Rbm24在长QT间期综合征的诊断和治疗中的用途

rbm24在长qt间期综合征的诊断和治疗中的用途
技术领域
1.本发明属于生物标志物领域，具体地，本发明涉及上调rbm24或抑制其下游因子camkⅱδ的可变剪切体δ-c的试剂在长qt间期综合征(lqt)的诊断和治疗中的用途。


背景技术：

2.长qt间期综合征(lqt)是一种以qt延长和心电图t波异常为特征的心脏电生理障碍疾病，患者易发生尖端扭转性室速、室颤和心源性猝死。先天性长qt间期综合征是一种遗传性心脏离子通道病，而获得性长qt间期综合征由外在因素，通常是药物或电解质异常导致离子通道功能的改变而引起，其是儿童和青少年心脏结构正常发生心源性晕厥和猝死的重要原因之一。
3.获得性lqts通常不需要长期治疗，去除引起qt间期延长的原因后，qt间期多可恢复正常。遗传性lqts患者必须进行长期预防性的治疗以降低猝死的风险，主要的治疗手段是受体阻滞剂。由于遗传性lqts的治疗和预后有着鲜明的基因特异性，基因学结果指导下的个体化治疗策略将在很大程度上提高lqts患者及其家族成员的治疗效果。因此，积极寻找lqt发生发展的相关机制，明确lqt的致病基因，为临床诊断提供评价，筛选合适的治疗靶点，是当前国民健康和医疗保障领域极为迫切的需求。


