delivered in lipid particles." journal of pharmacology and experimental therapeutics 298.3 (2001): 1185-1192; hanagata, nobutaka. "cpg oligodeoxynucleotide nanomedicines for the prophylaxis or treatment of cancers, infectious diseases, and allergies." international journal of nanomedicine 12 (2017): 515)。这些主要经由tlr9-依赖性途径发挥作用。
7.含有cpg基序的dna也被用作疫苗佐剂，以改进专门抗原呈递细胞的功能并加强体液和细胞疫苗特异性免疫应答的生成(参见，例如，bode, christian, 等人 "cpg dna as a vaccine adjuvant." expert review of vaccines 10.4 (2011): 499-511)。
8.然而，cpg-介导的tlr9激活有时可能特别不期望，至少如果它是主要的或唯一被刺激的促炎免疫应答的话。例如，tlr9激活已经与肺部炎症相关(schwartz, davida. 等人"cpg motifs in bacterial dna cause inflammation in the lower respiratory tract." the journal of clinical investigation 100.1 (1997): 68-73; knuefermann, pascal, 等人 "cpg oligonucleotide activates toll-like receptor 9 and causes lung inflammation in vivo." respiratory research 8.1 (2007): 72; ito, toshihiro, 等人 "toll-like receptor 9 activation is a key mechanism for the maintenance of chronic lung inflammation." american journal of respiratory and critical care medicine 180.12 (2009): 1227-1238)。因此，除了经典的tlr-介导的应答(诸如i型干扰素免疫应答途径)之外，还期望激活额外或替代的炎症途径，以诱导有效的免疫应答。i型干扰素免疫应答途径的激活可能特别有利，不仅用于刺激宿主的免疫系统来防御病原体，而且还例如用于肿瘤疗法(参见jablonska, jadwiga, 等人 "neutrophils responsive to endogenous ifn-β regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model." the journal of clinical investigation 120.4 (2010): 1151-1164)。
9.在其他情况下也期望避免或抑制cpg-诱导的tlr9-介导的炎性应答。例如，在非病毒基因疗法中，由非病毒载体或编码期望的基因疗法产品的核酸引发的tlr9-介导的炎性应答是需要避免的已知问题(zhao, hongmei等人"contribution of toll-like receptor 9 signaling to the acute inflammatory response to nonviral vectors." molecular therapy 9.2 (2004): 241-248.; makiya nishikawa和yoshinobu takakura. "development of safe and effective nonviral gene therapy by eliminating cpg motifs from plasmid dna vector." front biosci 4 (2012): 133-41.)。此类炎性应答可能影响非病毒基因疗法的安全性和有效性，并且在一些情况下，这种应答消除转基因表达细胞。为此，减少构建体中cpg基序的数量已被用于增加基于核酸的基因疗法的功效。总之，在基因疗法或其他情况下，需要避免tlr-介导的免疫应答。
10.综上所述，鉴于上述情况，除了或代替经典刺激的tlr-介导的途径，特别是tlr9-介导的途径，需要激活其他免疫应答途径、特别是i型干扰素途径的改进的核酸制剂。在基因疗法的背景下，特别需要减少或甚至绕过tlr-介导的应答。
11.发明概述针对上述背景，本发明的一个目的是提供免疫刺激性组合物，其与本领域中已知的组合物相比更有效地诱导细胞炎性应答和/或诱导有利地改变的炎性应答。具体而言，本
发明的一个目的是提供免疫刺激性组合物，除了或代替tlr-介导的免疫应答，所述免疫刺激性组合物(还或主要)激活i型干扰素途径。本发明的另一个目的是提供免疫刺激性组合物，其可以以经济的方式生产并且其组分在化学上明确定义。本发明的又一个进一步目的是提供简单且经济的产生此类组合物的方法。本发明的另一个目的是提供免疫刺激性组合物，其有效地预防或治疗受试者中的感染性疾病。一个进一步目的是提供可用作疫苗佐剂的免疫刺激性组合物。
12.这些目的中的一些或全部通过根据权利要求1的免疫刺激性组合物、根据权利要求11的制备免疫刺激性组合物的方法以及根据权利要求12和13的用途实现。
13.本发明提供了包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物，其中所述复合物含有
‑ꢀ
脂质体，就其脂质而言，其包含第一脂质和第二脂质或由其组成，其中所述第一脂质是两性离子脂质且所述第二脂质是阳离子脂质；和
‑ꢀ
一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种多核苷酸。
14.发明人已经令人惊讶地发现包含两性离子脂质、特别是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)作为脂质体中的两种必需脂质组分之一的脂质体-核酸复合物、特别是脂质体-寡核苷酸复合物在激活细胞i型干扰素免疫应答途径方面特别有效且有选择性。对该观察结果的进一步研究已经揭示了作为本发明基础的可能作用机制。不受任何特定科学理论的束缚，两性离子脂质可能具有特殊的核内体裂解和促融合特性，这可能有助于这种效果。在通常吸收脂质体-核酸复合物的核内体中，通常发生tlr激活。经由在脂质体中使用两性离子脂质的本发明似乎使得免疫刺激性核酸可能一旦被递送至靶细胞就快速从细胞核内体逃逸至胞质溶胶中。因此，该机制有助于增加免疫刺激性核酸的胞质溶胶浓度。胞质溶胶核酸能够激活irf-依赖性途径，且因此激活i型干扰素免疫应答途径。当免疫刺激性寡核苷酸用作本发明的脂质体-核酸复合物中的核酸时，尤其观察到irf-依赖性途径的更显著激活的这种效果。这是令人惊讶的，因为先前没有描述过脂质类型和核酸类型之间的相互依赖关系。
15.脂质体-核酸复合物的脂质体中的第二种必需脂质组分是阳离子脂质。它与两性离子脂质的组合使用具有两个主要优点。一方面，发现阳离子脂质促进脂质体的脂质双层和带负电荷的免疫刺激性核酸之间的相互作用，允许在脂质体-核酸复合物中富集免疫刺激性核酸。另一方面，所述阳离子脂质还通过为脂质体提供净正电荷发挥功能，这进而促进脂质体-核酸复合物与阴离子细胞表面分子更有效的结合，且因此促进细胞对脂质体-核酸复合物的摄取。
16.本发明还提供了制备本发明的免疫刺激性组合物的方法，其包括以下步骤：a. 提供脂质体并将所述脂质体与一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸混合以形成脂质体-核酸复合物；或b. 在脂质体形成之前或期间使脂质与所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物。
17.以这种方式，可以有效且以稳健的方式获得免疫刺激性组合物。
18.当使用免疫刺激性寡核苷酸作为核酸时，本发明提供了特别有利的结果和令人惊讶的效果。当在免疫刺激性组合物中使用寡核苷酸代替多核苷酸(例如质粒)时，本发明允
许用更好表征的试剂进行更经济和更清洁的生产，同时在免疫刺激方面实现令人惊讶地相似的结果。免疫刺激性寡核苷酸可以通过成本有效的体外合成进行生产，而质粒通常需要生物技术生产手段，诸如在细菌细胞中繁殖，这本身导致更复杂、化学上不太明确定义的产品。因此，在体外合成免疫刺激性寡核苷酸的能力具有使用更明确定义和经济的化学产品来生产本发明的免疫刺激性组合物的优点。
19.尽管下文主要在脂质体-寡核苷酸复合物的背景下描述了本发明的免疫刺激性组合物和方法，但描述的这些部分类似地适用于包含脂质体-多核苷酸复合物的对应实施方案。
20.本发明还涉及包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中的两性离子脂质用于诱导i型干扰素免疫应答和/或减少或绕过tlr-介导的免疫应答的用途。这些效果不仅在治疗或预防性医学免疫刺激应用中特别有用，而且在基因疗法的背景下也特别有用，因为可以减少或甚至避免不需要的针对编码期望的基因疗法产物的核酸的免疫应答。
21.最后，本发明还涉及本发明的免疫刺激性组合物在刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法中的用途，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于受试者的步骤。
22.说明性实施方案的详细描述为清楚起见，本文在单独实施方案的上下文中描述的根据本发明的免疫刺激性组合物、方法和用途的特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的根据本发明的免疫刺激性组合物、方法和用途的各种特征也可以任何子组合提供。类似地，结合本发明的免疫刺激性组合物描述的特征或实施方案同样适用于本发明的方法和用途，且反之亦然。如本文所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”意欲也包括复数形式，即，在“一个/种或多个/种”的意义上，除非上下文另有清楚地指明。
23.免疫刺激性组合物本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体-核酸复合物。所述脂质体-核酸复合物含有脂质体和作为核酸的一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸。优选地，所述脂质体-核酸复合物含有脂质体和一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。
24.如本文所用的“免疫刺激性组合物”是指能够激活免疫应答途径、特别是能够在体内刺激脊椎动物的先天免疫系统的组合物。术语“免疫应答途径”可与术语“炎性应答途径”或“促炎应答途径”互换使用，并且是指促进先天免疫应答的急性发展的细胞内信号传导途径。此类免疫应答途径尤其包括最终诱导促炎细胞因子表达的nf-κb依赖性途径和触发i型干扰素免疫应答途径激活的irf-依赖性途径。
25.所述免疫刺激性组合物尤其意欲用于刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于受试者的步骤。因此，所述免疫刺激性组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体和添加剂。
26.本发明的免疫刺激性组合物还可以包含一种或多种抗原，且因此可用作疫苗制剂，其中所述脂质体-核酸复合物充当佐剂。此外，本发明的免疫刺激性组合物还可以包含一种或多种药物。在该情况下，所述免疫刺激性组合物是药物组合物。
27.脂质体本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体作为脂质体-核酸复合物的一部分。如本文所用的脂质体是人造微观颗粒，其由包围液体核心的一个或多个脂质双层构成，所述液体核心通常是水性液体核心。所述脂质体可以是单层的(特别是大单层囊泡(luv)和/或小单层囊泡(suv))或多层囊泡(mlv)。mlv在每个囊泡中具有多个双层，其形成几个独立的隔室。所有这些类型的脂质体都具有以下共同点：脂质双层包封液体核心。然而，mlv、luv和suv的直径不同。mlv的直径通常为》500 nm。luv的直径通常为》100 nm。suv通常具有约20至100 nm的直径。
28.优选地，所述脂质体是单层囊泡。单层囊泡具有以下优点：它们的直径通常小于多层脂质体。由于它们的大小较小，单层囊泡比多层脂质体更容易被靶细胞内吞。此外，单层囊泡可进行无菌过滤。
29.在本发明的另一个优选实施方案中，所述脂质体是平均直径在约10和约550 nm之间的单层囊泡。优选地，用于形成本发明的脂质体-核酸复合物的脂质体具有约20至约450 nm，甚至更优选约40至约250 nm，还更优选40至220 nm且最优选40至200 nm的平均直径。已发现使用这些大小范围的脂质体是有利的，因为在此类脂质体与免疫刺激性核酸复合后，形成具有适当大小的脂质体-核酸复合物，其可被靶细胞有效地内吞。平均直径低于约《250nm的脂质体-核酸复合物的一个额外优势是此类脂质体-核酸复合物可以无菌过滤。
30.如本文所述的脂质体和脂质体-核酸复合物的平均直径通过动态光散射测定，由此通过累积量的技术分析测量结果并且平均直径被计算为z-平均值(参见下文)。
31.在一个最优选的实施方案中，所述脂质体是“小单层囊泡(suv)”。如果suv用于形成本发明的脂质体-核酸复合物，实验已经显示靶细胞对脂质体-核酸复合物的摄取是特别有效的。
32.本文中与数值相关的术语“约”的使用表明数值可能受到测量误差的影响，所述测量误差通常使数值改变不超过
±
5%。本文公开的数值连同术语“约”也意在如此公开，即没有术语“约”。进一步，如本文所述的数值范围意欲包括和公开该范围内的各个和每个值。本文公开的同一参数的范围的所有上端点和下端点都可与彼此组合。本文公开的不同参数的所有范围都可与彼此组合。具体而言，相同“优先水平”的范围尤其可与彼此相配。
33.脂质体的形成需要存在“囊泡-形成脂质”，其为能够形成或并入双层结构的两亲性脂质。脂质双层包括能够通过自身或当与另一种或多种脂质组合时形成双层的脂质。
34.存在于根据本发明的脂质体中的脂质，即囊泡-形成脂质，包含第一脂质和第二脂质或由第一脂质和第二脂质组成，其中所述第一脂质是两性离子脂质且所述第二脂质是阳离子脂质。
35.两性离子脂质，即本发明的脂质体中含有的第一脂质，在ph为7时含有带正电荷和带负电荷的基团两者，具有总体中性的净电荷。
36.在本发明的一个优选实施方案中，所述两性离子脂质是甘油磷脂，其中两个脂族部分通过酯和/或醚键附接至甘油部分。所述脂族部分可以是饱和的或不饱和的。两个脂族部分可以是相同或不同的烃。优选地，两性离子甘油磷脂的两个脂族部分是相同的。在另一个优选实施方案中，所述脂族部分是含有10-30个、优选12-26个、更优选14-24个且最优选16-22个碳原子的无支链不饱和烃。在一个更优选实施方案中，所述脂族部分是含有10-30
个、优选12-26个、更优选14-24个且最优选16-22个碳原子和单个双键的无支链不饱和烃。在本发明的另一个优选实施方案中，所述两性离子脂质的电荷归因于存在于两性离子脂质中的至少磷酸盐部分和伯胺。上述两性离子脂质的优选实施方案可以与彼此自由组合。已经发现，如果本发明的脂质体-核酸复合物的脂质体含有具有任何上述结构元件的两性离子脂质，则i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
37.在本发明的最优选实施方案中，所述两性离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。实际实验已经显示，在脂质体-核酸复合物的脂质体中一起使用dope与阳离子脂质对诱导i型干扰素免疫应答途径是非常有效的。当免疫刺激性寡核苷酸用作本发明的核酸-脂质体复合物中的核酸时，这些效果对于所使用的两性离子脂质的类型是特别显著和特异性的。
38.在本发明的一个优选实施方案中，所述第一脂质占脂质体的脂质含量的至少40 wt.%，优选至少45 wt.%和最优选至少50 wt.%。已经发现，如果两性离子脂质以这些量存在于本发明的脂质体-核酸复合物中含有的脂质体的脂质双层中，则i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
39.用于阳离子脂质的术语“第二脂质”用于表示第二脂质不同于第一脂质。具体而言，所述第二脂质不包含dope。所述第二脂质是阳离子脂质。术语“阳离子脂质”在本文中被定义为在任何给定ph下具有约1至9、更优选2至8的范围内的阳离子净电荷的脂质。阳离子净电荷优选但不必存在于整个上述ph范围内。在另一个实施方案中，阳离子脂质被定义为至少在7的ph下具有阳离子净电荷。
