用于酶开发的超高通量微流体酶筛选平台

技术特征：
1.一种针对一种或更多种特性筛选酶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)产生复数个液滴，其中至少一个液滴包含：酶，反应底物；以及一种或更多种氧化还原辅因子、或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中所述酶将所述反应底物转化为目标产物；(b)检测从所述液滴发射的信号，其中所述信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号，(i)其中所述信号是当在所述反应底物被所述酶转化为所述目标产物时所述氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的，或者(ii)其中所述信号是在当所述目标产物被所述液滴中的所述一种或更多种检测试剂进一步转化为后续产物时所述氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。2.一种针对一种或更多种特性筛选酶的方法，包括：在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包括孵育区域，所述孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室，其中所述复数个孵育室被配置成允许复数个液滴连续流动，所述步骤为：培养所述液滴中的细胞以形成复数个细胞，同时使所述细胞从所述第一孵育室流动至所述第二孵育室；使所述液滴在所述孵育区域中连续流动，其中所述液滴包含酶、反应底物，以及一种或更多种氧化还原辅因子、或者一种或更多种氧化还原辅因子和一种或更多种检测试剂，其中所述酶将所述反应底物转化为目标产物；以及从所述液滴中产生信号，其中所述信号为荧光信号、生物发光信号或化学发光信号。3.一种流体系统，包括：复数个液滴，所述复数个液滴包括第一液滴，所述第一液滴包含氧化还原辅因子，其中所述液滴中的所述氧化还原辅因子的浓度大于或等于5μm；包含所述液滴的微流体通道；和与所述微流体通道流体连通的液滴分选区域，其中所述液滴分选区域包括与所述微流体通道相邻的电极组。4.一种流体系统，包括：包含复数个液滴的微流体通道，其中至少一个液滴包含氧化还原辅因子和检测试剂；以及其中所述检测试剂被配置成与所述氧化还原辅因子的氧化还原对反应以产生发光信号。5.一种流体系统，包括：第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶；第二试剂室，其中所述第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与所述第一流体不混溶的第二液体，并且与至少所述第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将所述第一液体和所述第二液体合并；与所述合并区域流体连通的孵育区域，其中所述孵育区域包括：复数个孵育室，所述复数个孵育室包括流体中的第一孵育室和第二孵育室，其中所述
第一孵育室和所述第二孵育室被配置成允许液滴在所述室之间连续流动；与所述孵育区域流体连通的液滴分选区域，其中所述液滴分选区域包括：检测区，所述检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于所述液滴中组分的检测对复数个液滴进行分选，收集通道，和废物通道；以及定位在所述孵育区域与所述液滴分选区域之间的气泡捕集器。6.根据前述权利要求所述的流体系统，还包括在所述液滴分选区域内的第二载液室。7.一种流体系统，包括：第一试剂室，所述第一试剂室被配置成包含第一液体和复数个细胞，所述细胞中的至少一者包含酶；第二试剂室，其中所述第二室被配置成包含反应底物；载液室，所述载液室被配置成包含与所述第一流体不混溶的第二液体，并且与至少所述第一试剂室流体连通；合并区域，所述合并区域被配置成允许将所述第一液体和所述第二液体合并；与所述合并区域流体连通的孵育区域，其中所述孵育区域包括复数个孵育室，所述复数个孵育室包括第一孵育室和第二孵育室；检测区，所述检测区包括第一检测器，其中所述第一检测器被配置成确定第一波长的第一发光信号和第二波长的第二发光信号，其中所述第一波长和所述第二波长不同；与所述孵育区域流体连通的液滴分选区域；所述检测区下游的电极组，所述电极组被配置成基于所述液滴中的一种或更多种组分的检测对复数个液滴进行分选；收集通道；和废物通道。8.根据前述权利要求所述的流体系统，还包括定位在所述第一检测器上游的第二检测器，任选地其中所述第二检测器被配置成接收第一波长的第一发光信号和第二波长的第二发光信号，其中所述第一波长和所述第二波长不同。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平针对所述一种或更多种特性筛选所述酶，其中与所述参照信号相比发射信号的水平变化表明所述酶具有所述一种或更多种特性。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平来分离所述液滴。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括基于与参照信号相比检测到的发射信号的水平对所述液滴进行分选。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述复数个液滴内培养细胞。13.根据前述权利要求所述的方法，其中培养包括在所述复数个液滴内使细胞增殖。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括使一个或更多个细胞裂解。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测包括检测细胞内或细胞表面展
示酶。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测包括检测细胞外酶。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在不存在nadh的情况下检测到与参照信号相比更低的信号。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在nadh的存在下发射具有590nm的激发波长和620nm的发射波长的荧光信号。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶为氧化还原辅因子依赖性酶并且所述信号是在当所述反应底物被所述酶转化为所述目标产物时所述氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶为氧化还原辅因子非依赖性酶并且所述信号是在当所述目标产物被所述一种或更多种检测试剂进一步转化为后续产物时所述氧化还原辅因子被氧化或还原时发射的。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)中产生所述复数个液滴还包括在添加所述反应底物、检测试剂、一种或更多种检测试剂、裂解缓冲液、氧化还原辅因子或其组合之前用所述液滴中的培养基孵育每个液滴中的宿主细胞以增加宿主细胞的数量。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过使用选自以下的方法分离所述液滴：荧光激活液滴分选(fads)、荧光激活细胞分选(facs)和磁激活细胞分选(macs)、声控制技术、磁控制技术、气动控制技术、热控制技术、电控制技术及其组合。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶的所述一种或更多种特性选自酶活性、稳定性、特异性、立体选择性、转化非天然底物的能力及其组合。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括对经分离的液滴中的酶的氨基酸序列、多核苷酸序列或两者进行测序的步骤，任选地其中经测序的酶用于产生酶变体文库。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶在宿主细胞中表达，以及其中所述复数个液滴还包含所述宿主细胞或其片段。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括检测所述分选区上游的发光信号，任选地将所述第一发光信号与从所述液滴发射的信号进行比较。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括检测第一发光信号和第二发光信号，任选地包括将所述第一发光信号和所述第二发光信号或者所述第一发光信号和所述第二发光信号的导出信号跟从所述液滴发射的信号进行比较。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在分选区域上游产生的信号被传输至所述分选区域。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括向分选电极组施加电压。30.根据前述权利要求中任一项的用于筛选酶的方法用于提高其天然底物的转化、提高其非天然底物的转化、提高催化活性、提高立体选择性、提高热稳定性、提高在预定ph范围内的稳定性、或其组合的用途。31.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述一种或更多种氧化还原辅因子选自nad

