中的至少一者的核。量子点(qd)的实例包括cdse、zns、znse、znte、cds、cdte、gan、gap、gaas、gasb、inp、inas、insb、als、alp、alas、alsb、pbs、pbse、ge和si及其三元和四元混合物的纳米晶体。量子点具有与其物理尺寸直接相关的离散量化能量发射光谱。量子点可以充当fret供体或受体。
[0144]
如本文所用，术语“生物传感器”是指使用生物分子例如核酸、蛋白质、碳水化合物或脂质来检测目标生物或化学物质、条件或反应并作为信号传输关于生物或化学物质、条件或反应的信息的装置。生物分子可以通过直接化学键合或通过间接结合固定在生物传感器的表面上。结合通常通过施加于生物传感器表面的聚合物膜。在一些实施方案中，可以通过将生物分子直接并入到要施加到表面的聚合物膜中来将生物分子固定至生物传感器的表面。
[0145]
本文说明性描述的本公开内容可以在不存在本文未具体公开的任意一个或更多个要素、一个或更多个限制下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地理解而不受限制。此外，本文采用的术语和表述被用作描述性术语而不是限制性术语，并且在使用这样的术语和表述时不旨在排除所示出和所描述的特征或其部分的任意等同方案，而应认识到在要求保护的本公开内容的范围内可以进行各种修改。因此，应理解，尽管已通过一些优选的实施方案和任选的特征具体公开了本公开内容，但是本领域技术人员可以对本文所公开的其中体现的公开内容进行修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本公开内容的范围内。
[0146]
已在本文中对本公开内容进行了广泛且一般性描述。落入一般性公开内容内的每个较窄的物质和亚类分组也形成本公开内容的一部分。这包括对其中附带条件或否定限制(从该属中去除任何主题)的本公开内容的一般性描述，而不论所去除的内容是否在本文中进行了具体详述。
[0147]
在一些实施方案中，描述了针对一种或更多种特性筛选酶的方法。在一些实施方案中，所述方法包括产生复数个液滴的步骤，其中至少一个液滴包含酶、反应底物；以及一种或更多种氧化还原辅因子、或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中酶将反应底物转化为目标产物。所述方法还可以包括检测从液滴发射的信号，其中信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号，其中所述信号是当在反应底物被酶转化为目标产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的，或者其中所述信号是当在目标产物被液滴中的一种或更多种检测试剂进一步转化为后续产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。
[0148]
在一些实施方案中，针对一种或更多种特性筛选酶的方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包括孵育区域，所述孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室，其中复数个孵育室被配置成允许复数个液滴连续流动，所述步骤为：在液滴中培养细胞以形成复数个细胞，同时使细胞从第一孵育室流动至第二孵育室；使液滴在孵育区域中连续流动，其中液滴包含酶、反应底物，以及一种或更多种氧化还原辅因子或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中酶将反应底物转化为目标产物；以及从液滴产生信号，其中信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号。
[0149]
在一些实施方案中，描述了流体系统，该流体系统包括：复数个液滴，所述复数个液滴包括第一液滴，所述第一液滴包含氧化还原辅因子，其中液滴中的氧化还原辅因子的浓度大于或等于5μm；包含液滴的微流体通道；和与微流体通道流体连通的液滴分选区域，其中液滴分选区域包括与微流体通道相邻的电极组。
[0150]
在一些实施方案中，流体系统包括包含复数个液滴的微流体通道，其中至少一个液滴包含氧化还原辅因子和检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂被配置成与氧化还原辅因子的氧化还原对反应以产生发光信号。
[0151]
在一些实施方案中，流体系统包括第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶。在一些实施方案中，流体系统包括：第二试剂室，其中第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与第一流体不混溶的第二液体，并且与至少第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将第一液体和第二液体合并。在一些实施方案中，流体系统包括与合并区域流体连通的孵育区域，其中孵育区域包括：复数个孵育室，所述复数个孵育室包括流体中的第一孵育室和第二孵育室，其中第一孵育室和第二孵育室被配置成允许液滴在室之间连续流动。在一些实施方案中，流体系统包括与孵育区域流体连通的液滴分选区域。在一些实施方案中，液滴分选区域包括检测区、检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于液滴中组分的检测对复数个液滴进行分选。在一些实施方案中，流体系统包括收集通道和废物通道。在一些实施方案中，流体系统包括定位在孵育区域与液滴分选区域之间的气泡捕集器。在一些实施方案中，流体系统还包括在液滴分选区域内的第二载液室。
[0152]
在一些实施方案中，流体系统包括：第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶；第二试剂室，其中第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与第一流体不混溶的第二液体，并且与至少第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将第一液体和第二液体合并；
与合并区域流体连通的孵育区域，其中孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室；检测区，所述检测区包括第一检测器，其中第一检测器被配置成确定第一波长的第一发光信号和第二波长的第二发光信号，其中第一波长和第二波长不同；与孵育区域流体连通的液滴分选区域；检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于液滴中的一种或更多种组分的检测对复数个液滴进行分选；收集通道；和/或和废物通道。
[0153]
在一些实施方案中，所述方法还包括基于与参照信号相比检测到的射信号的水平针对一种或更多种特征筛选酶，其中与参照信号相比发射信号水平的变化表明酶具有一种或更多种特性。
[0154]
在一些实施方案中，所述方法还包括基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平来分离液滴。
[0155]
在一些实施方案中，所述方法还包括基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平对液滴进行分选。
[0156]
在一些实施方案中，所述方法还包括在复数个液滴内培养细胞。
[0157]
在一些实施方案中，所述方法包括培养，所述培养包括在复数个液滴内使细胞增殖。
[0158]
在一些实施方案中，所述方法还包括使一个或更多个细胞裂解。
[0159]
在所述方法的一些实施方案中，检测步骤包括检测细胞内酶或细胞表面展示酶。
[0160]
在一些实施方案中，检测步骤包括检测细胞外酶。
[0161]
在一些实施方案中，在所述方法中，在不存在nadh的情况下检测到与参照信号相比更低的信号。
[0162]
在一些实施方案中，在nadh的存在下发射具有590nm的激发波长和620nm的发射波长的荧光信号。
[0163]
在一些实施方案中，在所述方法中，酶为氧化还原辅因子依赖性酶并且所述信号是当在反应底物被酶转化为目标产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。
[0164]
在一些实施方案中，在所述方法中，酶为氧化还原辅因子非依赖性酶并且所述信号是当在目标产物被一种或更多种检测试剂进一步转化为后续产物时氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。
[0165]
在一些实施方案中，在所述方法中，在步骤a)中产生复数个液滴还包括在添加反应底物、检测试剂、一种或更多种检测试剂、裂解缓冲液、氧化还原辅因子或其组合之前用液滴中的培养基孵育每个液滴中的宿主细胞以增加宿主细胞的数量。
[0166]
在一些实施方案中，在所述方法中，通过使用选自以下的方法来分离液滴：荧光激活液滴分选(fads)、荧光激活细胞分选(facs)和磁激活细胞分选(macs)、声控制技术、磁控制技术、气动控制技术、热控制技术、电控制技术及其组合。
[0167]
在一些系统和方法中，酶的一种或更多种特性选自酶活性、稳定性、特异性、立体选择性、转化非天然底物的能力及其组合。
[0168]
在一些实施方案中，所述方法还包括对经分离的液滴中的酶的氨基酸序列、多核苷酸序列或两者进行测序的步骤，任选地其中经测序的酶用于产生酶变体文库。
[0169]
在所述方法的一些实施方案中，酶在宿主细胞中表达，以及其中复数个液滴还包含宿主细胞或其片段。
[0170]
在一些实施方案中，所述方法还包括检测分选区域上游的发光信号，任选地将第一发光信号与从液滴发射的信号进行比较。
[0171]
在一些实施方案中，所述方法还包括检测第一发光信号和第二发光信号，任选地包括将第一发光信号和第二发光信号或者第一发光信号和第二发光信号的导出信号跟从液滴发射的信号进行比较。
[0172]
在所述方法的一些实施方案中，分选区域上游产生的信号被传输至分选区域。
[0173]
在一些实施方案中，所述方法还包括向分选电极组施加电压。
[0174]
在一些实施方案中，所述方法还包括筛选酶以提高其天然底物的转化、提高其非天然底物的转化、提高催化活性、提高立体选择性、提高热稳定性、提高在预定ph范围内的稳定性、或其组合。
[0175]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中一种或更多种氧化还原辅因子选自nad