40.如本文所用的“脂质”优选意指分子量小于3000 da、更优选小于2000 da的化合物。
41.在本发明的一个优选实施方案中，所述阳离子脂质选自n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇)和其他阳离子胆固醇衍生物、n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙-l-铵(n-(4-carboxybenzyl)-n,n-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, dobaq)和1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉氯化物(dotim)。
[0042]
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述第一脂质是dope，且所述第二脂质是dotma，或所述第一脂质是dope，且所述第二脂质是dotap。作为本发明基础的研究已经表明，在免疫刺激性组合物中使用具有这两种脂质组合的脂质体在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的。
[0043]
所述脂质体-核酸复合物中阳离子脂质与免疫刺激性核酸的电荷比优选为2:1，更优选为3:1，且最优选为3.5:1。脂质体-核酸复合物的电荷比可以通过确定复合物中存在的阳离子脂质和免疫刺激性核酸的量来评价。基于确定的量，可以计算电荷比。对于该计算，假定核酸净电荷主要源自核酸骨架中带负电荷的磷酸根和/或硫代磷酸根基团。如果这些电荷比存在于脂质体-核酸复合物中，则获得特别可再现且稳定的复合物。此外，观察到特别好的负载能力。
[0044]
如本文所用的术语“负载能力”是指脂质体粘附和/或封装所有免疫刺激性核酸的
能力。
[0045]
免疫刺激性寡核苷酸本发明的免疫刺激性组合物优选包含一种或多种免疫刺激性寡核苷酸作为核酸组分。如本文所用的术语“一种或多种”意指化学上不同的寡核苷酸可以与脂质体复合以形成免疫刺激性组合物的脂质体-寡核苷酸复合物。例如，可以使用不同碱基序列或糖磷酸酯骨架不同的寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明的核酸-脂质体复合物的核酸组分由免疫刺激性寡核苷酸组成。
[0046]
如本文所用的“免疫刺激性寡核苷酸”是通过被脊椎动物的先天免疫系统检测为外来物并由此激活先天免疫应答途径而在脊椎动物中引发免疫应答的寡核苷酸。
[0047]
通常，根据本发明使用的免疫刺激性寡核苷酸是合成来源的。因此，它们可以合成为具有任何期望的序列和/或在糖磷酸酯骨架中具有修饰。此外，本发明的免疫刺激性组合物中使用的免疫刺激性寡核苷酸在7的ph下具有净负电荷，且因此代表聚阴离子。令人惊讶地，所有测试的免疫刺激性寡核苷酸在与根据本发明的脂质体复合后能够诱导i型干扰素免疫应答，而与其核苷酸序列无关。因此假定技术效果是不依赖于序列的，最低要求是本发明的免疫刺激性寡核苷酸的聚阴离子性质。
[0048]
所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是线性的，至少部分是单链dna分子。然而，单链dna免疫刺激性寡核苷酸可以尤其通过watson-crick碱基配对与自身或彼此相互作用，以形成二级结构和附聚物。然而，单链延伸段将始终存在于所述免疫刺激性寡核苷酸中。在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是cpg寡脱氧核苷酸(或cpg odn)。这些是短的单链合成dna分子，其含有三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(“c”)和随后的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(“g”)。“p”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯连接，尽管根据本发明的odn可以反而具有修饰的硫代磷酸酯骨架。如引言中所解释，cpg基序据信被先天免疫系统的tlr9模式识别受体识别为pamp。
[0049]
在一个进一步优选的实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸选自a-类、b-类和c-类免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸分类为“a-类”、“b-类”和“c-类”是技术人员众所周知的，并且描述于例如vollmer, j
ö
rg. "cpg motifs to modulate innate and adaptive immune responses." international reviews of immunology 25.3-4 (2006): 125-134。
[0050]
a-类免疫刺激性寡核苷酸的典型特征是含有中央磷酸二酯cpg的回文基序和部分硫代磷酸酯修饰的骨架，特别是硫代磷酸酯3'多聚-g延伸段。
[0051]
b-类免疫刺激性寡核苷酸的典型特征是具有一个或多个cpg二核苷酸的完整硫代磷酸酯骨架。
[0052]
c-类免疫刺激性寡核苷酸表现出a类和b类免疫刺激性寡核苷酸的特性。它们含有完整的硫代磷酸酯骨架和一个或多个含回文cpg的基序。
[0053]
根据本发明的免疫刺激性寡核苷酸通常具有14至500个核苷酸、优选14至400个核苷酸、更优选14至300个核苷酸、还更优选14至200个核苷酸、甚至更优选16至40个核苷酸且最优选18至30个核苷酸的长度。这种大小的免疫刺激性寡核苷酸可以容易地在体外合成，并且被发现有效地激活i型干扰素免疫应答途径。
[0054]
在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自b-类
和c-类免疫刺激性寡核苷酸。作为本发明基础的研究表明，用本发明的免疫刺激性组合物中的b-类和c-类免疫刺激性寡核苷酸，i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
[0055]
在本发明的免疫刺激性组合物的另一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸与seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3或seq id no. 4具有至少75%序列同一性、更优选至少80%序列同一性、甚至更优选85%序列同一性、还更优选90%、95%或97%序列同一性。
[0056]
在本发明的免疫刺激性组合物的一个更优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸与seq id no. 1或seq id no. 2具有至少75%序列同一性、更优选至少80%序列同一性、甚至更优选85%序列同一性、还更优选90%、95%或97%序列同一性。
[0057]
如本文所用，“百分比序列同一性”和类似术语用于描述两个或更多个核酸之间的序列关系，并且在如下术语的上下文中并与如下术语结合理解，所述术语包括：a)参考序列，b)比较窗口，c)序列同一性和d)序列同一性的百分比。
[0058]
a)
ꢀ“
参考序列”是定义的序列，其用作序列比较的基础。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，全长cdna或基因序列的区段，或完整的cdna或基因序列。在本情况下，参考序列是seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3或seq id no. 4。
[0059]
b)
ꢀ“
比较窗口”包括对多核苷酸序列的连续和指定区段的提及，其中可以将多核苷酸序列与参考序列进行比较，并且与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加、取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。本领域技术人员理解，为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而导致的与参考序列的误导性高相似性，通常引入缺口罚分并从匹配数中减去。
[0060]
c) 用于比较的序列比对方法是本领域中众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过smith和waterman, adv.appl.math., 2: 482, 1981的局部同源性算法；通过needleman和wunsch, j.mol.biol., 48: 443, 1970的同源性比对算法；通过pearson和lipman, proc.natl.acad.sci.usa, 8: 2444, 1988的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化执行来进行，所述计算机化执行包括但不限于：intelligenetics, mountainview, calif.的pc/gene程序中的clustal，wisconsin genetics software package,genetics computer group (gcg), 7 science dr., madison, wis., usa中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta；clustal程序由higgins 和sharp, gene, 73: 237-244,1988; corpet, 等人, nucleic acids research, 16:881-90, 1988; huang, 等人,computer applications in the biosciences, 8:1-6, 1992; 和pearson, 等人,methods in molecular biology, 24:7-331, 1994充分描述。可以用于数据库相似性搜索的blast程序家族包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的blastn；用于针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的blastx；用于针对核苷酸数据库序列的蛋白查询序列的tblastn；和用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的tblastx。参见，current protocols in molecular biology, 第19章, ausubel, 等人编, greene publishing and wiley-interscience, new york, 1995。上述程序的新版本或新程序一起无疑将在将来可用，并且可以与本公开一起使用。
[0061]
d)
ꢀ“
百分比同一性”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分
可以包含添加、取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。百分比通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
[0062]
在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自：seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4。实验研究已经显示，在本发明的免疫刺激性组合物中使用编码seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4的免疫刺激性寡核苷酸在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的。seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4的免疫刺激性寡核苷酸与本发明的脂质体的复合将所述免疫刺激性寡核苷酸从有效的tlr-激动剂转化为i型干扰素免疫应答途径的有效激动剂。不受任何特定科学理论的约束，据信这种作用是由于根据本发明的脂质体的脂质组成，特别是两性离子脂质的存在。这令人惊讶地似乎导致所述免疫刺激性寡核苷酸在细胞内有效地从核内体释放至靶细胞的胞质溶胶中。
[0063]
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是seq id no.1和/或seq id no.2的寡核苷酸。本发明的包含编码seq id no.1和seq id no.2的免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性组合物在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的，而同时绕过tlr9-介导的免疫应答。
[0064]
在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸在糖-磷酸酯骨架中包含硫代磷酸酯，即部分硫代磷酸酯修饰的骨架。在另一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含完全硫代磷酸酯骨架。硫代磷酸酯修饰具有以下优点：所述免疫刺激性寡核苷酸不仅通过它们与本发明的脂质体的复合来保护免于被细胞外核酸酶降解，而且还通过它们修饰的化学性质来保护。一旦所述免疫刺激性寡核苷酸被吸收至靶细胞中，所述硫代磷酸酯修饰还保护所述免疫刺激性寡核苷酸免于细胞内核酸酶降解。作为结果，这些免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性增加。
[0065]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物不含或基本上不含质粒dna。“基本上不含”质粒dna意指所述免疫刺激性组合物的总dna含量的小于1 wt%、优选小于0.5 wt%和最优选小于0.01 wt%是质粒dna。通过使用基本上不含质粒或不含质粒的免疫刺激性组合物，确保本发明的免疫刺激性组合物仅包含化学充分定义的组分。此外，通过避免在免疫刺激性组合物中使用质粒，本发明的免疫刺激性组合物的生产成本和复杂性降低。
[0066]
免疫刺激性多核苷酸本发明的免疫刺激性组合物可以包含一种或多种免疫刺激多核苷酸。也可能的是，本发明的免疫刺激性组合物包含一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和一种或多种免疫刺激多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的核酸-脂质体复合物的核酸组分由免疫刺激性多核苷酸组成。
[0067]
所述一种或多种免疫刺激性多核苷酸可以是单链或双链dna分子。所述免疫刺激性多核苷酸可以是环状或线性的。在一个实施方案中，所述免疫刺激性多核苷酸是质粒dna。
[0068]
本发明的免疫刺激性多核苷酸至少在它们的长度上不同于本发明的免疫刺激性寡核苷酸。本发明的免疫刺激性多核苷酸具有至少31个核苷酸、优选至少41个核苷酸、更优
选至少201个核苷酸、还更优选至少301个核苷酸、甚至更优选至少401个核苷酸且最优选至少501个核苷酸的长度。
[0069]
实验已经显示，以本发明的脂质体-多核苷酸复合物的形式配制的多核苷酸可以特别有效地激活i型干扰素免疫应答途径。
[0070]
脂质体-核酸复合物本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体-核酸复合物。尽管这些在本文中基于单一复合物定义，但当然应理解，在实践中，本发明的免疫刺激性组合物将包含多种脂质体-核酸复合物。它们可以具有相同或不同的组成。然而，平均而言，本文对于单个脂质体-核酸复合物及其组分描述的特征适用于所述免疫刺激性组合物中的所有脂质体-核酸复合物。优选地，所述脂质体-核酸复合物是脂质体-寡核苷酸复合物。
[0071]
在本发明的一个优选实施方案中，所述脂质体-核酸复合物至少平均具有20至600 nm、优选40至500 nm、甚至更优选60至300 nm、还更优选60至250 nm且最优选60至220 nm的直径。已经发现使用这种大小范围的复合物是有利的，因为这些大小范围的复合物可以被靶细胞有效地内吞。平均直径低于约《250 nm的脂质体-核酸复合物的一个额外的优点是它们可以无菌过滤。
[0072]
技术人员知道确定脂质体和脂质体-核酸复合物的平均直径的合适方法。本文所述的平均直径是通过动态光散射(dls)在173
°