技术实现要素：

4.本发明提供了用于诊断长qt间期综合征的标志物rbm24及其用途。本发明人构建了rbm24心脏特异性敲除小鼠模型，发现与野生型小鼠相比，rbm24基因敲除小鼠出现了qt间期延长现象。这提示rbm24可以作为qt间期延长综合症的生物标志物。进一步通过高通量测序分析，本发明人找到了钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii delta(camkⅱδ)，其可以调节l型钙离子通道对钙离子的通透作用，并发现在rbm24敲除小鼠心脏中，camkⅱδ的可变剪切形式发生了变化，rbm24敲除导致δ-c增多，使用camkⅱδ的抑制剂kn-93处理小鼠，发现其可逆转小鼠qt间期延长的现象。因此，rbm24及其下游因子camkⅱδ有可能作为治疗qt间期延长综合症的靶点。
5.在一个方面，本发明提供了rbm24在长qt间期综合征中作为生物标记物的用途。
6.在一个具体实施方案中，本发明提供了测定rbm24水平的物质在制备用于诊断长qt间期综合征的产品中的用途。具体地，其中所述检测rbm24表达水平的试剂包括检测rbm24基因mrna表达水平的试剂，和/或检测rbm24蛋白表达水平的试剂。在一个具体实施方案中，所述检测rbm24基因mrna表达水平的试剂包括实时定量pcr中使用的引物，和/或探针。在一个具体实施方案中，其中所述检测rbm24蛋白表达水平的试剂包括针对rbm24蛋白的抗体。在一个具体实施方案中，所述用于诊断长qt间期综合征的产品包括试剂盒、芯片或试纸。
7.在第二个方面，本发明提供了基于rbm24及其下游因子camkⅱδ在预防和治疗长qt间期综合征中作为药物靶点的用途。在一个具体实施方案中，本发明提供了增加rbm24表达
的试剂或者抑制camkⅱδ可变剪切体δ-c的试剂在制备用于治疗长qt间期综合征的药物中的用途，在一个具体实施方案中，所述试剂选自δ-c的抑制剂、sirna或rna干扰载体。
8.本文中的“样品”是从对象处分离出的生物样品，其可以包括：例如，但不限于，全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、组织活检、淋巴液、腹水、间质液(也称为“细胞外液”，包括在细胞间隙中发现的液体)、骨髓、脑脊液(csf)、唾液、粘液、痰液、汗液、尿液或任何其它分泌物、排泄物或其它体液。
9.本发明文中的“受试者”优选哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人的哺乳动物可以有利地用作代表长qt间期综合征动物模型的受试者。受试者还可以是之前未被诊断或鉴定为患有长qt间期综合征者。例如，受试者可以是表现出一种或多种长qt间期综合征风险因素者，或未表现出长qt间期综合征风险因素的受试者或无长qt间期综合征症状的受试者。受试者还可以是患有长qt间期综合征或具有发展长qt间期综合征风险者。
10.可以测量测试样品中rbm24蛋白、肽、核酸、多态性、代谢物或其它分析物的量并与正常对照水平进行比较。由本发明的方法测量的rbm24的水平或量(可以是“有效量”)的差异可以包括与正常对照水平、参考值、指标值或基准值相比rbm24水平或量的升高或降低。相对于参考值，rbm24量的升高或降低可以表明长qt间期综合征的进展；长qt间期综合征的延缓、进展、发展或减轻；发展长qt间期综合征或其相关并发症风险的升高或降低。升高或降低可以指示一种或多种长qt间期综合征治疗方案的成功；或可以指示长qt间期综合征风险因素的改善或消退。升高或降低可以为，例如，参考值或正常对照水平的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
11.可以使用本领域内已知的任何方法在rna水平上测量rbm24的基因表达。例如，使用特异地识别一种或多种这些序列的探针的northern杂交分析可用于测定基因表达。作为另外一种选择，可以使用逆转录pcr测定法(rt-pcr)测量表达，例如，使用对差异表达序列特异的引物。还可以使用，例如，其它靶扩增法(例如，tma、sda、nasba)或信号扩增法(例如，bdna)等来定量rna。优选地，通过实时pcr检测本发明生物标志物的表达水平，如还描述在pct/us02/38806(以wo03/048377公开；therianos等人，(2004)am.j.pathol.164(3)：795-806，它们的内容以引用方式并入本文)。
12.作为另外一种选择，可以测量rbm24蛋白和核酸的代谢物或片段。可以用本领域的技术人员所已知的多种方法检测代谢物，包括：折射率光谱(ri)、紫外光谱法(uv)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(near-ir)、核磁共振光谱(nmr)、光散射分析(ls)、质谱、热解质谱法、比浊法、色散型拉曼光谱(dispersive raman spectroscopy)、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)、表面加强激光解析电离化(seldi)质谱、结合质谱的离子喷射光谱、毛细血管电泳、nmr和ir检测。(参见，wo 04/056456和wo04/088309，它们的整体以引用方式并入)。在这点上，可以使用上述检测方法或技术人员已知的其它方法测量其它rbm24分析物。
附图说明
13.图1：rbm24条件敲除小鼠的构建示意图。
14.图2：qpcr检测rbm24在小鼠中的敲除结果。
15.图3：wb检测rbm24在小鼠中的敲除结果。
16.图4：rbm24敲除小鼠心电监测情况。
17.图5：rbm24调控camkⅱδ的可变剪切。
18.图6：电生理检测的小鼠心肌细胞动作电位时程。
19.图7：小鼠心肌细胞动作电位时程统计结果。
20.图8：使用camkⅱδ抑制剂kn93处理rbm24敲除小鼠的qt间期。
21.图9：免疫荧光验证人胚胎干细胞分化成心肌细胞。
22.图10：qpcr验证rbm24在人胚胎干细胞来源的心肌细胞中的敲除。
23.图11：电生理检测的人胚胎干细胞来源的心肌细胞动作电位时程。
24.图12：人胚胎干细胞来源的心肌细胞动作电位时程统计结果。
具体实施方式
25.本文使用的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一种”，“一个”和“该”的术语不旨在仅指单数实体，而是包括特定实施例可以用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的用法不限制本发明，除非在权利要求中概述。
26.实施例