、nadh、nadp

、nadph、nad

和nadp

、以及nadh和nadph。
[0176]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中复数个液滴中的每个液滴还包含与氧化或还原的氧化还原辅因子反应以产生发射信号的一种或更多种检测试剂。
[0177]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中氧化还原辅因子为nadh或nadph或两者，以及其中一种或更多种检测试剂选自：刃天青和心肌黄酶；萤光素、萤光素酶、还原酶、atp和mg
2
；以及量子点。
[0178]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中氧化还原辅因子为nad

或nadp

或两者，以及其中一种或更多种检测试剂选自：量子点；和蛋白质生物传感器。
[0179]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中量子点为cdse/cds/cdzns/zns量子点。
[0180]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中量子点为涂覆有羧酸和牛血清白蛋白以及尼罗蓝染料的cdse/cds/cdzns/zns量子点。
[0181]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中量子点为水溶性的。
[0182]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中量子点为涂覆有3-巯基丙酸并且连接至nad 结合结构域的cdse/cds/cdzns/zns量子点。
[0183]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中nad

结合结构域为硫醇化dbc1蛋白质传感器。
[0184]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中与参照信号相比，在nad

的存在下发射具有538nm激发波长和595nm的发射波长的更低的荧光信号。
[0185]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中酶为氧化还原辅因子依赖性酶或氧化还原辅因子非依赖性酶。
[0186]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原生动物细胞、藻类细胞和古菌细胞。
[0187]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中复数个液滴中的至少一者或更多者还包含裂解缓冲液。
[0188]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法。
[0189]
根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中复数个液滴选自油包水液滴、水包油包水液滴、水包油液滴和水凝胶液滴。
[0190]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中复数个液滴的直径为约10μm至100μm。
[0191]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中复数个液滴的直径为约30μm。
[0192]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中酶选自细胞内酶、表面展示酶或细胞外酶。
[0193]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中酶选自来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)、来自鞘氨醇单胞菌属hxn-200的环氧化物水解酶(speh)、苯乙烯氧化物异构酶(soi)、p450单加氧酶(p450pyr)、来自红球菌属(rodococcus)的胺脱氢酶(amdh)、和丁二醇脱氢酶(bdha)。
[0194]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中酶为选自单一酶的酶变体文库的酶变体，或者其中酶选自不同酶的组。
[0195]
在一些实施方案中，描述了所述系统或方法，其中辅因子为外源性辅因子。
[0196]
在一些实施方案中，所述系统或方法被描述为还包含一个或更多个液滴，所述一个或更多个液滴各自包含含有内源性辅因子浓度的至少一个细胞，以及其中外源性辅因子浓度大于内源性辅因子浓度。
[0197]
在一些实施方案中，所述系统或方法被描述为还包括定位在分选区域上游的检测器。
[0198]
在一些实施方案中，所述系统或方法被描述为还包括气泡捕集器，气泡捕集器任选地包括真空端口。
[0199]
另外的实施方案在所附权利要求书和非限制性实施例内。此外，在本公开内容的特征或方面是按照马库什(markush)组来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此按照马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。
[0200]
以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但不是例示本发明的全部范围。
[0201]
实施例1
[0202]
以下实施例描述了用于酶筛选和分选的一些通用材料和方法。
[0203]
材料和方法
[0204]
突变体文库构建
[0205]
通过在3至4个选定的氨基酸位点处进行位点饱和诱变来构建突变体文库。用包含简并ndt或nnk密码子(或组合)的相应引物在期望的位点处进行pcr。将pcr产物用相应的限制酶消化，克隆到表达载体并在大肠杆菌(bl21，de3)感受态细胞中转化。提取各文库的质粒并测序，以确定在相应的靶位点处成功引入简并密码子。
[0206]
细胞培养
[0207]
将表达期望酶的大肠杆菌在5mllb培养基中于22℃和250rpm下培养12小时。在2小时时添加iptg(终浓度0.5mm)以诱导酶表达。通过以4,000g离心2分钟收获细胞，用磷酸盐缓冲液(50mm，ph 7.4)洗涤两次，并重新悬浮在磷酸盐缓冲液(50mm，ph 7.4)中至2
×
107个细胞/ml的最终密度(od
600
＝0.015)。
[0208]
细胞封装
[0209]
使用3通道流量聚焦微流体芯片以至少1000滴/秒的速度产生30μm直径的液滴。在
该操作期间，将两种含水样品以1:1的比率和1μl/分钟的流量混合，并以3μl/分钟的流量供应氟化油hfe-7500(包含表面活性剂)。
[0210]
用于液滴分选的参数
[0211]
将液滴收集并以100滴/秒至1000滴/秒的速度引入到分选芯片中。液滴以单行流动，并且通过以5μl/分钟供应间隔油扩大各液滴之间的间距。记录各液滴在通过带有光电倍增管(pmt)检测器的显微镜中的200μm视场时的荧光信号。通过daq数据采集单元(national instrument，美国)处理pmt的电压输出并将其记录在matlab软件中。并行地，通过arduino due微控制器以500khz的采样率对同一pmt输出进行数字化。一旦与预设分选阈值相比信号处于期望的范围内，就将分选脉冲发送至下游电子设备，放大并发送至分选电极以触发液滴分选。通过高精度注射器泵(pump 11pico plus elite，harvard apparatus)经由玻璃注射器(hamilton)或塑料注射器(terumo)和ptfe管递送液体流。
[0212]
用于液滴合并的方案
[0213]
在将包含溶液的管连接到芯片上的相应入口中之后，如下设定流量：间隔油为2μl/分钟，液滴为0.7μl/分钟，以及合并溶液为0.2μl/分钟。
[0214]
然后以20khz频率和1v振幅使用函数发生器并将其连接至放大器以产生100v脉冲。将来自放大器的接地和高压引出线连接至芯片上的相应电极。在通道中达到稳定流之后，开启放大器并执行合并。
[0215]
实施例2
[0216]
以下实施例描述了经尼罗蓝功能化的nadh和nad