的固定角度(反向散射模式)用例如horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)测量的z-平均粒径。当通过累积量技术分析动态光散射数据时，可以计算脂质体或脂质体-核酸复合物的整体集合的z-平均值。通过dls测量的平移扩散系数可以基于stokes-einstein关系转换为z-平均粒径。z-平均大小是强度加权调和平均大小(iso 22412:2017)。
[0073]
如本文所用的术语“脂质体-核酸复合物”可以意指所述免疫刺激性核酸被包封在脂质体中和/或它们仅附接至脂质体的表面。核酸与脂质体的复合，即它们与脂质体的附接和/或包封在脂质体中具有保护核酸免于核酸酶降解的优点。在本发明的免疫刺激性组合物的优选实施方案中，所述脂质体-核酸复合物的免疫刺激性核酸至少被基本上包封在脂质体中。如本文所用的“基本上包封”意指所述组合物中存在的免疫刺激性核酸中的至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%且还更优选至少70%、80%、90%、95%或99%被脂质体包封。当包封在脂质体中时，所述免疫刺激性核酸被特别有效地保护免于降解，特别是免于核酸酶降解。由于根据本发明的脂质体的特殊脂质组成，特别是由于两性离子脂质假定的核内体裂解和促融合特性，所述免疫刺激性核酸即使被包封也可以非常有效地发挥其免疫刺激作用，且因此不能直接接近免疫系统。因此，本发明提供了将免疫刺激性核酸的有效保护与稳健的免疫刺激作用组合的优势。
[0074]
技术人员知道如何确定核酸包封度。这可以例如经由核酸酶保护测定来完成。在此，取确定的、相同大小的组合物等分试样。从第一个等分试样中，其中存在的核酸总量通过核酸提取和后续的核酸量测定来确定。对于第二个等分试样，将脂质体-核酸复合物与能够在允许可接近核酸降解的条件下降解核酸的核酸酶孵育。随后，洗涤脂质体并使核酸酶失活。例如，这可通过蛋白酶k处理来实现。从核酸酶处理的脂质体中提取剩余的核酸后，可以分析在核酸酶处理后保留下来的核酸的数量和完整性，例如，通过琼脂糖凝胶电泳。因此，可以通过将受保护的核酸量与核酸总量进行比较来确定包封度。
[0075]
已经证明本发明的脂质体-核酸复合物特别稳定。在一个实施方案中，所述脂质体-核酸复合物可以在液相中储存至少一个月、优选至少三个月且最优选至少六个月，而不会失去它们在本文实施例中描述的细胞培养测定中的免疫刺激作用和/或不改变它们的特性，诸如z-平均值、多分散性和ζ电位。
[0076]
脂质体的多分散性和ζ电位可以通过技术人员已知的方法来确定。确定多分散性的最优选方法是用例如horiba nanopartica sz-100(horiba, ltd.)以173
°
(反向散射模式)的固定角度测量动态光散射(dls)并从由dls-测量的强度自相关函数的累积量分析计算的多分散指数推导多分散性。假设单一粒径模式，单指数拟合应用于自相关函数，并且多分散性描述假设高斯分布的宽度。通常，该参数是无量纲且按比例缩放的，使得值范围为0.05至0.7，其中小值指示单分散大小分布(“iso 22412:2017
ꢀ‑ꢀ
粒径分析
ꢀ‑ꢀ
动态光散射(dls)”日期不详(n.d.))。测定ζ电位的优选方法是经由使用例如horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)的电泳光散射。从已知的施加电场和测量的颗粒速度，可以确定颗粒迁移率。然后通过smoluchowski模型(“iso 13099-2:2012-胶体系统-ζ-电位测定方法-部分2：光学方法”日期不详.)从迁移率计算ζ电位。
[0077]
技术人员知道对于免疫刺激性组合物，将浓度和剂量调整到低于给定阈值是避免细胞毒性的关键。所述阈值需要在用来自期望治疗组的样品受试者的剂量递增研究中确定。可以评价细胞毒性，例如，经由采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)的测定法。mtt测定法是一种用于评价细胞代谢活性的比色测定，所述细胞代谢活性据信与细胞活力成正比例相关。根据本发明，所述免疫刺激性组合物中的脂质体-核酸复合物的浓度是非细胞毒性的。该上下文中的“非细胞毒性的”意指细胞毒性低于细胞毒性测量方法(例如mtt测定法)的已知或确定阈值。如本文所用的“细胞毒性”是指异常的细胞状态，诸如不能茁壮成长、生长迟缓、不规则的微观外观和/或免疫应答性下降。在一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物中的脂质体-核酸复合物的浓度为约0.1至约250 ng/ml、优选约0.1至约200 ng/ml且更优选约0.1至约150 ng/ml。在所述免疫刺激性组合物的另一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物的浓度为约10至约250 ng/ml、约50至约250 ng/ml或约100至约250 ng/ml。
[0078]
方法本发明还提供了用于制备上述免疫刺激性组合物的方法。所述方法包括以下步骤：a. 提供脂质体并使所述脂质体与一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物；或b. 在脂质体形成之前或期间使脂质与所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物。
[0079]
步骤a.中使用的脂质体的脂质组分和步骤b.中使用的脂质包含如上所定义的第一和第二脂质或由其组成。
[0080]
步骤a.和b.彼此不同在于所述脂质体在与一种或多种免疫刺激性核酸接触之前预先形成(步骤a.)或所述脂质体形成在一种或多种免疫刺激性核酸存在的情况下发生(步骤b.)。通过经由步骤b.制备脂质体-核酸复合物，可以实现所述免疫刺激性核酸的特别高的包封效率。
[0081]
用于脂质体形成的技术是本领域中众所周知的。例如，ian maclachlan在“antisense drug technology”, crc press, 第2版, 2007中关于“liposomal formulations for nucleic acid delivery”的章节提供了良好的概览。为了实施本发明，当经由薄膜水合、随后挤出方法形成脂质体时，得到特别好的结果(参见，例如，zhang, hongwei. "thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation." liposomes. humana press, new york, ny, 2017. 17-22; jahn, andreas, 等人 "controlled vesicle self-assembly in microfluidic channels with hydrodynamic focusing." journal of the american chemical society 126.9 (2004): 2674-2675; deamer, david w. "preparation and properties of ether
‐
injection liposomes." annals of the new york academy of sciences 308.1 (1978): 250-258; vladisavljevi
ć
, goran t., 等人 "production of liposomes using microengineered membrane and co-flow microfluidic device." colloids and surfaces a: physicochemical and engineering aspects 458 (2014): 168-177; kastner, elisabeth, 等人 "high-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization." international journal of pharmaceutics 477.1-2 (2014): 361-368)。
[0082]
在本发明的一个优选实施方案中，步骤a.中提供或步骤b.中形成的脂质体具有对于上述本发明的组合物中的脂质体描述的一种或多种特征。这尤其适用于它们的层状类型、大小、包封度和电荷比。
[0083]
为了产生能够诱导先天免疫系统的应答的脂质体-核酸复合物，需要向步骤a.中提供的脂质体中或在步骤b.中的脂质体形成之前或期间添加适量的免疫刺激性核酸。在一个优选的实施方案中，步骤a中或本发明的组合物和复合物中免疫刺激性核酸与脂质体的比率为0.1至5 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体，优选0.1至3 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体，且更优选0.1至1.5 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体。
[0084]
两性离子脂质的用途本发明进一步涉及包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中的两性离子脂质、特别是dope诱导i型干扰素免疫应答的用途。在导致本发明的研究中，发现在脂质体-核酸复合物的脂质体中使用两性离子脂质可有效地激活细胞i型干扰素免疫应答途径。这是令人惊讶的，因为通常，通过脂质体递送的核酸激活tlr-依赖性途径，而不激活细胞溶质i型干扰素免疫应答途径。
[0085]
似乎在伴随或包封核酸的脂质体中存在两性离子脂质、特别是dope，改变它们的免疫原性，并将引发的免疫应答转向i型干扰素免疫应答途径的激活。两性离子脂质似乎具有特殊的促融合特性，其可通过与靶细胞膜融合促进复合核酸的细胞内递送。此类膜融合可以发生在核酸递送过程的多个不同阶段，诸如在质膜、核内体膜和/或核膜。通过使得能够与核内体膜融合，两性离子脂质似乎使得本发明的脂质体-核酸复合物的核酸可能从核内体逃逸至靶细胞的胞质溶胶中。这种效果的发生及其在通过激活i型干扰素免疫应答途径改变引发的免疫应答中的效用或这种改变在预期免疫刺激应用方面的益处均未被预期或不是可预测的。
[0086]
在本文所述的用途的一个优选实施方案中，所述两性离子脂质具有对于上述本发明的脂质体中含有的第一脂质定义的特征中的一种或多种。
[0087]
技术人员知道用于测试免疫刺激性组合物是否激活i型干扰素免疫应答途径的合适的体外细胞培养测定法。一种特别合适的方式是使用由invivogen提供的j774-dual
tm
报告细胞系(参见下文的实施例)。j774-dual
tm
细胞在irf-依赖性途径的控制下表达lucia荧光素酶基因，其最终触发i型干扰素免疫应答途径。在激活后，荧光素酶被转录并分泌至细胞培养上清液中。可以定量表达的荧光素酶的量。
[0088]
已发现本发明的免疫刺激性组合物诱导i型干扰素免疫应答。这可能发生在tlr-介导的免疫应答之外。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性组合物除了诱导i型干扰素免疫应答外，还可以减少或甚至绕过tlr-介导的免疫应答。
[0089]
因此，在包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中使用两性离子脂质来诱导i型干扰素免疫应答可能在靶细胞中同时诱导tlr-介导的免疫应答或导致这些减少或根本没有发生。
[0090]
不受任何特定科学理论的束缚，据信两性离子脂质的使用也对tlr-介导的免疫应答具有影响，因为特别是tlr9激活发生在核内体中。两性离子脂质似乎促进本发明的核酸逃逸至胞质溶胶中。这可能是对使用两性离子脂质可能减少或甚至绕过tlr激活的令人惊讶的发现的解释。
[0091]
技术人员知道用于测试免疫刺激性组合物是否激活细胞tlr-介导的免疫应答途径的合适的体外细胞培养测定法。这再次可以通过使用由invivogen提供的j774-dual
tm
报告细胞系来完成，其允许同时评价tlr-介导的免疫应答途径和irf-依赖性途径。为了使得能够评价tlr-介导的免疫应答途径，j774-dual
tm
细胞在tlr激活后诱导的nf-κb途径的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)。seap被分泌至细胞培养上清液中。可以容易地定量表达的seap的量。
[0092]
医疗用途本文所述的免疫刺激性组合物适用于基因疗法、刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于所述受试者的步骤。所述方法包括向受试者施用有效量的免疫刺激性组合物以引发免疫应答。还预期可以使用多于一次的免疫刺激性组合物施用来延长或增强免疫刺激作用。
[0093]
在使用本文所述的免疫刺激性组合物用于基因疗法、特别是用多核苷酸作为脂质体-核酸复合物的核酸组分后，可以减少或甚至绕过通常由用作基因疗法构建体的核酸诱导的不需要的tlr-介导的免疫应答。
[0094]
据信，刺激受试者的免疫系统将使其更好地自行战胜感染性疾病和入侵的病原体。在本发明的上下文中似乎特别相关的感染性疾病是由细菌引起的感染性疾病。据信，本发明的组合物和方法可有助于减少牲畜和肉类生产中所需的抗生素的量。
[0095]
当在至少一种药剂、诸如药物或疫苗之前施用于受试者、与这种药剂共同施用或在这种药剂施用之后施用时，本发明的免疫刺激性组合物还可以用于增强这种药剂的作用。当与一种或多种不同抗原共同施用时，本发明的免疫刺激性组合物可用作接种疫苗中的佐剂。或者，当与一种或多种不同药物共同施用时，本发明的免疫刺激性组合物也是药物
组合物。在这种情况下，药物分子还与脂质体-核酸复合物的脂质体复合，即附着至和/或包封至脂质体中。这具有以下优点：药物的消除半衰期得到增强，且同时药物穿过生物屏障的递送得到增强。
[0096]
此外，脂质体-核酸复合物，特别是当与药物共同施用时，可以在其表面上进一步修饰，例如通过用聚乙二醇进行聚合物包被以增加复合物的循环半衰期，特别是在全身递送后。此外，细胞摄取本发明的脂质体-核酸复合物的特异性可以通过将例如抗体或肽附接至复合物的表面以用于靶向目的而进一步改进。
[0097]
如本文所用的受试者可特别意指选自哺乳动物物种、水产养殖物种和禽类物种的受试者。所述受试者尤其可以是非人类动物，其可以选自牛、家禽、猪和伴侣动物、诸如狗和猫。
[0098]
可以将有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物施用于受试者。所述有效量足以在受体受试者中引发免疫应答。这种有效量是在受体受试者中引起免疫应答的任何量。测量免疫应答的方法是本领域中众所周知的。此外，技术人员将认识到有效量将取决于年龄重量、感染阶段以及本领域中已知的其他因素。合适的有效量可以范围为每个受试者约0.01 μg至1000 μg。
[0099]
合适的有效量可以范围为每个受试者约0.01 μg至1,000 μg。在一些实施方案中，所述有效量可以范围为约0.01 μg至约10 μg，约0.01 μg至约5 μg，约0.05 μg至约5 μg，约0.1 μg至约5 μg，约0.05 μg至约10 μg，约5 μg至约15 μg，约10 μg至约15 μg，约10 μg至约20 μg，约20 μg至约30 μg，约30 μg至约40 μg，约40 μg至约50 μg，约50 μg至约70 μg，约70 μg至约90 μg，约50 μg至约100 μg，约100 μg至约150 μg，约150 μg至约200 μg，约200 μg至约250 μg，约250 μg至约300 μg，约300 μg至约350 μg，约350 μg至约400 μg，约400 μg至约450 μg，约450 μg至约500 μg，约500 μg至约550 μg，约550 μg至约600 μg，约600 μg至约650 μg，约650 μg至约700 μg，约700 μg至约750 μg，约750 μg至约800 μg，约800 μg至约850 μg，约850 μg至约900 μg，约900 μg至约950 μg，约950 μg至约1000 μg。优选地，在一些实施方案中，所述有效量范围为约0.01 μg至约10 μg。然而，优选地在其他实施方案中，所述有效量范围为约50 μg至约100 μg。并且，优选地在其他实施方案中，所述有效量范围为约40 μg至约70 μg。
[0100]