、nadh、nadp

、nadph、nad

和nadp

、以及nadh和nadph。32.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述复数个液滴中的每个液
滴还包含与经氧化或还原的氧化还原辅因子反应以产生所述发射信号的一种或更多种检测试剂。33.根据权利要求32所述的系统或方法，其中所述氧化还原辅因子为nadh或nadph或两者，以及其中所述一种或更多种检测试剂选自：i)刃天青和心肌黄酶；ii)前萤光素、萤光素酶、还原酶、atp和mg
2
；和iii)量子点。34.根据权利要求32所述的系统或方法，其中所述氧化还原辅因子为nad

或nadp

或两者，以及其中所述一种或更多种检测试剂选自：i)量子点；和ii)蛋白质生物传感器。35.根据权利要求33至34中任一项所述的系统或方法，其中所述量子点为cdse/cds/cdzns/zns量子点。36.根据权利要求33至35中任一项所述的系统或方法，其中所述量子点为涂覆有羧酸和牛血清白蛋白以及尼罗蓝染料的cdse/cds/cdzns/zns量子点。37.根据权利要求33至36中任一项所述的系统或方法，其中所述量子点为水溶性的。38.根据权利要求33至37中任一项所述的系统或方法，其中所述量子点为涂覆有3-巯基丙酸并且连接至nad 结合结构域的cdse/cds/cdzns/zns量子点。39.根据权利要求38所述的系统或方法，其中所述nad

结合结构域为硫醇化的dbc1蛋白传感器。40.根据权利要求38至39中任一项所述的系统或方法，其中与参照信号相比，在nad

存在下发射具有538nm的激发波长和595nm的发射波长的更低的荧光信号。41.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述酶为氧化还原辅因子依赖性酶或氧化还原辅因子非依赖性酶。42.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原生动物细胞、藻类细胞和古菌细胞。43.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述复数个液滴中的至少一者或更多者还包含裂解缓冲液。44.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述复数个液滴选自油包水液滴、水包油包水液滴、水包油液滴和水凝胶液滴。45.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述复数个液滴的直径为约10μm至100μm。46.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述复数个液滴的直径为约30μm。47.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述酶选自细胞内酶、表面展示酶或细胞外酶。48.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述酶选自来自近平滑念珠菌的仲醇脱氢酶(cpsadh)、来自鞘氨醇单胞菌属hxn-200的环氧化物水解酶(speh)、苯乙烯氧化物异构酶(soi)、p450单加氧酶(p450pyr)、来自红球菌属的胺脱氢酶(amdh)、和丁二醇
脱氢酶(bdha)。49.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述酶为选自单一酶的酶变体文库的酶变体，或者其中所述酶选自不同酶的组。50.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，其中所述辅因子为外源性辅因子。51.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，还包括一个或更多个液滴，所述一个或更多个液滴各自包含含有内源性辅因子浓度的至少一个细胞，以及其中外源性辅因子浓度大于内源性辅因子浓度。52.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，还包括定位在分选区域上游的检测器。53.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法，还包括气泡捕集器，所述气泡捕集器任选地包括真空端口。

技术总结
描述了用于筛选酶变体的系统和方法，其中酶变体可以催化辅因子依赖性或辅因子非依赖性反应。性反应。性反应。


技术研发人员：李智 陈家宏 周康 李俊 刘击 阿克巴尔
受保护的技术使用者：新加坡国立大学
技术研发日：2021.04.13
技术公布日：2023/2/13