27.实施例1.利用rbm24条件性敲除(ert)小鼠模型,分析rbm24敲除对lqt的影响
28.1.1构建rbm24条件性敲除小鼠。
29.方法：通过在rbm24基因的第二和第三外显子两端插入loxp位点，构建rbm24条件敲除小鼠(图1)，进而与ert(ubc-creert2)小鼠交配，所得的后代，在腹腔注射他莫昔芬后，可诱导rbm24敲除将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下，以12:12小时的明/暗周期进行饲养，并接受常规食物和随意饮水。所有涉及动物水平的实验程序均按照厦门大学实验动物中心批准的动物规程进行操作。通过pcr、qpcr和蛋白印迹检测rbm24敲除效率。
30.结果：pcr结果显示rbm24敲除小鼠构建成功。qrcr和蛋白印迹显示rbm24的mrna和蛋白在敲除小鼠中显著下调(图2；图3)。
31.1.2rbm24敲除导致小鼠qt间期延长。
32.方法：小鼠吸入5％异氟醚麻醉，以2％异氟醚维持。使用小型动物生理监测系统75-1500(哈佛仪器)对小鼠进行心电检测。然后，使用hem v4.2软件(法国，croissy sur seine,notocord systems)对数据进行数字化分析。
33.结果：统计结果如图4所示，连续监测心电，在开始注射tmxf后出现qt间期延长的表型。
34.1.3rbm24调控camkⅱδ的可变剪切。
35.方法：多聚甲醛麻醉rbm24敲除小鼠和对照小鼠，剪开胸腔暴露心脏，剪断下腔静脉，用装满pbs的10ml注射器插入左心室灌流，待流出的液体呈无色时剪下心脏。用trizol(invitrogen)提取总rna，然后用superscript ii逆转录酶(invitrogen)合成cdna。采用camkⅱδ特异性引物进行pcr,pcr循环为25-30个循环。pcr产物经高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析。
36.结果：如图5所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示rbm24敲除小鼠心脏的camkⅱδ变体表达发生变化，δ-c变体增多，δ-b变体减少，说明rbm24调控了其可变剪切。
37.1.4rbm24敲除延长心肌细胞动作电位时程。
38.方法：注射tmxf后，分离rbm24敲除小鼠的心肌细胞，利用膜片钳技术记录分离出的单个心肌细胞的动作电位。将心肌细胞置于含有137mm nacl、5.4mm kcl、1.8mm cacl2、1mm mgcl2、0.33mm nah2po4、10mm hepes和10mm葡萄糖的溶液中(naoh调ph至7.4)，在全细胞模式下记录跨膜电位。所有信号均在1khz(digidata1322a,axon instruments 700b)下采集，并使用pclamp version 10.5软件(axon instruments)进行分析。电极中加入含有9mm nacl、123mm葡萄糖酸钾、1.8mm mgcl2、0.9mm egta、14mm磷酸肌酸、4mm mg-atp、9mm hepes的细胞内液(koh调ph到7.2)。对于电刺激心肌细胞，采用持续时间为2ms、振幅为0.6-0.8na的去极化脉冲，通过电极向细胞内注入电流。
39.结果：如图6和图7所示，rbm24敲除后单个心肌细胞的动作电位时程增加。
40.1.5抑制camkⅱδ逆转rbm24敲除导致的qt间期延长。
41.方法：注射tmxf后，给rbm24敲除小鼠腹腔注射camkiiδ的抑制剂kn-93(medchemexpress)，浓度为5mg/kg*d。以100mg/kg*d的美托洛尔(sigma,m5391)和生理盐水(0.9％nacl)为对照，并检测小鼠心电变化、统计qt间期时程。
42.结果：如图8所示，kn-93逆转了rbm24敲除导致的qt间期延长。这在一定程度上说明rbm24是通过调控camkiiδ最终导致qt间期延长。
43.实施例2.利用人胚胎干细胞来源的心肌细胞分析rbm24在lqt中的临床价值
44.2.1培养人胚胎干细胞并将其分化为心肌细胞。
45.方法：将人胚胎干细胞系h9用含有青霉素(50u ml-1)和链霉素(50μg ml-1)的培养基essential 8(e8,wicell配方)(life technologies)在37℃/5％co2的孵育箱中培养。每日更换培养基，并在显微镜下观察hesc的形态。使用含b27的dmem/f12(life technologies)诱导细胞分化。分化第一天加入chir99021(6μm,stemcell technologies)，维持48h。分化第四天加入iwr-1(5μm,stemcell technologies)，维持48h。之后将培养基更换为包含b27与胰岛素(life technologies)、谷酰胺(2mm)、青霉素(50u ml-1)和链霉素(50μg ml-1)的dmem/f12。
46.结果：在hesc心肌分化第18天，我们进行actn2(z-disc蛋白)染色验证了人胚胎干细胞分化成心肌细胞，如图9所示。
47.2.2rbm24敲低后心肌细胞动作电位时程增加。
48.方法：将hes来源的单个心肌细胞用accumax消化15分钟，并铺在基质胶包被的玻璃盖玻片上。然后用表达靶向人rbm24基因shrna的慢病毒(hanbio biotechnology)感染心肌细胞，以嘌呤霉素筛选非靶向病毒颗粒作为对照，获得对照组和rbm24敲除组的细胞。将心肌细胞置于含有140mm nacl、5mm kcl、2mm cacl2、1mm mgcl2、10mm hepes和5mm葡萄糖的溶液中，在全细胞模式下记录跨膜电位。所有信号均在1khz(digidata 1322a,axon instruments700b)下采集，并使用pclamp version 10.5软件(axon instruments)进行分析。电极中加入含有10mm nacl、130mm天冬氨酸钾、0.04mm cacl2、3mm mg-atp、10mm hepes和200mg/ml两性霉素b(sigma aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)的细胞内液。对于电刺激心肌细胞，采用持续时间为2ms、振幅为0.6-0.8na的去极化脉冲，通过电极向细胞内注入
电流。
49.结果：如图10所示，病毒感染的人胚胎干细胞来源的心肌细胞rbm24敲低效率明显。电生理检测心肌细胞动作电位结果如图11、12所示，证明rbm24敲低后心肌细胞动作电位时程增加，rbm24在人心肌细胞中也具有重要的调控作用。