在一些实施方案中，可以通过向禽类物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物来在禽类物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以在禽类物种的成员中引发免疫应答。例如，用于禽类物种的免疫刺激性组合物的有效量可以是约0.01 μg至约10 μg、约0.05 μg至约5 μg、约0.1 μg至约1.5 μg或约1.0 μg至约10 μg。通过实例的方式，对于禽类物种的受试者而言合适的有效量可以是约0.1 μg、0.2 μg、0.3 μg、0.4 μg、0.5 μg、0.6 μg、0.7 μg、0.8 μg、0.9 μg、1.0 μg、1.2 μg、1.4 μg、1.6 μg、1.8 μg、2.0 μg、2.5 μg、3.0 μg、3.5 μg、4.0 μg、4.5 μg、5.0 μg、5.5 μg、6.0 μg、6.5 μg、7.0 μg、7.5 μg、8.0 μg、8.5 μg、9.0 μg、9.5 μg、10.0 μg、9.5 μg、10.0 μg、10.5 μg、11.0 μg、12 μg、13 μg、14 μg或15 μg。
[0101]
在一些实施方案中，可以通过向牛物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物来在牛物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以引发牛物种的成员中的免疫应答。例如，用于牛物种的免疫刺激性组合物的有效量可以为每只动物约1 μg至约
1000 μg，每只动物约5 μg至约500 μg，每只动物约10 μg至约100 μg，每只动物约10 μg至约50 μg，或每只动物约40 μg至约60 μg。通过实例的方式，对于牛物种的受试者而言合适的有效量可以是约30 μg、35 μg、40 μg、45 μg、50 μg、55 μg、60 μg、65 μg、70 μg、75 μg、80 μg、85 μg、90 μg、95 μg、100 μg、110 μg、120 μg、130 μg、140 μg、150 μg、160 μg、170 μg、180 μg、190 μg、200 μg或直至500 μg或直至1000 μg。
[0102]
本发明的方法在受试者中引发免疫应答，使得保护受试者免于易于引发免疫应答的疾病。如本文所用，短语“保护免于疾病”是指减少疾病的症状；减少疾病的发生；降低疾病的临床或病理严重程度；或减少引起疾病的病原体的脱落。保护受试者可以指本发明的组合物当施用于受试者时预防疾病发生、治愈和/或减轻或减少疾病症状、临床体征、病理学或病因的能力。例如但不限于，牛呼吸系统疾病(brd)的临床体征包括肺损伤、体温升高、抑郁(例如，厌食、对外部刺激的反应性降低、耳朵下垂)、流鼻涕和呼吸特征(例如，呼吸频率、呼吸努力)。可以将本文所述的免疫刺激性组合物施用于怀疑暴露于brd的牛，以预防或降低上述brd临床症状的严重程度。通过进一步实例的方式，但不限于，禽类受试者中马立克氏病的临床症状包括孵化率和禽类存活率降低。可以将本文所述的免疫刺激性组合物施用于怀疑暴露于马立克氏病病毒的禽类受试者以预防或减轻上述马立克氏病临床体征的严重程度。
[0103]
因此，如本文所用的保护受试者免于疾病包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗具有疾病的受试者(治疗性治疗)。具体而言，通过经由诱导有益或保护性免疫应答在受试者中引发免疫应答来实现保护受试者免于疾病，在一些情况下，所述免疫应答可以另外压制、减少、抑制或阻断过度活跃或有害的免疫应答。术语“疾病”是指与受试者的正常健康的任何偏离，并且包括当存在疾病症状的状态，以及已经发生偏离(例如，感染、基因突变、遗传缺陷等)、但症状尚未显现的病况。
[0104]
本发明的方法可用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减轻疾病以及预防由原发性疾病的发生而导致的继发性疾病。
[0105]
各种施用途径可用于施用本发明的免疫刺激性组合物。当然，所选择的特定模式将取决于所选择的特定受试者组、受试者的年龄和一般健康状态、所治疗的特定病况以及治疗和/或预防效力所需的剂量。本发明的方法可以使用产生有效水平的免疫应答而不引起临床上不可接受的副作用的任何施用模式来实施。
[0106]
所述免疫刺激性组合物可以静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、在卵内通过羽囊法(feather follicle method)、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域中已知的其他方法施用。在一个方面，皮下施用所述免疫刺激性组合物。在另一个方面，肌肉内施用所述免疫刺激性组合物。在另一个方面，所述免疫刺激性组合物作为喷雾剂施用。在另一个方面，可以口服施用所述免疫刺激性组合物。
[0107]
由于可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述组合物、产品和方法进行各种改变，因此旨在上述描述和以下给出的实施例中含有的所有内容均应解释为说明性的，而不是在限制的意义上进行解释。
[0108]
序列表本技术含有已经电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述序列表文件创建于2020年4月7日，名为bhc208001.txt，且大小为1017字节。
实施例
[0109]
实施例1：配制脂质体和核酸复合物根据薄膜水合方法、随后为两个后续的挤出循环，配制脂质体。从二元脂质混合物获得膜。
[0110]
将阳离子脂质和另一种脂质从氯仿中的10 mg/ml储备溶液按体积计量加入圆底烧瓶中。添加10 ml氯仿，并将共混物在调节至37℃的水浴中以350 rpm搅拌30分钟(ika rct standard, ika
®‑
werke gmbh & co. kg)。然后，在加热至50℃的水浴中使用旋转蒸发器将有机溶剂除去至80 mbar的最终压力(laborata 4000 efficient, heidolph instruments)。将获得的脂质膜进一步在40℃下在真空下干燥3小时(vacuum drying cabinet vdl series, binder gmbh)。在添加超纯水之后，将出现的悬浮液在调温水浴中在连续搅拌下给予至少三个小时，以实现溶胀和囊泡出芽。也可以进行囊泡出芽，即在核酸存在的情况下形成脂质体。对于第一个挤出循环，将微型挤出机(avanti polar lipids, inc., usa)与聚碳酸酯膜(100 nm孔径)组装在一起，并将脂质体悬浮液通过过滤器13次。用50 nm膜进行第二个挤出循环。然后，将获得的脂质体(最终浓度为8.7 μmol/ml每种使用的脂质(17.4 μmol/ml总脂质))在4℃下储存在微量反应管中。
[0111]
对于复合制剂，将22 nmol脂质体与1μg核酸(电荷比阳离子脂质/核酸3.5/1)在生理甘露醇溶液(5.2 wt.% ph 7.2)中复合。将等体积的两种组分一起移液，并使用eppendorf thermomixer
®ꢀ
c (eppendorf，德国)在300 rpm和20℃下轻轻混合10分钟。
[0112]
由于dda和dobaq从固态至液晶态的转变温度高，略微修改该方法，使得脂质膜在调节至65℃的水浴中再水化。此外，dobaq-胆固醇脂质体的配制在等摩尔混合物中是不可行的。通过添加l-α-磷脂酰胆碱，转变温度降低，并且获得阳离子脂质体(dobaq/l-α-磷脂酰胆碱/胆固醇(1:1:2))。
[0113]
基于上述方法，配制了13种阳离子脂质体和l-α-磷脂酰胆碱/胆固醇参考脂质体。这些脂质体的脂质组成提供于表1中。组合物1-12用所述第一和第二脂质的1:1摩尔混合物制备。组合物13用所述三种脂质的1:1:2摩尔混合物制备。
[0114]
表1：制备的脂质体制剂 第一脂质第二脂质1dotap胆固醇(chol)2dotapdope3dotap14:1l-α-磷脂酰胆碱(pc)4dotma胆固醇(chol)5dotmadope6dotma14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)7dc-chol胆固醇(chol)8dc-choldope9dc-chol14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)10dda胆固醇(chol)11ddadope12dda14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)
13dobaql-α-磷脂酰胆碱/胆固醇(pc/chol)
[0115]
用于与脂质体复合的核酸提供于表2中。
[0116]
表2：用于与脂质体复合的核酸核酸seqidno.odn2395seqidno.1odnm362seqidno.2odn1668seqidno.3odn2006seqidno.4pex-k248 pgcmb75.6 pcdna3.1( ) [0117]
实施例2：脂质体-核酸复合物分析使用horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)在大小(z-平均值)、多分散性(pi)和ζ电位的方面分析脂质体-核酸复合物。
[0118]
关于大小和pi，在一次性聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)半微量比色皿中，在25℃下以173
°
的固定角度(反向散射模式)下通过动态光散射(dls)检查样品。将样品稀释至1.08 μmol/ml并测量五次。误差被计算为标准偏差(s.d.)。
[0119]
当通过使用累积量的技术分析dls数据时，可以计算z-平均值。由于该技术依赖于数值稳定的最小二乘拟合，因此它对实验噪声相对不敏感。通过dls测量的平移扩散系数可以基于stokes-einstein关系转换为z-平均粒径。z-平均大小是强度加权调和平均大小(iso22412:2017)。
[0120]dz
=流体力学直径(粒径)d
t,avg
=平移扩散系数(通过dls)kb=玻尔兹曼常数t=热力学温度η=动态粘度。
[0121]
多分散性源自多分散性指数，其从dls-测量的强度自相关函数的累积量分析计算得到。假设单一粒径模式，单指数拟合应用于自相关函数且多分散性描述了假设的高斯分布的宽度。通常，该参数是无量纲的和按比例缩放的，使得值范围为0.05至0.7，其中小值指示单分散大小分布(“iso 22412:2017
ꢀ‑ꢀ
粒径分析
ꢀ‑ꢀ
动态光散射(dls)”日期不详)。
[0122]
使用碳电极室经由电泳光散射测量ζ电位。为了该目的，将样品在甘露醇溶液(5.2 (w/v)%，ph 7.2)中1:10稀释。误差被计算为十次独立测量值的标准偏差s.d.，并且平均电位以毫伏[mv]为单位给出。
[0123]
颗粒在剪切面上的电荷被称为ζ电位。电泳光散射方法利用了带电颗粒在施加的电场中移动的事实。由于多普勒频移，散射光的频率是颗粒速度的函数。然后使用测量的频移幅度来确定颗粒速度。从已知的施加电场和测量的颗粒速度，容易地确定颗粒迁移率。然
v, perkinelmer)。
[0131]
通过应用获得的每种核酸类型的相应校准曲线的线性函数来计算核酸回收率和负载能力。稀释因子被调整至测定的线性范围。
[0132]
实施例4：体外细胞培养使j774-dual
tm
细胞(invivogen, 鼠nf-κb和1rf报告巨噬细胞样细胞)在具有高d-葡萄糖含量、1 mm丙酮酸钠和4 mm稳定谷氨酰胺的dulbecco氏最低必需培养基(dmem)中生长。dmem补充有10% fbs、50 μg/ml链霉素、50 u/ml青霉素g和100 μg/ml normocin
tm
。每隔一周，培养基额外补充有200 μg/ml zeocin
tm
和20 μg/ml杀稻瘟菌素。
[0133]
对于实验系列，制备不含酚红的无血清dmem，其含有1 mm丙酮酸钠、4 mm l-谷氨酰胺、50 μg/ml链霉素、50 u/ml青霉素g、100 μg/ml normocin
tm
、200 μg/ml zeocin
tm
和20μg/ml杀稻瘟菌素。j774-dual
tm
细胞系每周分裂一次，其中分裂比为1:4。
[0134]
j774-dual
tm
细胞在heracell
tm
150培养箱(thermo scientific)中在37℃与5% co2和95%加湿空气下培养。对于接种，使用体积为0.1 mm3的neubauer亮线血细胞计数器(marienfeld)对细胞进行计数。定期检查细胞系是否存在支原体污染。
[0135]
实施例5：j774双报告细胞系中的免疫读出值j774-dual
tm
是由invivogen提供的报告细胞系，其使得能够同时研究导致nf-κb和/或irf途径的激活的信号转导。
[0136]
nf-κb依赖性途径j774-dual
tm
细胞在nf-κb途径的控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。seap被分泌至细胞培养上清液中。因此，nf-κb激活的半定量分析是可能的(invivogen产品信息(“j774-dual cells | nf-kb & irf/ifn reporter macrophage”日期不详, 774))。对硝基苯磷酸酯(pnpp)是一种广泛使用的显色化学品，用于快速测定碱性磷酸酶活性。在碱性磷酸酶存在的情况下，该物质被水解为磷酸盐和黄色的对硝基苯酚，所述对硝基苯酚可以通过分光光度法测量(bessey, otto a., o. h. lowky, 和mary jane brock. "a method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum." journal of biological chemistry 164 (1946): 321-329.)。
[0137]
将细胞以每孔1x105个细胞的密度接种至96-孔微孔板中，并给予24 h用于粘附。除去培养基，并将细胞与裸cpg核酸、脂质体或脂质体-核酸复合物在无血清培养基中在37℃与5% co2和95%加湿空气(heracell
tm 150，thermo scientific)下孵育。在实验系列中包括lc
20 》40μm的脂质体。孵育48小时后，将每个样品的100 μl上清液转移至96-孔微孔板(spectraμlate
tm-96 tc, perkin elmer)中，并使用对硝基苯磷酸酯测定法通过分光光度法分析。
[0138]
为此，将100 μl pnpp工作试剂(由50 mm nahco3缓冲液(ph9.6)中的20 mm pnpp组成)添加至含有样品、对照或校准标准品的每个孔中。将混合物在37℃下孵育1 h后，使用配备有405 nm吸光度滤光片的victor3
tm v多模式读板器(perkin elmer)测定吸光度。来自肠炎沙门氏菌(salmonella anterica)血清型minnesota的脂多糖用作确定测定的线性范围的校准标准并用作阳性对照。所有实验一式三份进行。
[0139]
原始数据针对10 μg/ml蛋白含量归一化，并减去未处理对照的平均值。
[0140]
干扰素调节因子途径
j774-dual
tm
细胞还在irf途径的控制下表达lucia荧光素酶基因。在后者激活后，荧光素酶被转录并分泌至细胞培养上清液中。通过使用quanti-luc
tm
试剂，可对irf激活进行半定量分析(invivogen产品信息(“j774-dual cells | nf-kb & irf/ifn reporter macrophage”日期不详,774)。
[0141]
将细胞以每孔1x105个细胞的密度接种至96-孔微孔板中，并给予24 h用于粘附。除去培养基，并将细胞与裸cpg核酸、脂质体或复合物在无血清培养基中在37℃与5% co2和95%加湿空气(heracell
tm 150，thermo scientific)下孵育。在实验系列中包括lc
20 》40μm的脂质体。孵育48小时后，将每个样品的50 μl上清液转移至96-孔微孔板(optiplate
tm-96 hs, perkin elmer)中，并使用quanti-luc
tm
发光测定法根据制造商的说明书进行分析。
[0142]
将quanti-luc
tm
试剂溶解在25 ml无内毒素水中，并将50 μl添加至含有样品、对照或校准标准品的每个孔中。使用enspire
®
多模式读板器(perkin elmer)立即测定发光并测量为相对光单位(rlu)。重组lucia荧光素酶蛋白用作校准标准以确定测定的线性范围，并且将重组ifnα用作阳性对照。所有实验一式三份进行。
[0143]
将原始数据针对10μg/ml蛋白含量归一化，并减去未处理对照的平均值。
[0144]
附图的简要说明在下文中将参考描绘本发明的某些实施方案的附图来描述本发明。然而，本发明如在权利要求中所限定和本文所一般描述。其不应限于在下面的附图中出于说明性目的而显示的实施方案。
[0145]
以下附图中的一些包括显著性水平(p《0.05 (*)，p《0.01 (**)和p《0.001(***))。这些通过用graphpad instat3的统计分析确定。使用单向方差分析(anova)、随后为dunnett多重比较检验，进行计算数据与各自的对照(以及一组分别与所有其他)的比较。进行未配对t-检验与welch校正用于组间比较。
[0146]