感测量子点的合成。
[0217]
nadh感测qd合成
[0218]
(1)cdse核纳米晶体的合成。通过由先前报道的步骤修改的步骤制备高度荧光cdse纳米晶体。对于典型的反应，将在25ml三颈烧瓶中的0.2mmol cdo、0.8mmol硬脂酸和2g ode的混合物加热至约200℃以获得无色透明溶液。在将该溶液冷却至室温之后，向烧瓶中添加oda(1.5g)和topo(0.5g)。在氮气流下，将该系统重新加热至280℃。在此温度下，快速注入通过将2mmol se溶解在1.37g ode中而制成的硒溶液。然后将生长温度降低至260℃。通过在甲醇中沉淀对纳米晶体进行纯化。在确定的反应时间时，产生尺寸为约3.2nm的cdse纳米晶体，其第一吸收峰为约580nm。
[0219]
2)cdse/cds/cdzns/zns的合成。在25ml三颈烧瓶中，将溶解在氯仿中的cdse纳米晶体(直径3.2nm，1.07
×
107mol颗粒)与1.5g oda和3.5g ode混合。将烧瓶加热至180℃持续1小时以从系统中除去氯仿和残留的空气。随后，将系统切换至氮气流，并将反应混合物进一步加热至240℃以进行连续注入。第一次注入为0.38ml cd注入溶液(0.01m)，随后的注入溶液的量使用报道的方法计算。通过使反应混合物冷却来终止反应。将最终产物通过氯仿稀释并通过向氯仿溶液中添加丙酮沉淀。在确定的反应时间时，该反应产生cdse/cds/cdzns/zns量子点，其第一吸收峰为约590nm，以及发射峰为约616nm至620nm。
[0220]
(3)量子点的水溶解。以1.5的光学密度向氯仿中的量子点添加3-巯基丙酸(mpa)(400μl，4.59mmol)，并振荡溶液。氯仿溶液变浑浊。然后将量子点溶解在水中。
[0221]
(4)经bsa涂覆的量子点的制备。将经mpa包覆的量子点与在含有10mm 1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亚胺盐酸盐(edc)的10mm hepes缓冲液(ph 7.4)中的1000倍过量的牛血清白蛋白(bsa)混合，并将混合物在4℃下振荡24小时。通过超滤获得经bsa涂覆的量
子点。
[0222]
(5)经尼罗蓝包覆的量子点的制备。向量子点颗粒溶液中添加bs3(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)储备溶液(50ml，在10mm hepes缓冲液中的1mg/ml，ph 8)，并将混合物振荡15分钟。将所得量子点与50倍过量的尼罗蓝储备溶液(在3:2乙醇/水中的1mg/ml)混合，并将混合物振荡16小时。通过针对ph 8的10mm hepes缓冲液(mw截止值10k)进行透析除去过量的尼罗蓝。
[0223]
nad

感测量子点合成
[0224]
以下描述了基于量子点的nad

生物传感器的详细合成步骤。
[0225]
1)硒化镉(cdse)核纳米晶体的合成。通过由先前报道的步骤修改的步骤制备高度荧光cdse纳米晶体。对于典型的反应，将在25ml三颈烧瓶中的0.2mmol氧化镉(cdo)、0.8mmol硬脂酸和2g十八碳烯(ode)的混合物加热至约200℃以获得无色透明溶液。在将该溶液冷却至室温之后，向烧瓶中添加十八烷基胺oda(1.5g)和三辛基氧化膦(topo)(0.5g)。在氮气流下，将该系统重新加热至280℃。在此温度下，快速注入通过将2mmol se溶解在1.37g ode中而制成的硒溶液。然后将生长温度降低至260℃。通过在甲醇中沉淀对纳米晶体进行纯化。在确定的反应时间时，其产生尺寸为约2.3nm的cdse纳米晶体，其第一吸收峰为约528nm。
[0226]
(2)cdse的合成-合成了核cds(2ls)/cd
0.5
zn
0.5
s(3l)/zns(2ls)多壳量子点(qd)。在25ml三颈烧瓶中，将溶解在氯仿中的cdse纳米晶体(直径2.3nm，1.02
×
107mol颗粒)与1.5g oda和3.5g ode混合。将烧瓶加热至180℃持续1小时以从系统中除去氯仿和残留的空气。随后，将系统切换至氮气流，并将反应混合物进一步加热至240℃以进行连续注入。第一次注入为0.38mlcd注入溶液(0.01m)，随后的注入溶液的量使用报道的方法计算。通过使反应混合物冷却来终止反应。将最终产物通过氯仿稀释并通过向氯仿溶液中添加丙酮沉淀。在确定的反应时间时，该反应产生cdse/cds/cdzns/zns量子点，其第一吸收峰为约538nm，以及发射峰为约595nm。
[0227]
(3)经mpa包覆的qd的制备。通过向1ml在氯仿中的qd中添加4ml甲醇使以上qd从氯仿溶液中沉淀，然后以8000rpm离心10分钟。将所得沉淀物重新溶解在1ml氯仿中，向其中添加200μl3-巯基丙酸(mpa)。在添加4ml1mm naoh溶液之后，将颗粒转移至水相。通过离心1分钟收集水相。通过使用饱和nacl和甲醇进行两个连续的qd沉淀步骤然后离心除去过量的mpa。将所得的经mpa包覆的qd重新溶解在1ml10mm hepes缓冲液(ph 7.4)中。
[0228]
(4)硫醇化dbc1蛋白质(乳腺癌1缺失)的制备。通过用2-亚氨基硫烷处理蛋白质以引入巯基残基至巯基:蛋白质比为约20来制备dbc1蛋白质。使溶解在1mlpbs(ph 7.4)中的5mg dbc1与2mg 2-亚氨基四氢噻吩
·
hcl反应，并在4℃下在涡旋下保持2小时。通过尺寸排阻离心过滤装置(micron ym-30，millipore)对所得溶液进行过滤。
[0229]
(5)经dbc1蛋白质涂覆的qd的制备。在hepes缓冲液(ph 7.4)中，将经mpa包覆的qd与硫醇化dbc1蛋白质一起在4℃下孵育5天。
[0230]
实施例3
[0231]
以下实施例描述了用于对含有靶酶的细胞进行高通量筛选和分选的流体系统。
[0232]
用于对细胞内酶或表面展示酶进行高通量筛选的微流体系统
[0233]
该系统并入了用于对酶进行筛选的各种组分，并且可以用于与细胞内酶或表面展
示酶的辅因子依赖性反应和辅因子非依赖性反应二者，如图5所示。制备靶酶的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(细胞)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。文库的细胞以单个细胞封装在油包水微滴(10μm至100μm)内，所述油包水微滴包含反应底物、nad