图1：图1显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，c类免疫刺激性寡核苷酸odn 2395 (seq id no.1)和odn m362 (seq id no.2)对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体(即未复合的脂质体)和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸(即游离或未复合的免疫刺激性寡核苷酸)处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸(即40 μm脂质体脂质和1.85 μg/ml免疫刺激性寡核苷酸)。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
sd给出。除非另有说明，否则复合物与各自未复合的odn的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。尽管开发了odn 2395(seq id no.1)和odn m362(seq id no.2)以激活nf-κb免疫应答途径(参见，例如，hartmann, gunther, 和arthur m. krieg. "mechanism and function of a newly identified cpg dna motif in human primary b cells." the journal of immunology 164.2 (2000): 944-953; marshall, jason d., 等人 "identification of a novel cpg dna class and motif that optimally stimulate b cell and plasmacytoid dendritic cell functions." journal of leukocyte biology 73.6 (2003): 781-792)，但未观察到有效的nf-κb途径激活。3倍的刺激最多可以被认为是与未复合的cpg odn应用相比，免疫应答略微增加。
[0147]
图2：图2显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数
据针对蛋白含量归一化，c类免疫刺激性寡核苷酸odn 2395 (seq id no.1)和odn m362 (seq id no.2)对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
sd给出。除非另有说明，否则复合物与各自未复合的odn的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。在odn 2395(seq id no.1)和odn m362(seq id no.2)与包含脂质dotap dope、dotma dope或dda dope的脂质体复合后，观察到有效的irf途径激活。
[0148]
图3：图3显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，b类免疫刺激性寡核苷酸odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±
sd给出。除非另有说明，否则复合物与未处理的j774-dual
tm
的统计比较并不显著。与未处理的j774-dual
tm
相比，未复合的和复合的odn 1668 (seq id no.3)显示增加的nf-κb途径激活。除了与包含脂质dotma dope的脂质体形成的复合物之外，odn 1668 (seq id no.3)的免疫刺激性功效与未复合的odn 1668 (seq id no.3)相比没有显著改善。对于odn 2006 (seq id no.4)复合物，nf-κb途径激活在大多数情况下与未处理的对照没有显著不同。
[0149]
图4：图4显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，b类免疫刺激性寡核苷酸odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±
sd给出。除非另有说明，否则复合物与未处理的j774-dual
tm
的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。在odn 1668 (seq id no.3)和odn 2006 (seq id no.4)与包含脂质dotap dope、dotma dope或dda dope的脂质体复合后，观察到有效的irf途径激活。
[0150]
图5：图5显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸质粒处理。对于用质粒-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和质粒(即40 μm脂质体脂质和1.85 μg/ml质粒)。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
s.d.给出。除非另有说明，否则复合物与pc chol复合物的统计比较并不显著。对于所述复合物未观察到有效的nf-κb途径激活(与未处理的j774-dual
tm
相比，观察到约4的最大扩增因子)。
[0151]
图6：图6显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸质粒处
理。对于用质粒-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和质粒。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
s.d.给出。除非另有说明，否则复合物与pc chol复合物的统计比较是显著的(p《0.01 (**))。对于核酸-脂质体复合物，除了包含含有dobaq pc chol或pc chol的脂质体的复合物以外，观察到强烈的irf途径激活。
[0152]
图7：图7显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )以及未复合的odn 2395(seq id no.1)、odn m362(seq id no.2)、odn 1668(seq id no.3)和odn 2006(seq id no.4)对nf-κb途径的激活。
[0153]
图8：图8显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的odn 2395 (seq id no. 1)、odn m362 (seq id no. 2)、odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对nf-κb途径的激活。
[0154]
图9：图9显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )以及未复合的odn 2395(seq id no.1)、odn m362(seq id no.2)、odn 1668(seq id no.3)和odn 2006(seq id no.4)对irf途径的激活。
[0155]
图10：图10显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的odn 2395 (seq id no. 1)、odn m362 (seq id no. 2)、odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对irf途径的激活。
[0156]
图11：图11显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的z-平均值，其如实施例2中所述测定。
[0157]
图12：图12显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的ζ-电位，其如实施例2中所述测定。
[0158]
图13：图13显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的多分散性，其如实施例2中所述测定。
[0159]
图14：图14显示不同脂质体制剂的负载能力，其如实施例3中所述测定。
7.含有cpg基序的dna也被用作疫苗佐剂，以改进专门抗原呈递细胞的功能并加强体液和细胞疫苗特异性免疫应答的生成(参见，例如，bode, christian, 等人 "cpg dna as a vaccine adjuvant." expert review of vaccines 10.4 (2011): 499-511)。
8.然而，cpg-介导的tlr9激活有时可能特别不期望，至少如果它是主要的或唯一被刺激的促炎免疫应答的话。例如，tlr9激活已经与肺部炎症相关(schwartz, davida. 等人"cpg motifs in bacterial dna cause inflammation in the lower respiratory tract." the journal of clinical investigation 100.1 (1997): 68-73; knuefermann, pascal, 等人 "cpg oligonucleotide activates toll-like receptor 9 and causes lung inflammation in vivo." respiratory research 8.1 (2007): 72; ito, toshihiro, 等人 "toll-like receptor 9 activation is a key mechanism for the maintenance of chronic lung inflammation." american journal of respiratory and critical care medicine 180.12 (2009): 1227-1238)。因此，除了经典的tlr-介导的应答(诸如i型干扰素免疫应答途径)之外，还期望激活额外或替代的炎症途径，以诱导有效的免疫应答。i型干扰素免疫应答途径的激活可能特别有利，不仅用于刺激宿主的免疫系统来防御病原体，而且还例如用于肿瘤疗法(参见jablonska, jadwiga, 等人 "neutrophils responsive to endogenous ifn-β regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model." the journal of clinical investigation 120.4 (2010): 1151-1164)。
9.在其他情况下也期望避免或抑制cpg-诱导的tlr9-介导的炎性应答。例如，在非病毒基因疗法中，由非病毒载体或编码期望的基因疗法产品的核酸引发的tlr9-介导的炎性应答是需要避免的已知问题(zhao, hongmei等人"contribution of toll-like receptor 9 signaling to the acute inflammatory response to nonviral vectors." molecular therapy 9.2 (2004): 241-248.; makiya nishikawa和yoshinobu takakura. "development of safe and effective nonviral gene therapy by eliminating cpg motifs from plasmid dna vector." front biosci 4 (2012): 133-41.)。此类炎性应答可能影响非病毒基因疗法的安全性和有效性，并且在一些情况下，这种应答消除转基因表达细胞。为此，减少构建体中cpg基序的数量已被用于增加基于核酸的基因疗法的功效。总之，在基因疗法或其他情况下，需要避免tlr-介导的免疫应答。
10.综上所述，鉴于上述情况，除了或代替经典刺激的tlr-介导的途径，特别是tlr9-介导的途径，需要激活其他免疫应答途径、特别是i型干扰素途径的改进的核酸制剂。在基因疗法的背景下，特别需要减少或甚至绕过tlr-介导的应答。
11.发明概述针对上述背景，本发明的一个目的是提供免疫刺激性组合物，其与本领域中已知的组合物相比更有效地诱导细胞炎性应答和/或诱导有利地改变的炎性应答。具体而言，本
发明的一个目的是提供免疫刺激性组合物，除了或代替tlr-介导的免疫应答，所述免疫刺激性组合物(还或主要)激活i型干扰素途径。本发明的另一个目的是提供免疫刺激性组合物，其可以以经济的方式生产并且其组分在化学上明确定义。本发明的又一个进一步目的是提供简单且经济的产生此类组合物的方法。本发明的另一个目的是提供免疫刺激性组合物，其有效地预防或治疗受试者中的感染性疾病。一个进一步目的是提供可用作疫苗佐剂的免疫刺激性组合物。
12.这些目的中的一些或全部通过根据权利要求1的免疫刺激性组合物、根据权利要求11的制备免疫刺激性组合物的方法以及根据权利要求12和13的用途实现。
13.本发明提供了包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物，其中所述复合物含有
‑ꢀ
脂质体，就其脂质而言，其包含第一脂质和第二脂质或由其组成，其中所述第一脂质是两性离子脂质且所述第二脂质是阳离子脂质；和
‑ꢀ
一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种多核苷酸。
14.发明人已经令人惊讶地发现包含两性离子脂质、特别是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)作为脂质体中的两种必需脂质组分之一的脂质体-核酸复合物、特别是脂质体-寡核苷酸复合物在激活细胞i型干扰素免疫应答途径方面特别有效且有选择性。对该观察结果的进一步研究已经揭示了作为本发明基础的可能作用机制。不受任何特定科学理论的束缚，两性离子脂质可能具有特殊的核内体裂解和促融合特性，这可能有助于这种效果。在通常吸收脂质体-核酸复合物的核内体中，通常发生tlr激活。经由在脂质体中使用两性离子脂质的本发明似乎使得免疫刺激性核酸可能一旦被递送至靶细胞就快速从细胞核内体逃逸至胞质溶胶中。因此，该机制有助于增加免疫刺激性核酸的胞质溶胶浓度。胞质溶胶核酸能够激活irf-依赖性途径，且因此激活i型干扰素免疫应答途径。当免疫刺激性寡核苷酸用作本发明的脂质体-核酸复合物中的核酸时，尤其观察到irf-依赖性途径的更显著激活的这种效果。这是令人惊讶的，因为先前没有描述过脂质类型和核酸类型之间的相互依赖关系。
15.脂质体-核酸复合物的脂质体中的第二种必需脂质组分是阳离子脂质。它与两性离子脂质的组合使用具有两个主要优点。一方面，发现阳离子脂质促进脂质体的脂质双层和带负电荷的免疫刺激性核酸之间的相互作用，允许在脂质体-核酸复合物中富集免疫刺激性核酸。另一方面，所述阳离子脂质还通过为脂质体提供净正电荷发挥功能，这进而促进脂质体-核酸复合物与阴离子细胞表面分子更有效的结合，且因此促进细胞对脂质体-核酸复合物的摄取。
16.本发明还提供了制备本发明的免疫刺激性组合物的方法，其包括以下步骤：a. 提供脂质体并将所述脂质体与一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸混合以形成脂质体-核酸复合物；或b. 在脂质体形成之前或期间使脂质与所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物。
17.以这种方式，可以有效且以稳健的方式获得免疫刺激性组合物。
18.当使用免疫刺激性寡核苷酸作为核酸时，本发明提供了特别有利的结果和令人惊讶的效果。当在免疫刺激性组合物中使用寡核苷酸代替多核苷酸(例如质粒)时，本发明允
许用更好表征的试剂进行更经济和更清洁的生产，同时在免疫刺激方面实现令人惊讶地相似的结果。免疫刺激性寡核苷酸可以通过成本有效的体外合成进行生产，而质粒通常需要生物技术生产手段，诸如在细菌细胞中繁殖，这本身导致更复杂、化学上不太明确定义的产品。因此，在体外合成免疫刺激性寡核苷酸的能力具有使用更明确定义和经济的化学产品来生产本发明的免疫刺激性组合物的优点。
19.尽管下文主要在脂质体-寡核苷酸复合物的背景下描述了本发明的免疫刺激性组合物和方法，但描述的这些部分类似地适用于包含脂质体-多核苷酸复合物的对应实施方案。
20.本发明还涉及包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中的两性离子脂质用于诱导i型干扰素免疫应答和/或减少或绕过tlr-介导的免疫应答的用途。这些效果不仅在治疗或预防性医学免疫刺激应用中特别有用，而且在基因疗法的背景下也特别有用，因为可以减少或甚至避免不需要的针对编码期望的基因疗法产物的核酸的免疫应答。
21.最后，本发明还涉及本发明的免疫刺激性组合物在刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法中的用途，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于受试者的步骤。
22.说明性实施方案的详细描述为清楚起见，本文在单独实施方案的上下文中描述的根据本发明的免疫刺激性组合物、方法和用途的特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的根据本发明的免疫刺激性组合物、方法和用途的各种特征也可以任何子组合提供。类似地，结合本发明的免疫刺激性组合物描述的特征或实施方案同样适用于本发明的方法和用途，且反之亦然。如本文所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”意欲也包括复数形式，即，在“一个/种或多个/种”的意义上，除非上下文另有清楚地指明。
23.免疫刺激性组合物本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体-核酸复合物。所述脂质体-核酸复合物含有脂质体和作为核酸的一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸。优选地，所述脂质体-核酸复合物含有脂质体和一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。
24.如本文所用的“免疫刺激性组合物”是指能够激活免疫应答途径、特别是能够在体内刺激脊椎动物的先天免疫系统的组合物。术语“免疫应答途径”可与术语“炎性应答途径”或“促炎应答途径”互换使用，并且是指促进先天免疫应答的急性发展的细胞内信号传导途径。此类免疫应答途径尤其包括最终诱导促炎细胞因子表达的nf-κb依赖性途径和触发i型干扰素免疫应答途径激活的irf-依赖性途径。
25.所述免疫刺激性组合物尤其意欲用于刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于受试者的步骤。因此，所述免疫刺激性组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体和添加剂。
26.本发明的免疫刺激性组合物还可以包含一种或多种抗原，且因此可用作疫苗制剂，其中所述脂质体-核酸复合物充当佐剂。此外，本发明的免疫刺激性组合物还可以包含一种或多种药物。在该情况下，所述免疫刺激性组合物是药物组合物。
27.脂质体本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体作为脂质体-核酸复合物的一部分。如本文所用的脂质体是人造微观颗粒，其由包围液体核心的一个或多个脂质双层构成，所述液体核心通常是水性液体核心。所述脂质体可以是单层的(特别是大单层囊泡(luv)和/或小单层囊泡(suv))或多层囊泡(mlv)。mlv在每个囊泡中具有多个双层，其形成几个独立的隔室。所有这些类型的脂质体都具有以下共同点：脂质双层包封液体核心。然而，mlv、luv和suv的直径不同。mlv的直径通常为》500 nm。luv的直径通常为》100 nm。suv通常具有约20至100 nm的直径。
28.优选地，所述脂质体是单层囊泡。单层囊泡具有以下优点：它们的直径通常小于多层脂质体。由于它们的大小较小，单层囊泡比多层脂质体更容易被靶细胞内吞。此外，单层囊泡可进行无菌过滤。
29.在本发明的另一个优选实施方案中，所述脂质体是平均直径在约10和约550 nm之间的单层囊泡。优选地，用于形成本发明的脂质体-核酸复合物的脂质体具有约20至约450 nm，甚至更优选约40至约250 nm，还更优选40至220 nm且最优选40至200 nm的平均直径。已发现使用这些大小范围的脂质体是有利的，因为在此类脂质体与免疫刺激性核酸复合后，形成具有适当大小的脂质体-核酸复合物，其可被靶细胞有效地内吞。平均直径低于约《250nm的脂质体-核酸复合物的一个额外优势是此类脂质体-核酸复合物可以无菌过滤。
30.如本文所述的脂质体和脂质体-核酸复合物的平均直径通过动态光散射测定，由此通过累积量的技术分析测量结果并且平均直径被计算为z-平均值(参见下文)。
31.在一个最优选的实施方案中，所述脂质体是“小单层囊泡(suv)”。如果suv用于形成本发明的脂质体-核酸复合物，实验已经显示靶细胞对脂质体-核酸复合物的摄取是特别有效的。
32.本文中与数值相关的术语“约”的使用表明数值可能受到测量误差的影响，所述测量误差通常使数值改变不超过
±
5%。本文公开的数值连同术语“约”也意在如此公开，即没有术语“约”。进一步，如本文所述的数值范围意欲包括和公开该范围内的各个和每个值。本文公开的同一参数的范围的所有上端点和下端点都可与彼此组合。本文公开的不同参数的所有范围都可与彼此组合。具体而言，相同“优先水平”的范围尤其可与彼此相配。
33.脂质体的形成需要存在“囊泡-形成脂质”，其为能够形成或并入双层结构的两亲性脂质。脂质双层包括能够通过自身或当与另一种或多种脂质组合时形成双层的脂质。
34.存在于根据本发明的脂质体中的脂质，即囊泡-形成脂质，包含第一脂质和第二脂质或由第一脂质和第二脂质组成，其中所述第一脂质是两性离子脂质且所述第二脂质是阳离子脂质。
35.两性离子脂质，即本发明的脂质体中含有的第一脂质，在ph为7时含有带正电荷和带负电荷的基团两者，具有总体中性的净电荷。
36.在本发明的一个优选实施方案中，所述两性离子脂质是甘油磷脂，其中两个脂族部分通过酯和/或醚键附接至甘油部分。所述脂族部分可以是饱和的或不饱和的。两个脂族部分可以是相同或不同的烃。优选地，两性离子甘油磷脂的两个脂族部分是相同的。在另一个优选实施方案中，所述脂族部分是含有10-30个、优选12-26个、更优选14-24个且最优选16-22个碳原子的无支链不饱和烃。在一个更优选实施方案中，所述脂族部分是含有10-30
个、优选12-26个、更优选14-24个且最优选16-22个碳原子和单个双键的无支链不饱和烃。在本发明的另一个优选实施方案中，所述两性离子脂质的电荷归因于存在于两性离子脂质中的至少磷酸盐部分和伯胺。上述两性离子脂质的优选实施方案可以与彼此自由组合。已经发现，如果本发明的脂质体-核酸复合物的脂质体含有具有任何上述结构元件的两性离子脂质，则i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
37.在本发明的最优选实施方案中，所述两性离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。实际实验已经显示，在脂质体-核酸复合物的脂质体中一起使用dope与阳离子脂质对诱导i型干扰素免疫应答途径是非常有效的。当免疫刺激性寡核苷酸用作本发明的核酸-脂质体复合物中的核酸时，这些效果对于所使用的两性离子脂质的类型是特别显著和特异性的。
38.在本发明的一个优选实施方案中，所述第一脂质占脂质体的脂质含量的至少40 wt.%，优选至少45 wt.%和最优选至少50 wt.%。已经发现，如果两性离子脂质以这些量存在于本发明的脂质体-核酸复合物中含有的脂质体的脂质双层中，则i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
39.用于阳离子脂质的术语“第二脂质”用于表示第二脂质不同于第一脂质。具体而言，所述第二脂质不包含dope。所述第二脂质是阳离子脂质。术语“阳离子脂质”在本文中被定义为在任何给定ph下具有约1至9、更优选2至8的范围内的阳离子净电荷的脂质。阳离子净电荷优选但不必存在于整个上述ph范围内。在另一个实施方案中，阳离子脂质被定义为至少在7的ph下具有阳离子净电荷。
40.如本文所用的“脂质”优选意指分子量小于3000 da、更优选小于2000 da的化合物。
41.在本发明的一个优选实施方案中，所述阳离子脂质选自n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇)和其他阳离子胆固醇衍生物、n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙-l-铵(n-(4-carboxybenzyl)-n,n-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, dobaq)和1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉氯化物(dotim)。
[0042]
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述第一脂质是dope，且所述第二脂质是dotma，或所述第一脂质是dope，且所述第二脂质是dotap。作为本发明基础的研究已经表明，在免疫刺激性组合物中使用具有这两种脂质组合的脂质体在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的。
[0043]
所述脂质体-核酸复合物中阳离子脂质与免疫刺激性核酸的电荷比优选为2:1，更优选为3:1，且最优选为3.5:1。脂质体-核酸复合物的电荷比可以通过确定复合物中存在的阳离子脂质和免疫刺激性核酸的量来评价。基于确定的量，可以计算电荷比。对于该计算，假定核酸净电荷主要源自核酸骨架中带负电荷的磷酸根和/或硫代磷酸根基团。如果这些电荷比存在于脂质体-核酸复合物中，则获得特别可再现且稳定的复合物。此外，观察到特别好的负载能力。
[0044]
如本文所用的术语“负载能力”是指脂质体粘附和/或封装所有免疫刺激性核酸的
能力。
[0045]
免疫刺激性寡核苷酸本发明的免疫刺激性组合物优选包含一种或多种免疫刺激性寡核苷酸作为核酸组分。如本文所用的术语“一种或多种”意指化学上不同的寡核苷酸可以与脂质体复合以形成免疫刺激性组合物的脂质体-寡核苷酸复合物。例如，可以使用不同碱基序列或糖磷酸酯骨架不同的寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明的核酸-脂质体复合物的核酸组分由免疫刺激性寡核苷酸组成。
[0046]
如本文所用的“免疫刺激性寡核苷酸”是通过被脊椎动物的先天免疫系统检测为外来物并由此激活先天免疫应答途径而在脊椎动物中引发免疫应答的寡核苷酸。
[0047]
通常，根据本发明使用的免疫刺激性寡核苷酸是合成来源的。因此，它们可以合成为具有任何期望的序列和/或在糖磷酸酯骨架中具有修饰。此外，本发明的免疫刺激性组合物中使用的免疫刺激性寡核苷酸在7的ph下具有净负电荷，且因此代表聚阴离子。令人惊讶地，所有测试的免疫刺激性寡核苷酸在与根据本发明的脂质体复合后能够诱导i型干扰素免疫应答，而与其核苷酸序列无关。因此假定技术效果是不依赖于序列的，最低要求是本发明的免疫刺激性寡核苷酸的聚阴离子性质。
[0048]
所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是线性的，至少部分是单链dna分子。然而，单链dna免疫刺激性寡核苷酸可以尤其通过watson-crick碱基配对与自身或彼此相互作用，以形成二级结构和附聚物。然而，单链延伸段将始终存在于所述免疫刺激性寡核苷酸中。在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是cpg寡脱氧核苷酸(或cpg odn)。这些是短的单链合成dna分子，其含有三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(“c”)和随后的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(“g”)。“p”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯连接，尽管根据本发明的odn可以反而具有修饰的硫代磷酸酯骨架。如引言中所解释，cpg基序据信被先天免疫系统的tlr9模式识别受体识别为pamp。
[0049]
在一个进一步优选的实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸选自a-类、b-类和c-类免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸分类为“a-类”、“b-类”和“c-类”是技术人员众所周知的，并且描述于例如vollmer, j
ö
rg. "cpg motifs to modulate innate and adaptive immune responses." international reviews of immunology 25.3-4 (2006): 125-134。
[0050]
a-类免疫刺激性寡核苷酸的典型特征是含有中央磷酸二酯cpg的回文基序和部分硫代磷酸酯修饰的骨架，特别是硫代磷酸酯3'多聚-g延伸段。
[0051]
b-类免疫刺激性寡核苷酸的典型特征是具有一个或多个cpg二核苷酸的完整硫代磷酸酯骨架。
[0052]
c-类免疫刺激性寡核苷酸表现出a类和b类免疫刺激性寡核苷酸的特性。它们含有完整的硫代磷酸酯骨架和一个或多个含回文cpg的基序。
[0053]
根据本发明的免疫刺激性寡核苷酸通常具有14至500个核苷酸、优选14至400个核苷酸、更优选14至300个核苷酸、还更优选14至200个核苷酸、甚至更优选16至40个核苷酸且最优选18至30个核苷酸的长度。这种大小的免疫刺激性寡核苷酸可以容易地在体外合成，并且被发现有效地激活i型干扰素免疫应答途径。
[0054]
在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自b-类
和c-类免疫刺激性寡核苷酸。作为本发明基础的研究表明，用本发明的免疫刺激性组合物中的b-类和c-类免疫刺激性寡核苷酸，i型干扰素免疫应答途径的激活是特别有效的。
[0055]
在本发明的免疫刺激性组合物的另一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸与seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3或seq id no. 4具有至少75%序列同一性、更优选至少80%序列同一性、甚至更优选85%序列同一性、还更优选90%、95%或97%序列同一性。
[0056]
在本发明的免疫刺激性组合物的一个更优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸与seq id no. 1或seq id no. 2具有至少75%序列同一性、更优选至少80%序列同一性、甚至更优选85%序列同一性、还更优选90%、95%或97%序列同一性。
[0057]
如本文所用，“百分比序列同一性”和类似术语用于描述两个或更多个核酸之间的序列关系，并且在如下术语的上下文中并与如下术语结合理解，所述术语包括：a)参考序列，b)比较窗口，c)序列同一性和d)序列同一性的百分比。
[0058]
a)
ꢀ“
参考序列”是定义的序列，其用作序列比较的基础。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，全长cdna或基因序列的区段，或完整的cdna或基因序列。在本情况下，参考序列是seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3或seq id no. 4。
[0059]
b)
ꢀ“
比较窗口”包括对多核苷酸序列的连续和指定区段的提及，其中可以将多核苷酸序列与参考序列进行比较，并且与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加、取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。本领域技术人员理解，为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而导致的与参考序列的误导性高相似性，通常引入缺口罚分并从匹配数中减去。
[0060]