或nadh，并且如有需要，包含检测酶和/或裂解缓冲液。该系统可以应用于所有形式的在全细胞或裂解的细胞情况下的细胞内酶以及在全细胞情况下的表面展示酶。
[0234]
在图4a至图4c中，对辅因子非依赖性酶促反应的检测通过以下实现：用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子，以对这样的辅因子及其靶反应进行高度灵敏且精确的检测。在图4a至图4e中，对靶反应的高度灵敏且精确的检测通过经由辅因子依赖性酶对由靶酶促反应产生的还原或氧化的辅因子进行生物发光或荧光检测来实现。
[0235]
图4a的系统示出了对全细胞中辅因子依赖性或辅因子非依赖性细胞内酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装之后，将易于包含反应底物、检测酶(酶2)和氧化或还原的辅因子的液滴孵育。扩散到细胞中的底物被细胞内酶变体转化为产物。扩散出细胞的所得产物被检测酶(酶2)进一步转化以产生可以定量检测的还原或氧化的辅因子。对具有期望信号水平的液滴的分选指示具有期望催化性能的变体。
[0236]
图4b中的系统示出了对表面展示的且辅因子非依赖性的酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装之后，将易于包含反应底物、检测酶(酶2)和氧化或还原的辅因子的液滴孵育。通过表面展示酶在细胞外进行生物转化，其后通过用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生还原或氧化的辅因子来进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0237]
图4c中的系统示出了用裂解的细胞对nad(p)

非依赖性或nad(p)h非依赖性的细胞内酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装之后，将易于包含反应底物、裂解缓冲液、检测酶(酶2)和氧化或还原的辅因子的液滴孵育。通过从裂解的细胞释放到液滴中的细胞内酶进行目标生物转化。其后通过用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生还原或氧化的辅因子来进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0238]
图4d中的系统示出了对表面展示的且辅因子依赖性的酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装之后，将易于包含反应底物和氧化或还原的辅因子的液滴孵育。通过表面展示酶在细胞外进行生物转化。其后对还原或氧化的辅因子进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0239]
图4e中的系统示出了用裂解的细胞对辅因子依赖性细胞内酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装之后，对易于包含反应底物、裂解缓冲液和合适的辅因子的液滴进行孵育。细胞内酶从裂解的细胞释放到液滴中。通过酶进行目标生物转化，其后对氧化或还原的辅因子进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0240]
用于对细胞外酶以及具有低活性或低表达水平的细胞内酶和表面展示酶进行高通量筛选的微流体系统
[0241]
该系统并入了各种组分以及液滴中细胞生长和液滴合并以对辅因子依赖性或辅因子非依赖性的细胞外酶以及具有低活性或低表达水平的细胞内酶和表面展示酶进行筛选，如图5所示。在该系统中，将单个大肠杆菌细胞首先用液滴内的培养基封装。在20℃至40℃和最佳振荡条件下孵育的情况下，使液滴内的单个细胞繁殖。然后通过液滴合并将反应
底物、合适的辅因子以及检测酶和/或裂解缓冲液(如有需要)引入液滴中。该系统可以应用于所有的在全细胞或裂解的细胞情况下的具有低活性或低表达水平的细胞内酶，以及细胞外酶。
[0242]
在图5a至图5c中，对辅因子非依赖性酶促反应的检测通过以下实现：用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子，以进行高度灵敏且精确的检测。在图5d至图5e中，对靶反应的高度灵敏且精确的检测通过经由辅因子依赖性酶对由靶酶促反应产生的nad(p)h或nad(p)

进行生物发光或荧光检测来实现。
[0243]
图5a的系统示出了对全细胞中具有低活性或低表达水平的辅因子依赖性或辅因子非依赖性的细胞内酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装在培养基中之后，使细胞在液滴中生长，其后通过液滴合并向液滴中添加反应底物、检测酶(酶2)和合适的辅因子。扩散到细胞中的底物被细胞内酶变体转化为产物。扩散出细胞的所得产物被检测酶(酶2)进一步转化以产生氧化或还原的辅因子，以进行高度灵敏且精确的检测。对具有高信号的液滴的分选指示具有期望催化性能的变体。
[0244]
图5b中的系统示出了对细胞外辅因子非依赖性酶的筛选。在将表达单一酶变体的单个细胞封装在培养基中之后，使细胞在液滴中生长，其后通过液滴合并向液滴中添加反应底物、检测酶(酶2)和合适的辅因子。然后将液滴孵育，并通过细胞外酶在细胞外进行生物转化。其后通过用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子来进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0245]
图5c中的系统示出了使用裂解的细胞对具有低活性或低表达水平的细胞内辅因子非依赖性酶的筛选。在将具有单一酶变体的单个细胞封装在培养基中之后，使细胞在液滴中生长，其后通过液滴合并向液滴中添加反应底物、检测酶(酶2)、裂解缓冲液和合适的辅因子。然后将液滴孵育。通过从裂解的细胞释放到液滴中的细胞内酶进行目标生物转化。其后通过用另一酶促反应转化目标生物转化产物以产生氧化或还原的辅因子来进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0246]
图5d中的系统示出了对细胞外辅因子依赖性酶的筛选。在将具有单一酶变体的单个细胞封装在培养基中之后，使细胞在液滴中生长，其后通过液滴合并向液滴中添加反应底物和合适的辅因子。然后将这些液滴孵育。通过细胞外酶在细胞外进行生物转化。其后对氧化或还原的辅因子进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0247]
图5e中的系统示出了使用裂解的细胞对具有低活性或低表达水平的辅因子依赖性酶的筛选。在将具有单一酶变体的单个细胞封装在培养基中之后，使细胞在液滴中生长，其后通过液滴合并向液滴中添加反应底物、裂解缓冲液和合适的辅因子。然后将这些液滴孵育。通过从裂解的细胞释放到液滴中的细胞内酶进行目标生物转化。其后对氧化或还原的辅因子进行高度灵敏且精确的检测，并对这些液滴进行分选。
[0248]
用于对微流体中的nad(p)

和nad(p)h进行高度灵敏且精确的检测的通用测定
[0249]
为了检测由微滴中酶促反应产生的nad(p)