c) 用于比较的序列比对方法是本领域中众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过smith和waterman, adv.appl.math., 2: 482, 1981的局部同源性算法；通过needleman和wunsch, j.mol.biol., 48: 443, 1970的同源性比对算法；通过pearson和lipman, proc.natl.acad.sci.usa, 8: 2444, 1988的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化执行来进行，所述计算机化执行包括但不限于：intelligenetics, mountainview, calif.的pc/gene程序中的clustal，wisconsin genetics software package,genetics computer group (gcg), 7 science dr., madison, wis., usa中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta；clustal程序由higgins 和sharp, gene, 73: 237-244,1988; corpet, 等人, nucleic acids research, 16:881-90, 1988; huang, 等人,computer applications in the biosciences, 8:1-6, 1992; 和pearson, 等人,methods in molecular biology, 24:7-331, 1994充分描述。可以用于数据库相似性搜索的blast程序家族包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的blastn；用于针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的blastx；用于针对核苷酸数据库序列的蛋白查询序列的tblastn；和用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的tblastx。参见，current protocols in molecular biology, 第19章, ausubel, 等人编, greene publishing and wiley-interscience, new york, 1995。上述程序的新版本或新程序一起无疑将在将来可用，并且可以与本公开一起使用。
[0061]
d)
ꢀ“
百分比同一性”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中与参考序列(其不包含添加、取代或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分
可以包含添加、取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。百分比通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
[0062]
在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸选自：seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4。实验研究已经显示，在本发明的免疫刺激性组合物中使用编码seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4的免疫刺激性寡核苷酸在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的。seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4的免疫刺激性寡核苷酸与本发明的脂质体的复合将所述免疫刺激性寡核苷酸从有效的tlr-激动剂转化为i型干扰素免疫应答途径的有效激动剂。不受任何特定科学理论的约束，据信这种作用是由于根据本发明的脂质体的脂质组成，特别是两性离子脂质的存在。这令人惊讶地似乎导致所述免疫刺激性寡核苷酸在细胞内有效地从核内体释放至靶细胞的胞质溶胶中。
[0063]
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸是seq id no.1和/或seq id no.2的寡核苷酸。本发明的包含编码seq id no.1和seq id no.2的免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性组合物在激活i型干扰素免疫应答途径中是特别有效的，而同时绕过tlr9-介导的免疫应答。
[0064]
在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸在糖-磷酸酯骨架中包含硫代磷酸酯，即部分硫代磷酸酯修饰的骨架。在另一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含完全硫代磷酸酯骨架。硫代磷酸酯修饰具有以下优点：所述免疫刺激性寡核苷酸不仅通过它们与本发明的脂质体的复合来保护免于被细胞外核酸酶降解，而且还通过它们修饰的化学性质来保护。一旦所述免疫刺激性寡核苷酸被吸收至靶细胞中，所述硫代磷酸酯修饰还保护所述免疫刺激性寡核苷酸免于细胞内核酸酶降解。作为结果，这些免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性增加。
[0065]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物不含或基本上不含质粒dna。“基本上不含”质粒dna意指所述免疫刺激性组合物的总dna含量的小于1 wt%、优选小于0.5 wt%和最优选小于0.01 wt%是质粒dna。通过使用基本上不含质粒或不含质粒的免疫刺激性组合物，确保本发明的免疫刺激性组合物仅包含化学充分定义的组分。此外，通过避免在免疫刺激性组合物中使用质粒，本发明的免疫刺激性组合物的生产成本和复杂性降低。
[0066]
免疫刺激性多核苷酸本发明的免疫刺激性组合物可以包含一种或多种免疫刺激多核苷酸。也可能的是，本发明的免疫刺激性组合物包含一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和一种或多种免疫刺激多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的核酸-脂质体复合物的核酸组分由免疫刺激性多核苷酸组成。
[0067]
所述一种或多种免疫刺激性多核苷酸可以是单链或双链dna分子。所述免疫刺激性多核苷酸可以是环状或线性的。在一个实施方案中，所述免疫刺激性多核苷酸是质粒dna。
[0068]
本发明的免疫刺激性多核苷酸至少在它们的长度上不同于本发明的免疫刺激性寡核苷酸。本发明的免疫刺激性多核苷酸具有至少31个核苷酸、优选至少41个核苷酸、更优
选至少201个核苷酸、还更优选至少301个核苷酸、甚至更优选至少401个核苷酸且最优选至少501个核苷酸的长度。
[0069]
实验已经显示，以本发明的脂质体-多核苷酸复合物的形式配制的多核苷酸可以特别有效地激活i型干扰素免疫应答途径。
[0070]
脂质体-核酸复合物本发明的免疫刺激性组合物包含脂质体-核酸复合物。尽管这些在本文中基于单一复合物定义，但当然应理解，在实践中，本发明的免疫刺激性组合物将包含多种脂质体-核酸复合物。它们可以具有相同或不同的组成。然而，平均而言，本文对于单个脂质体-核酸复合物及其组分描述的特征适用于所述免疫刺激性组合物中的所有脂质体-核酸复合物。优选地，所述脂质体-核酸复合物是脂质体-寡核苷酸复合物。
[0071]
在本发明的一个优选实施方案中，所述脂质体-核酸复合物至少平均具有20至600 nm、优选40至500 nm、甚至更优选60至300 nm、还更优选60至250 nm且最优选60至220 nm的直径。已经发现使用这种大小范围的复合物是有利的，因为这些大小范围的复合物可以被靶细胞有效地内吞。平均直径低于约《250 nm的脂质体-核酸复合物的一个额外的优点是它们可以无菌过滤。
[0072]
技术人员知道确定脂质体和脂质体-核酸复合物的平均直径的合适方法。本文所述的平均直径是通过动态光散射(dls)在173
°
的固定角度(反向散射模式)用例如horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)测量的z-平均粒径。当通过累积量技术分析动态光散射数据时，可以计算脂质体或脂质体-核酸复合物的整体集合的z-平均值。通过dls测量的平移扩散系数可以基于stokes-einstein关系转换为z-平均粒径。z-平均大小是强度加权调和平均大小(iso 22412:2017)。
[0073]
如本文所用的术语“脂质体-核酸复合物”可以意指所述免疫刺激性核酸被包封在脂质体中和/或它们仅附接至脂质体的表面。核酸与脂质体的复合，即它们与脂质体的附接和/或包封在脂质体中具有保护核酸免于核酸酶降解的优点。在本发明的免疫刺激性组合物的优选实施方案中，所述脂质体-核酸复合物的免疫刺激性核酸至少被基本上包封在脂质体中。如本文所用的“基本上包封”意指所述组合物中存在的免疫刺激性核酸中的至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%且还更优选至少70%、80%、90%、95%或99%被脂质体包封。当包封在脂质体中时，所述免疫刺激性核酸被特别有效地保护免于降解，特别是免于核酸酶降解。由于根据本发明的脂质体的特殊脂质组成，特别是由于两性离子脂质假定的核内体裂解和促融合特性，所述免疫刺激性核酸即使被包封也可以非常有效地发挥其免疫刺激作用，且因此不能直接接近免疫系统。因此，本发明提供了将免疫刺激性核酸的有效保护与稳健的免疫刺激作用组合的优势。
[0074]
技术人员知道如何确定核酸包封度。这可以例如经由核酸酶保护测定来完成。在此，取确定的、相同大小的组合物等分试样。从第一个等分试样中，其中存在的核酸总量通过核酸提取和后续的核酸量测定来确定。对于第二个等分试样，将脂质体-核酸复合物与能够在允许可接近核酸降解的条件下降解核酸的核酸酶孵育。随后，洗涤脂质体并使核酸酶失活。例如，这可通过蛋白酶k处理来实现。从核酸酶处理的脂质体中提取剩余的核酸后，可以分析在核酸酶处理后保留下来的核酸的数量和完整性，例如，通过琼脂糖凝胶电泳。因此，可以通过将受保护的核酸量与核酸总量进行比较来确定包封度。
[0075]
已经证明本发明的脂质体-核酸复合物特别稳定。在一个实施方案中，所述脂质体-核酸复合物可以在液相中储存至少一个月、优选至少三个月且最优选至少六个月，而不会失去它们在本文实施例中描述的细胞培养测定中的免疫刺激作用和/或不改变它们的特性，诸如z-平均值、多分散性和ζ电位。
[0076]
脂质体的多分散性和ζ电位可以通过技术人员已知的方法来确定。确定多分散性的最优选方法是用例如horiba nanopartica sz-100(horiba, ltd.)以173
°
(反向散射模式)的固定角度测量动态光散射(dls)并从由dls-测量的强度自相关函数的累积量分析计算的多分散指数推导多分散性。假设单一粒径模式，单指数拟合应用于自相关函数，并且多分散性描述假设高斯分布的宽度。通常，该参数是无量纲且按比例缩放的，使得值范围为0.05至0.7，其中小值指示单分散大小分布(“iso 22412:2017
ꢀ‑ꢀ
粒径分析
ꢀ‑ꢀ
动态光散射(dls)”日期不详(n.d.))。测定ζ电位的优选方法是经由使用例如horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)的电泳光散射。从已知的施加电场和测量的颗粒速度，可以确定颗粒迁移率。然后通过smoluchowski模型(“iso 13099-2:2012-胶体系统-ζ-电位测定方法-部分2：光学方法”日期不详.)从迁移率计算ζ电位。
[0077]
技术人员知道对于免疫刺激性组合物，将浓度和剂量调整到低于给定阈值是避免细胞毒性的关键。所述阈值需要在用来自期望治疗组的样品受试者的剂量递增研究中确定。可以评价细胞毒性，例如，经由采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)的测定法。mtt测定法是一种用于评价细胞代谢活性的比色测定，所述细胞代谢活性据信与细胞活力成正比例相关。根据本发明，所述免疫刺激性组合物中的脂质体-核酸复合物的浓度是非细胞毒性的。该上下文中的“非细胞毒性的”意指细胞毒性低于细胞毒性测量方法(例如mtt测定法)的已知或确定阈值。如本文所用的“细胞毒性”是指异常的细胞状态，诸如不能茁壮成长、生长迟缓、不规则的微观外观和/或免疫应答性下降。在一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物中的脂质体-核酸复合物的浓度为约0.1至约250 ng/ml、优选约0.1至约200 ng/ml且更优选约0.1至约150 ng/ml。在所述免疫刺激性组合物的另一个优选实施方案中，所述免疫刺激性组合物的浓度为约10至约250 ng/ml、约50至约250 ng/ml或约100至约250 ng/ml。
[0078]
方法本发明还提供了用于制备上述免疫刺激性组合物的方法。所述方法包括以下步骤：a. 提供脂质体并使所述脂质体与一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物；或b. 在脂质体形成之前或期间使脂质与所述一种或多种免疫刺激性寡核苷酸和/或一种或多种免疫刺激性多核苷酸接触以形成脂质体-核酸复合物。
[0079]
步骤a.中使用的脂质体的脂质组分和步骤b.中使用的脂质包含如上所定义的第一和第二脂质或由其组成。
[0080]
步骤a.和b.彼此不同在于所述脂质体在与一种或多种免疫刺激性核酸接触之前预先形成(步骤a.)或所述脂质体形成在一种或多种免疫刺激性核酸存在的情况下发生(步骤b.)。通过经由步骤b.制备脂质体-核酸复合物，可以实现所述免疫刺激性核酸的特别高的包封效率。
[0081]
用于脂质体形成的技术是本领域中众所周知的。例如，ian maclachlan在“antisense drug technology”, crc press, 第2版, 2007中关于“liposomal formulations for nucleic acid delivery”的章节提供了良好的概览。为了实施本发明，当经由薄膜水合、随后挤出方法形成脂质体时，得到特别好的结果(参见，例如，zhang, hongwei. "thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation." liposomes. humana press, new york, ny, 2017. 17-22; jahn, andreas, 等人 "controlled vesicle self-assembly in microfluidic channels with hydrodynamic focusing." journal of the american chemical society 126.9 (2004): 2674-2675; deamer, david w. "preparation and properties of ether
‐
injection liposomes." annals of the new york academy of sciences 308.1 (1978): 250-258; vladisavljevi
ć
, goran t., 等人 "production of liposomes using microengineered membrane and co-flow microfluidic device." colloids and surfaces a: physicochemical and engineering aspects 458 (2014): 168-177; kastner, elisabeth, 等人 "high-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization." international journal of pharmaceutics 477.1-2 (2014): 361-368)。
[0082]
在本发明的一个优选实施方案中，步骤a.中提供或步骤b.中形成的脂质体具有对于上述本发明的组合物中的脂质体描述的一种或多种特征。这尤其适用于它们的层状类型、大小、包封度和电荷比。
[0083]
为了产生能够诱导先天免疫系统的应答的脂质体-核酸复合物，需要向步骤a.中提供的脂质体中或在步骤b.中的脂质体形成之前或期间添加适量的免疫刺激性核酸。在一个优选的实施方案中，步骤a中或本发明的组合物和复合物中免疫刺激性核酸与脂质体的比率为0.1至5 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体，优选0.1至3 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体，且更优选0.1至1.5 μg免疫刺激性核酸:约22 nmol脂质体。
[0084]
两性离子脂质的用途本发明进一步涉及包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中的两性离子脂质、特别是dope诱导i型干扰素免疫应答的用途。在导致本发明的研究中，发现在脂质体-核酸复合物的脂质体中使用两性离子脂质可有效地激活细胞i型干扰素免疫应答途径。这是令人惊讶的，因为通常，通过脂质体递送的核酸激活tlr-依赖性途径，而不激活细胞溶质i型干扰素免疫应答途径。