或nad(p)h，开发了各种具有高灵敏度和不同应用的对微流体的高通量测定。测定汇总在表1中。
[0250]
表1.用于检测微流体中的nad(p)

或nad(p)h的高通量测定。
[0251]
测定类型nad(p)

的检测nad(p)h的检测直接荧光检测 √
通过形成试卤灵的荧光检测 √生物发光检测 √通过fret效应用量子点的检测√√用蛋白质生物传感器的检测√ [0252]
nad(p)h的直接荧光检测
[0253]
nadh是具有0.1量子效率的荧光分子。当在340nm下激发时，nadh还可以在450nm处检测到其自身的固有荧光。相比之下，nad

具有不同的光谱特征，并且在相同条件下不可检测到。在微量滴定板中直接检测nadh荧光(具有340nm激发和450nm发射)的结果在图6a中示出。荧光信号的强度显示出与40μm至300μm范围内的nadh浓度非常好的线性关系。
[0254]
该检测在具有30μm直径和各种nadh浓度(50μm、100μm、200μm、400μm和800μm)的微流体液滴中得到进一步验证。可以用cmos相机捕获来自液滴中的nadh的荧光信号，并用imagej软件通过图像分析计算平均荧光强度(图6b)。荧光强度与nadh浓度线性相关，其中信噪比(s/n)为8.1
±
1.1。相比之下，用pmt进行的检测得到为0.5
±
0.2的低得多的s/n，因此直接荧光检测被用于开发需要使用cmos相机的基于图像的分选系统(图7)。
[0255]
通过形成试卤灵的nad(p)h的荧光检测
[0256]
为了开发更灵敏的测定，并入了导致红色荧光分子的形成的级联反应。如图6e所示，nad(p)h在心肌黄酶的存在下与弱荧光团刃天青快速反应，得到强红色荧光产物试卤灵，其可以在540nm激发下在590nm处检测到。这种耦合的酶促反应将高度荧光试卤灵的形成与目标酶催化活性相关联。在微量滴定板测试中，试卤灵的荧光信号显示出与10μm至500μm范围内的nad(p)h浓度非常好的线性关系，并且检测限为10μm(图6c)。基于刃天青的nad(p)h检测在微流体中得到进一步验证(图6d)。用光电倍增管(pmt)检测器确定来自具有不同nad(p)h浓度的液滴的刃天青的荧光信号。结果显示，荧光强度与100μm至400μm的nad(p)h浓度之间的线性关系。在存在100μm nad(p)h的情况下，信号与背景噪声比为2.5
±
0.7。该方法对nad(p)h具有高度特异性，并且nad(p)

的存在不影响荧光信号。
[0257]
nadh的生物发光检测
[0258]
使用基于生物发光的生物传感器检测nadh提供了更灵敏的检测。在该实施例中，nadh的检测使用市售的生物发光nadh检测试剂盒(nadh-glo，promega)进行，该试剂盒包含萤光素酶(重组甲虫萤光素酶)、atp和用于萤光素酶活性的mg
2
、以及可以在nadh的存在下通过还原酶还原为d-萤光素的前萤光素，并因此产生发光信号(图8a)。
[0259]
对该方法在微量滴定板中进行了检查，并且与基于荧光的方法相比，显示出低得多的检测限(0.1μm)。检测的线性范围为0.1μm至25μm(图8b)。为了用生物发光测定检测微流体液滴中的nadh，在nadh的存在下使用pmt检测器捕获生物发光光发射。结果显示检测限低至5μmnadh，在5μm至50μm范围内具有几乎线性的响应(图8c)。该方法对nad

的存在没有响应。
[0260]
还检查了在微流体系统中使用生物发光测定检测由1-苯基-1,2-乙二醇(ped)的经bdha催化的反应产生的nadh。在kp缓冲液(ph 7.5，50mm)中的经bdha催化的ped的反应在微滴中进行。液滴中试剂的终浓度为100μm ped、0.8mg/mlbdha和0.5mm nad

。从两个分开的入口以1:1v/v注入包含酶和底物的溶液以及包含nad

的生物发光测定试剂的溶液，并且在形成液滴之后混合。在室温下孵育2小时之后通过pmt检测器分析液滴(图9)。
[0261]
由使用我们的校准曲线对几个液滴的峰的分析获得的nadh浓度的量化得出21
±
4μm的浓度。该结果与96孔板实验中2小时时的结果(23.5μm)一致。
[0262]
通过fret效应用量子点对nadh的检测
[0263]
不希望受任何特定理论的束缚，认为荧光共振能量转移(fret)是能量在两个光敏分子例如发色团与荧光团之间转移的过程。最初处于其电子激发态的供体荧光团可以通过非辐射偶极-偶极耦合将能量转移至受体荧光团，然后fret系统的荧光发射可以根据两个荧光团的距离和状态而不同。
[0264]
开发了利用fret效应的基于量子点的nadh传感器(图10)。将高度荧光cdse量子点用cdse/cds/cdzn纳米晶体、羧酸和牛血清白蛋白涂覆，以得到具有590nm的激发和616nm至620nm的明亮荧光的量子点核。对于nadh检测，将尼罗蓝结合到量子点的表面上，通过fret效应减弱荧光。在存在nadh的情况下，尼罗蓝被还原，并且量子点的荧光恢复。荧光强度与nadh的浓度密切相关，因此允许定量检测。在微流体系统中测试用量子点进行的nadh的检测(图11)。在nadh浓度》500μm时可以容易地检测到nadh，其中信噪比为3。
[0265]
用于对微流体中的nad

进行高度灵敏且精确的检测的通用测定
[0266]
用蛋白质生物传感器对nad

的检测
[0267]
开发了基于荧光蛋白的nad

生物传感器，以对nad

进行定量检测。生物传感器由荧光核心结构域(在488nm下激发，在520nm下发射)和二分nad

结合结构域构成。在该设置中，来自核心结构域的荧光被nad

结合淬灭，对应于结合的nad

的浓度(图12a)。生物传感器荧光强度和nad

浓度在1μm至1000μm nad

的范围内负相关。在微流体液滴中的不同nad

浓度下检查了用蛋白质生物传感器进行的nad

检测。在50μm至1000μm nad

的范围内显示出生物传感器荧光强度与nad

浓度之间的几乎线性相关。用1mm nad

展示了在微滴中使用生物传感器对nad

的检测。包含nad

的那些液滴由于淬灭机制而显示出低21％的荧光信号(图12b)。
[0268]
通过fret效应用量子点对nad

的检测
[0269]
通过fret效应用量子点荧光传感器开发了nad

感测的另一个实例(图13a)。将高度荧光cdse量子点核用3-巯基丙酸涂覆并连接至nad

结合结构域(硫醇化dbc1蛋白质传感器)。据报道，蛋白质传感器特异性地结合nad

。当发生这样的结合时，量子点的荧光被有效地淬灭(图13b)。因此，量子点传感器的荧光信号与nad

浓度负相关。这允许基于荧光信号的变化精确测定nad

。
[0270]
探究了量子点nad

传感器的性能。在538nm的激发下进一步检查和验证了定量nad

淬灭，并在595nm处检测到荧光发射。随着nad

浓度的增加，传感器的荧光在非常低的nad

浓度下淬灭。传感器能够检测nad

，其中检测限为30μm，以及传感器浓度为1.5μm，以及固定孵育时间为20分钟。当nad

浓度达到250μm及以上时，超过90％荧光信号被淬灭。量子点传感器对nad

具有高度特异性。nad(p)h的存在不影响荧光信号。
[0271]
对于微流体中的nad

检测，用不同浓度的nad

检查1.5μm传感器的荧光。当与200μm nad

一起孵育时，传感器的荧光信号降低约25％，在存在250μm nad

的情况下降低45％(图14a)。这通过荧光显微分析得到进一步确定，荧光显微分析显示出液滴的荧光强度与nad

浓度负相关(图14b)。
[0272]
微流体装置的设计和开发
[0273]
液滴的信号检测
[0274]
使用输出电压模拟信号的pmt检测器可靠地检测含nad(p)h的液滴的荧光或生物发光信号。使用arduino微控制器(due)进行信号采集、a/d转换和处理。将微控制器设定为在允许300khz至500khz的采样率的自由模式下运行，具有8位窗口移动平均滤波器(图15)。这允许非常精确地检测信号的变化。a/d转换以10位分辨率进行，从而能够以0.1％的差异区分荧光信号。
[0275]
然后将经处理的信号与预设的分选阈值进行匹配。当信号水平达到该阈值的期望范围时，微控制器输出数字分选脉冲，从而能够在放大之后实现分选动作。
[0276]
用于液滴分选的微流体装置
[0277]
图16中示出液滴分选装置。将含有目的样品的液滴连续注入装置中，并通过注入大量间隔油扩大液滴间间距。然后检测来自各液滴的荧光或生物发光信号。在没有任何分选动作的情况下，所有液滴流向废物通道(图17a)。一旦信号达到期望水平以上，就会触发分选脉冲。脉冲被放大以在分选电极之间产生200v至1000v电场，从而将阳性液滴从通往废物通道的路径中拉出(图17b)。
[0278]
结合上述信号检测硬件，通过从90％空(或空白)液滴中基于荧光地分选出10％阳性荧光液滴，对分选装置进行验证。在分选2小时之后，收集器中的液滴包含92％阳性液滴(图17d)，表示9倍样品富集。由于仅0.5％阳性液滴保留在废物通道中，观察到95％效率(图17c)。
[0279]
类似地，展示了从15％ nadh液滴和85％空(或空白)液滴的混合物中分选出含有nadh的液滴(图17e至图17f)。nadh浓度为10mm，并且分选基于450nm处的nadh荧光。在分选2小时之后，收集器通道包含60％含nadh的液滴，显示出4倍富集。
[0280]
基于由2-辛醇与野生型cpsadh反应形成的nadh的液滴的富集
[0281]
验证了微流体分选装置对含有对nadh生成反应进行催化的单个大肠杆菌(cpsadh)细胞的10％阳性液滴和90％空(或空白)液滴的分选。在阳性液滴中，单个细胞被裂解以释放cpsadh，cpsadh对2-丁醇与nad

的氧化进行催化以产生化学计量的量的nadh。液滴中的试剂与nadh反应以产生强烈的红色荧光。另一方面，空(或空白)液滴不产生nadh，因此仅显示出低背景荧光。将具有高荧光的液滴分选并收集在收集器中(图18)。分选出的部分包含70％阳性液滴，显示出7倍富集。
[0282]
在以上实施例中，液滴分选速度可以达到2000滴/秒。由于本发明平台的高灵敏度，因此可以实现这种高速分选。
[0283]
液滴合并装置
[0284]
液滴合并是将任何试剂再引入到形成的液滴中，从而实现复杂的多步筛选的技术。开发了合并装置以实现液滴合并，如图19a所示。将液滴装入装置中并用间隔油冲洗通过水平通道。在通道的中间，安装垂直通道，以通过合并向通过的液滴中注入新的试剂。注入体积和时间由电极精确控制。
[0285]
制造合并装置并用90％空(或空白)液滴和10％蓝色荧光液滴的混合物以10滴/秒的流量进行测试。以液滴体积的30％的比例通过合并向液滴混合物中引入红色荧光染料。如图19b所示，合并过程非常一致，仅具有5％波动。检查紧挨蓝色液滴的空(或空白)液滴中的蓝色荧光染料显示出样品转移(交叉液滴污染)小于7％。
[0286]
使用微流体筛选平台对酶的定向进化
[0287]
对cpsadh进行了进化以用工业上有用的酶展示了基于微流体的高通量酶筛选和进化。构建了具有20,000个变体的cpsadh的靶向文库，并将其转移到大肠杆菌中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞作为底物的外消旋2-辛醇和检测酶的溶液，并从另一个入口注入包含红色荧光试剂、裂解缓冲液和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。然后将细胞以单个细胞封装在包含反应底物、检测酶和nad

辅因子的油包水微滴内。根据由产生的nadh获得的其红色荧光信号水平对液滴进行分选。对分选的液滴进行dna回收并进一步分析其活性和序列信息。与r对映异构体的野生型(wt)相比，确定了突变体cpsadh-l55y/f285i/w286c提供175倍活性的提高。还实现了87.4％的外消旋混合物的转化，而wt仅可以达到62％。与wt不同，这种新酶可以利用两种对映异构体以避免在将可廉价获得的外消旋2-辛醇转化为非常期望的相应酮时浪费r-对映异构体。
[0288]
实施例4
[0289]
实施例4：使用裂解的细胞和nadh检测对作为nad

依赖性细胞内酶的来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)的定向进化和微流体高通量筛选
[0290]
进行了用于非对映选择性醇氧化的醇脱氢酶(cpsadh)的定向进化。该实施例展示了图4e中系统的一个实例，其检测产生的nadh以对液滴进行分选。通过使用微流体系统对超过20,000个cpsadh突变体的文库进行筛选。仲醇脱氢酶cpsadh是中链脱氢酶/还原酶(mdr)酶家族的成员。cpsadh对醇与相应酮之间的可逆氧化还原反应进行催化，其中底物范围广。由于其高立体选择性，外消旋醇氧化的理论转化仅为50％。cpsadh被选择进行改造，以显示出对醇氧化的增强的r对映选择性，或者甚至非对映选择性。(r)-2-辛醇对接到cpsadh的活性袋中，并选择四个氨基酸残基(leu55、leu119、phe285和trp286)同时进行饱和诱变。选择ndt简并密码子替代选定的位点。然后，经由重叠延伸pcr方法创建诱变文库。文库的基因片段由诱变引物和侧翼引物产生。组合突变体文库包含20,736个变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和作为底物的醇的溶液，并从另一个入口注入包含红色荧光试剂、裂解缓冲液和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。将文库的细胞以单个细胞封装在包含反应底物、裂解缓冲液和nad

辅因子的油包水微滴内。在孵育之后，对液滴进行筛选，并将荧光强度高于特定阈值的液滴识别为可能的命中并由此分选。对收集的液滴进行分选后分析，以得到酶序列。识别出一组酶突变体(表2)，其包括四种变体，突变体1至突变体4(分别为cpsadh-l55v/l262f/w286g、cpsadh-l55y/f285i/w286c、cpsadh-l55v/w286c和cpsadh-f285i/w286g)，显示出获得比野生型更高的对(r)-2-丁醇的活性。与r对映异构体
的wt相比，突变体2的kcat/km显示出175倍增加(表3)。对突变体的进一步表征显示，使用nadh再生系统将外消旋2-辛醇完全转化为2-辛酮，而wt在相同反应条件下可以达到49％的转化(图21)。
[0291]
表2.用于对从基于微流体的筛选中获得的外消旋2-辛醇进行氧化的表现最好的cpsadh突变体。
[0292]
表3.野生型(wt)和cpsadh突变体对s-2-辛醇对映异构体和r-2-辛醇对映异构体的催化动力学常数。
[0293]
表4.用不同cpsadh变体对2-辛醇进行氧化的转化率。
[0294][0295]
实施例5
[0296]
实施例5.使用全细胞和经由目标产物的另外的酶促反应的nadh检测对作为辅因子非依赖性细胞内酶的来自鞘氨醇单胞菌属hxn-200的环氧化物水解酶(speh)的定向进化和微流体高通量筛选
[0297]
该实施例展示了使用如图4a中描述的步骤对环氧化物水解酶(eh)的筛选和进化。制备具有104至107个变体的来自鞘氨醇单胞菌属hxn-200的环氧化物水解酶(speh)的突变体文库并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞作为底物的环氧化物和检测酶(adh)的溶液，并从另一个入口注入包含红色荧光试剂和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。然后将细胞以单个细胞封装在包含环氧化物、检测酶和nad

辅因子的油包水微滴内。根据经由二醇到酮醇的级联反应产生的nadh中获得的红色荧光信号对液滴进行分选。对分选的细胞进行进一步分析并接种在包含适当抗生素的lb-琼脂板上以分析其活性并获得其序列信息。
[0298]
实施例6
[0299]
实施例7.使用全细胞和经由目标产物的另外的酶促反应的nadh检测对作为辅因子非依赖性细胞内酶的苯乙烯氧化物异构酶(soi)的定向进化的微流体高通量筛选
[0300]
该实施例展示了使用如图4a中描述的步骤对苯乙烯氧化物异构酶(soi)的筛选和
进化。制备soi的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞作为底物的苯乙烯氧化物和检测酶的溶液，并从另一个入口注入包含红色荧光试剂和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。然后将细胞以单个细胞封装在包含反应底物、检测酶和nad

辅因子的油包水微滴内。根据经由苯乙醛到苯乙酸的级联反应产生的nadh中获得的红色荧光信号对液滴进行分选。对分选的细胞进行进一步分析并接种在包含适当抗生素的lb-琼脂板上以分析其活性并获得其序列信息。
[0301]
实施例7
[0302]
实施例7.使用nadh检测对作为nad

依赖性表面展示酶的来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0303]
该实施例展示了对经大肠杆菌表面展示的作为nadh依赖性酶的仲醇脱氢酶(cpsadh)的筛选和进化。如图26所示构建质粒。筛选步骤如图4d所述。制备cpsadh的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和作为底物的2-辛醇的溶液，并从另一个入口注入包含红色荧光试剂和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。将文库的细胞以单个细胞封装在包含反应底物、红色荧光试剂和nad

辅因子的油包水微滴内。2-辛醇底物转化为酮，并通过感测产生的nadh来检测反应。根据由产生的nadh获得的红色荧光信号对液滴进行分选。对分选的细胞进行进一步分析并接种在包含适当抗生素的lb-琼脂板上以分析其活性并获得其序列信息。
[0304]
实施例8
[0305]
实施例8.使用裂解的细胞和经由目标产物的另外的酶促反应的nadh检测对作为辅因子非依赖性细胞内酶的来自鞘氨醇单胞菌属hxn-200的环氧化物水解酶(speh)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0306]
为了展示这一类别的实例，使用作为辅因子非依赖性酶的speh，并且步骤如图4c中述。制备speh的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用3入口微流体芯片将细胞封装在水微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和作为底物的环氧化物的溶液，并从另
一个入口注入包含红色荧光试剂、裂解缓冲液和nad

的另一种溶液，并且第三入口用于油。将文库的细胞以单个细胞封装在包含反应底物、检测酶、裂解缓冲液和nad

辅因子的油包水微滴内。根据使用心肌黄酶和刃天青产生的nadh中获得的荧光信号对液滴进行分选。根据经由二醇到酮醇的级联反应产生的nadh中获得的红色荧光信号对液滴进行分选。对分选的液滴进行进一步分析以从液滴中回收dna。然后将获得的dna转化到电感受态大肠杆菌细胞(从lucigen获得)中以分析其活性和序列信息。
[0307]
实施例9
[0308]
实施例9.使用全细胞和经由目标产物的另外的酶促反应的nadh检测通过细胞生长和液滴合并对作为辅因子依赖性细胞内酶的p450单加氧酶(p450pyr)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0309]
该实施例展示了使用如图5a中描述的步骤对p450pyr的筛选和进化。制备p450pyr的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使表达变体的细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在培养基中。使用2入口微流体芯片将细胞封装在微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和适当培养基的溶液，并从另一个入口注入油以实现单个细胞封装。然后使细胞在30℃至37℃和振荡条件下通过孵育生长。液滴内的单个细胞可以繁殖以增加细胞的数量(图27)。使用合并系统向液滴中添加诱导剂、作为底物的辛烷、检测酶(adh)、红色荧光试剂和nad

。辛烷转化为辛醇，并使用检测酶(adh)通过级联将其进一步转化为酮。用红色荧光试剂检测经由级联反应产生的nadh，并对液滴进行分选。对分选的细胞进行进一步分析并接种在包含适当抗生素的lb-琼脂板上以分析其活性并获得其序列信息。
[0310]
实施例10
[0311]
实施例10.使用裂解的细胞和nadh检测通过细胞生长和液滴合并对作为nad

依赖性细胞内酶的来自红球菌属的胺脱氢酶(amdh)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0312]
胺脱氢酶(amdh)是可用于对映选择性胺化的酶。三重突变体amdh显示出低催化活性。由于amdh是辅因子依赖性酶，因此将检测到在脱氨反应中产生的nadh。直接对细胞进行碱液处理并与单个细胞进行反应的初步努力显示出不良的分选富集。因此，为了在微流体系统中对amdh变体进行检测和分选，需要使细胞在液滴中生长，然后随后进行液滴合并，以向液滴中添加反应试剂和裂解缓冲液。步骤如图5e所述。制备amdh的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在培养基中。使用2入口微流体芯片将细胞封装在微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和适当培养基的溶液，并从另一个入口注入油以实现单个细胞封装。然后使细胞在30℃至37℃和振荡条件下通过孵育生长。液滴内的单个细胞可以繁殖以增加细胞的数量(图27)。使用合并系统向液滴中添加诱导剂、裂解缓冲液、作为底物的胺、红色荧光试剂和nad

。胺转化为酮，并使用红色荧光试剂检测产生的nadh。根据荧光信号对液滴进行分选。对分选的液滴进行进一步分析以从液滴中回收dna。然后将获得的dna转化到电感受态大肠杆菌细胞(从lucigen获得)中以分析其活性和序列信息。
[0313]
实施例11
[0314]
实施例11.使用生物传感器或量子点通过细胞生长和液滴合并以及nad

检测对作为nadh依赖性细胞外酶的来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0315]
该实施例展示了使用如图5d中描述的步骤对cpsadh的筛选和进化。展示了使用生物传感器的nad

辅因子检测。制备cpsadh的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中以进行细胞外表达，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在培养基中。使用2入口微流体芯片将细胞封装在微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和适当培养基的溶液，并从另一个入口注入油以实现单个细胞封装。然后使细胞在30℃至37℃和振荡条件下通过孵育生长。液滴内的单个细胞可以繁殖以增加细胞的数量。使用合并系统向液滴中添加诱导剂、作为非天然底物的丁酮、nad

生物传感器或量子点、和nadh。新鲜表达的细胞外酶执行丁酮到丁醇的转化。经由产生的nad

与生物传感器的相互作用对其进行检测，并将获得的信号用于液滴分选。对分选的细胞进行进一步分析并接种在包含适当抗生素的lb-琼脂板上以分析其活性并获得其序列信息。
[0316]
实施例12
[0317]
实施例12.使用裂解的细胞和经由目标产物的另外的酶促反应的nadh检测通过细胞生长和液滴合并对作为辅因子非依赖性细胞内酶的苯乙烯氧化物异构酶(soi)的定向进化的微流体高通量筛选。
[0318]
该实施例展示了使用如图5c中描述的步骤对苯乙烯氧化物异构酶(soi)的筛选和进化。在该实施例中，使作为非nadh辅因子依赖性的soi进化以接受作为非天然底物的脂族环氧化物。制备soi的突变体文库(104至107个变体)并将其转移到宿主微生物(大肠杆菌)中，其中每个细胞仅表达单一酶变体。使包含变体的大肠杆菌细胞在包含适当抗生素的1ml lb培养基中于37℃下生长。在细胞之后，添加iptg(0.5mm)以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达酶持续12小时。通过离心(4000g，10分钟)将其收获，洗涤两次，并重新悬浮在适当的缓冲液中。使用2入口微流体芯片将细胞封装在微滴中。使用注射器泵从一个入口注入包含文库细胞和适当培养基的溶液，并从另一个入口注入油以实现单个细胞封装。然后使细胞在30℃至37℃和振荡条件下通过孵育生长。液滴内的单个细胞可以繁殖以增加细胞的数量。使用合并系统向液滴中添加诱导剂、作为非天然底物的丁酮、检测酶和nad

。然后将细胞以单个细胞封装在包含反应底物、裂解缓冲液、检测酶和nad

辅因子的油包水微滴内。细胞裂解，然后脂族环氧化物转化为相应的醛。根据经由醛到乙酸的级联反应产生的nadh中获得的红色荧光信号对液滴进行分选。对分选的液滴进行进一步分析以从液滴中回收dna。然后将获得的dna转化到电感受态大肠杆菌细胞(从lucigen获得)中以分析其活性和序列信息。
[0319]
虽然本文中已经描述和举例说明了本公开内容的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文中所述的功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改都被认为在本公开
内容的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和配置均意指是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本公开内容的教导的一项或更多项特定应用。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅通过实例给出，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以除具体描述和要求保护之外的方式实施。本公开内容涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料和/或方法没有相互不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料和/或方法的任意组合包括在本公开内容的范围内。
[0320]
除非明确地指出相反，否则如本文在说明书中和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解成意指“至少一个/种”。
[0321]
如本文在说明书中和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解成意指如此连接的要素中的“之一或两者”，即在一些情况下要素结合存在，而在另一些情况下要素分别存在。除非明确地指出相反，否则可以任选地存在除了通过“和/或”连词具体标识的要素之外的其他要素，无论其与具体标识的那些要素相关或不相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包括”结合使用时，提及“a和/或b”在一个实施方案中可以是指a而没有b(任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中可以是指b而没有a(任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中可以是指a和b二者(任选地包括其他要素)；等等。
[0322]
如本文在说明书中和权利要求书中使用的，“或/或者”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，并且任选地包括另外的未列举项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当用于权利要求时“由
……
组成”，将是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当前面有排他性术语(例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“恰好其一”)时，如本文中使用的术语“或”仅应理解为表示排他性替代方案(即，“一个/种或另一个/种，但并非二者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由
……
组成”应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。
[0323]
如本文在说明书中和权利要求书中所使用的，在提及一个或更多个要素的列表时，短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包括要素列表内具体列出的各个和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可以任选地存在除在短语“至少一个”所提及的要素列表内具标识的要素之外的要素，无论其与具体标识的那些要素相关或不相关。因此，作为一个非限制性实例，“a和b中的至少一个/种”(或等同地，“a或b中的至少一个/种”，或等同地，“a和/或b中的至少一个/种”)在一个实施方案中可以指至少一个a，任选地包括多于一个a，而不存在b(并且任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个b，任选地包括多于一个b，而不存在a(并且任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中，可以指至少一个a，任选地包括多于一个a，以及至少一个b，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其它要素)；等等。
[0324]
一些实施方案可以体现为已经描述了其多个实例的方法。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可以构建以不同于所示的顺序来执行动作的实施方案，其可以包括与所描述的那些不同(例如，更多或更少)的动作，和/或可以涉及同时
执行一些动作，即使这些动作在上面具体描述的实施方案中被示为顺序执行。
[0325]
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语以修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先级、优先序或次序，或者执行方法的动作的时间顺序，而仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一要素区分的标记(但是使用序数术语)以区分权利要求要素。
[0326]
在权利要求书中以及以上说明书中，所有连接词例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等都应理解为开放式的，即理解为意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中阐述的，只有连接词“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”应分别是封闭式或半封闭式连接词。