[0085]
似乎在伴随或包封核酸的脂质体中存在两性离子脂质、特别是dope，改变它们的免疫原性，并将引发的免疫应答转向i型干扰素免疫应答途径的激活。两性离子脂质似乎具有特殊的促融合特性，其可通过与靶细胞膜融合促进复合核酸的细胞内递送。此类膜融合可以发生在核酸递送过程的多个不同阶段，诸如在质膜、核内体膜和/或核膜。通过使得能够与核内体膜融合，两性离子脂质似乎使得本发明的脂质体-核酸复合物的核酸可能从核内体逃逸至靶细胞的胞质溶胶中。这种效果的发生及其在通过激活i型干扰素免疫应答途径改变引发的免疫应答中的效用或这种改变在预期免疫刺激应用方面的益处均未被预期或不是可预测的。
[0086]
在本文所述的用途的一个优选实施方案中，所述两性离子脂质具有对于上述本发明的脂质体中含有的第一脂质定义的特征中的一种或多种。
[0087]
技术人员知道用于测试免疫刺激性组合物是否激活i型干扰素免疫应答途径的合适的体外细胞培养测定法。一种特别合适的方式是使用由invivogen提供的j774-dual
tm
报告细胞系(参见下文的实施例)。j774-dual
tm
细胞在irf-依赖性途径的控制下表达lucia荧光素酶基因，其最终触发i型干扰素免疫应答途径。在激活后，荧光素酶被转录并分泌至细胞培养上清液中。可以定量表达的荧光素酶的量。
[0088]
已发现本发明的免疫刺激性组合物诱导i型干扰素免疫应答。这可能发生在tlr-介导的免疫应答之外。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性组合物除了诱导i型干扰素免疫应答外，还可以减少或甚至绕过tlr-介导的免疫应答。
[0089]
因此，在包含脂质体-核酸复合物的免疫刺激性组合物中使用两性离子脂质来诱导i型干扰素免疫应答可能在靶细胞中同时诱导tlr-介导的免疫应答或导致这些减少或根本没有发生。
[0090]
不受任何特定科学理论的束缚，据信两性离子脂质的使用也对tlr-介导的免疫应答具有影响，因为特别是tlr9激活发生在核内体中。两性离子脂质似乎促进本发明的核酸逃逸至胞质溶胶中。这可能是对使用两性离子脂质可能减少或甚至绕过tlr激活的令人惊讶的发现的解释。
[0091]
技术人员知道用于测试免疫刺激性组合物是否激活细胞tlr-介导的免疫应答途径的合适的体外细胞培养测定法。这再次可以通过使用由invivogen提供的j774-dual
tm
报告细胞系来完成，其允许同时评价tlr-介导的免疫应答途径和irf-依赖性途径。为了使得能够评价tlr-介导的免疫应答途径，j774-dual
tm
细胞在tlr激活后诱导的nf-κb途径的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)。seap被分泌至细胞培养上清液中。可以容易地定量表达的seap的量。
[0092]
医疗用途本文所述的免疫刺激性组合物适用于基因疗法、刺激受试者中的免疫应答的方法和/或预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法，其中所述方法包括将所述免疫刺激性组合物施用于所述受试者的步骤。所述方法包括向受试者施用有效量的免疫刺激性组合物以引发免疫应答。还预期可以使用多于一次的免疫刺激性组合物施用来延长或增强免疫刺激作用。
[0093]
在使用本文所述的免疫刺激性组合物用于基因疗法、特别是用多核苷酸作为脂质体-核酸复合物的核酸组分后，可以减少或甚至绕过通常由用作基因疗法构建体的核酸诱导的不需要的tlr-介导的免疫应答。
[0094]
据信，刺激受试者的免疫系统将使其更好地自行战胜感染性疾病和入侵的病原体。在本发明的上下文中似乎特别相关的感染性疾病是由细菌引起的感染性疾病。据信，本发明的组合物和方法可有助于减少牲畜和肉类生产中所需的抗生素的量。
[0095]
当在至少一种药剂、诸如药物或疫苗之前施用于受试者、与这种药剂共同施用或在这种药剂施用之后施用时，本发明的免疫刺激性组合物还可以用于增强这种药剂的作用。当与一种或多种不同抗原共同施用时，本发明的免疫刺激性组合物可用作接种疫苗中的佐剂。或者，当与一种或多种不同药物共同施用时，本发明的免疫刺激性组合物也是药物
组合物。在这种情况下，药物分子还与脂质体-核酸复合物的脂质体复合，即附着至和/或包封至脂质体中。这具有以下优点：药物的消除半衰期得到增强，且同时药物穿过生物屏障的递送得到增强。
[0096]
此外，脂质体-核酸复合物，特别是当与药物共同施用时，可以在其表面上进一步修饰，例如通过用聚乙二醇进行聚合物包被以增加复合物的循环半衰期，特别是在全身递送后。此外，细胞摄取本发明的脂质体-核酸复合物的特异性可以通过将例如抗体或肽附接至复合物的表面以用于靶向目的而进一步改进。
[0097]
如本文所用的受试者可特别意指选自哺乳动物物种、水产养殖物种和禽类物种的受试者。所述受试者尤其可以是非人类动物，其可以选自牛、家禽、猪和伴侣动物、诸如狗和猫。
[0098]
可以将有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物施用于受试者。所述有效量足以在受体受试者中引发免疫应答。这种有效量是在受体受试者中引起免疫应答的任何量。测量免疫应答的方法是本领域中众所周知的。此外，技术人员将认识到有效量将取决于年龄重量、感染阶段以及本领域中已知的其他因素。合适的有效量可以范围为每个受试者约0.01 μg至1000 μg。
[0099]
合适的有效量可以范围为每个受试者约0.01 μg至1,000 μg。在一些实施方案中，所述有效量可以范围为约0.01 μg至约10 μg，约0.01 μg至约5 μg，约0.05 μg至约5 μg，约0.1 μg至约5 μg，约0.05 μg至约10 μg，约5 μg至约15 μg，约10 μg至约15 μg，约10 μg至约20 μg，约20 μg至约30 μg，约30 μg至约40 μg，约40 μg至约50 μg，约50 μg至约70 μg，约70 μg至约90 μg，约50 μg至约100 μg，约100 μg至约150 μg，约150 μg至约200 μg，约200 μg至约250 μg，约250 μg至约300 μg，约300 μg至约350 μg，约350 μg至约400 μg，约400 μg至约450 μg，约450 μg至约500 μg，约500 μg至约550 μg，约550 μg至约600 μg，约600 μg至约650 μg，约650 μg至约700 μg，约700 μg至约750 μg，约750 μg至约800 μg，约800 μg至约850 μg，约850 μg至约900 μg，约900 μg至约950 μg，约950 μg至约1000 μg。优选地，在一些实施方案中，所述有效量范围为约0.01 μg至约10 μg。然而，优选地在其他实施方案中，所述有效量范围为约50 μg至约100 μg。并且，优选地在其他实施方案中，所述有效量范围为约40 μg至约70 μg。
[0100]
在一些实施方案中，可以通过向禽类物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物来在禽类物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以在禽类物种的成员中引发免疫应答。例如，用于禽类物种的免疫刺激性组合物的有效量可以是约0.01 μg至约10 μg、约0.05 μg至约5 μg、约0.1 μg至约1.5 μg或约1.0 μg至约10 μg。通过实例的方式，对于禽类物种的受试者而言合适的有效量可以是约0.1 μg、0.2 μg、0.3 μg、0.4 μg、0.5 μg、0.6 μg、0.7 μg、0.8 μg、0.9 μg、1.0 μg、1.2 μg、1.4 μg、1.6 μg、1.8 μg、2.0 μg、2.5 μg、3.0 μg、3.5 μg、4.0 μg、4.5 μg、5.0 μg、5.5 μg、6.0 μg、6.5 μg、7.0 μg、7.5 μg、8.0 μg、8.5 μg、9.0 μg、9.5 μg、10.0 μg、9.5 μg、10.0 μg、10.5 μg、11.0 μg、12 μg、13 μg、14 μg或15 μg。
[0101]
在一些实施方案中，可以通过向牛物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫刺激性组合物来在牛物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以引发牛物种的成员中的免疫应答。例如，用于牛物种的免疫刺激性组合物的有效量可以为每只动物约1 μg至约
1000 μg，每只动物约5 μg至约500 μg，每只动物约10 μg至约100 μg，每只动物约10 μg至约50 μg，或每只动物约40 μg至约60 μg。通过实例的方式，对于牛物种的受试者而言合适的有效量可以是约30 μg、35 μg、40 μg、45 μg、50 μg、55 μg、60 μg、65 μg、70 μg、75 μg、80 μg、85 μg、90 μg、95 μg、100 μg、110 μg、120 μg、130 μg、140 μg、150 μg、160 μg、170 μg、180 μg、190 μg、200 μg或直至500 μg或直至1000 μg。
[0102]
本发明的方法在受试者中引发免疫应答，使得保护受试者免于易于引发免疫应答的疾病。如本文所用，短语“保护免于疾病”是指减少疾病的症状；减少疾病的发生；降低疾病的临床或病理严重程度；或减少引起疾病的病原体的脱落。保护受试者可以指本发明的组合物当施用于受试者时预防疾病发生、治愈和/或减轻或减少疾病症状、临床体征、病理学或病因的能力。例如但不限于，牛呼吸系统疾病(brd)的临床体征包括肺损伤、体温升高、抑郁(例如，厌食、对外部刺激的反应性降低、耳朵下垂)、流鼻涕和呼吸特征(例如，呼吸频率、呼吸努力)。可以将本文所述的免疫刺激性组合物施用于怀疑暴露于brd的牛，以预防或降低上述brd临床症状的严重程度。通过进一步实例的方式，但不限于，禽类受试者中马立克氏病的临床症状包括孵化率和禽类存活率降低。可以将本文所述的免疫刺激性组合物施用于怀疑暴露于马立克氏病病毒的禽类受试者以预防或减轻上述马立克氏病临床体征的严重程度。
[0103]
因此，如本文所用的保护受试者免于疾病包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗具有疾病的受试者(治疗性治疗)。具体而言，通过经由诱导有益或保护性免疫应答在受试者中引发免疫应答来实现保护受试者免于疾病，在一些情况下，所述免疫应答可以另外压制、减少、抑制或阻断过度活跃或有害的免疫应答。术语“疾病”是指与受试者的正常健康的任何偏离，并且包括当存在疾病症状的状态，以及已经发生偏离(例如，感染、基因突变、遗传缺陷等)、但症状尚未显现的病况。
[0104]
本发明的方法可用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减轻疾病以及预防由原发性疾病的发生而导致的继发性疾病。
[0105]
各种施用途径可用于施用本发明的免疫刺激性组合物。当然，所选择的特定模式将取决于所选择的特定受试者组、受试者的年龄和一般健康状态、所治疗的特定病况以及治疗和/或预防效力所需的剂量。本发明的方法可以使用产生有效水平的免疫应答而不引起临床上不可接受的副作用的任何施用模式来实施。
[0106]
所述免疫刺激性组合物可以静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、在卵内通过羽囊法(feather follicle method)、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域中已知的其他方法施用。在一个方面，皮下施用所述免疫刺激性组合物。在另一个方面，肌肉内施用所述免疫刺激性组合物。在另一个方面，所述免疫刺激性组合物作为喷雾剂施用。在另一个方面，可以口服施用所述免疫刺激性组合物。
[0107]
由于可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述组合物、产品和方法进行各种改变，因此旨在上述描述和以下给出的实施例中含有的所有内容均应解释为说明性的，而不是在限制的意义上进行解释。
[0108]
序列表本技术含有已经电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述序列表文件创建于2020年4月7日，名为bhc208001.txt，且大小为1017字节。
实施例
[0109]
实施例1：配制脂质体和核酸复合物根据薄膜水合方法、随后为两个后续的挤出循环，配制脂质体。从二元脂质混合物获得膜。
[0110]
将阳离子脂质和另一种脂质从氯仿中的10 mg/ml储备溶液按体积计量加入圆底烧瓶中。添加10 ml氯仿，并将共混物在调节至37℃的水浴中以350 rpm搅拌30分钟(ika rct standard, ika
®‑
werke gmbh & co. kg)。然后，在加热至50℃的水浴中使用旋转蒸发器将有机溶剂除去至80 mbar的最终压力(laborata 4000 efficient, heidolph instruments)。将获得的脂质膜进一步在40℃下在真空下干燥3小时(vacuum drying cabinet vdl series, binder gmbh)。在添加超纯水之后，将出现的悬浮液在调温水浴中在连续搅拌下给予至少三个小时，以实现溶胀和囊泡出芽。也可以进行囊泡出芽，即在核酸存在的情况下形成脂质体。对于第一个挤出循环，将微型挤出机(avanti polar lipids, inc., usa)与聚碳酸酯膜(100 nm孔径)组装在一起，并将脂质体悬浮液通过过滤器13次。用50 nm膜进行第二个挤出循环。然后，将获得的脂质体(最终浓度为8.7 μmol/ml每种使用的脂质(17.4 μmol/ml总脂质))在4℃下储存在微量反应管中。
[0111]
对于复合制剂，将22 nmol脂质体与1μg核酸(电荷比阳离子脂质/核酸3.5/1)在生理甘露醇溶液(5.2 wt.% ph 7.2)中复合。将等体积的两种组分一起移液，并使用eppendorf thermomixer
®ꢀ
c (eppendorf，德国)在300 rpm和20℃下轻轻混合10分钟。
[0112]
由于dda和dobaq从固态至液晶态的转变温度高，略微修改该方法，使得脂质膜在调节至65℃的水浴中再水化。此外，dobaq-胆固醇脂质体的配制在等摩尔混合物中是不可行的。通过添加l-α-磷脂酰胆碱，转变温度降低，并且获得阳离子脂质体(dobaq/l-α-磷脂酰胆碱/胆固醇(1:1:2))。
[0113]
基于上述方法，配制了13种阳离子脂质体和l-α-磷脂酰胆碱/胆固醇参考脂质体。这些脂质体的脂质组成提供于表1中。组合物1-12用所述第一和第二脂质的1:1摩尔混合物制备。组合物13用所述三种脂质的1:1:2摩尔混合物制备。
[0114]
表1：制备的脂质体制剂 第一脂质第二脂质1dotap胆固醇(chol)2dotapdope3dotap14:1l-α-磷脂酰胆碱(pc)4dotma胆固醇(chol)5dotmadope6dotma14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)7dc-chol胆固醇(chol)8dc-choldope9dc-chol14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)10dda胆固醇(chol)11ddadope12dda14:1l-α-磷脂酰胆碱(14:1pc)
13dobaql-α-磷脂酰胆碱/胆固醇(pc/chol)
[0115]
用于与脂质体复合的核酸提供于表2中。
[0116]
表2：用于与脂质体复合的核酸核酸seqidno.odn2395seqidno.1odnm362seqidno.2odn1668seqidno.3odn2006seqidno.4pex-k248 pgcmb75.6 pcdna3.1( ) [0117]
实施例2：脂质体-核酸复合物分析使用horiba nanopartica sz-100 (horiba, ltd.)在大小(z-平均值)、多分散性(pi)和ζ电位的方面分析脂质体-核酸复合物。
[0118]
关于大小和pi，在一次性聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)半微量比色皿中，在25℃下以173
°
的固定角度(反向散射模式)下通过动态光散射(dls)检查样品。将样品稀释至1.08 μmol/ml并测量五次。误差被计算为标准偏差(s.d.)。
[0119]
当通过使用累积量的技术分析dls数据时，可以计算z-平均值。由于该技术依赖于数值稳定的最小二乘拟合，因此它对实验噪声相对不敏感。通过dls测量的平移扩散系数可以基于stokes-einstein关系转换为z-平均粒径。z-平均大小是强度加权调和平均大小(iso22412:2017)。
[0120]dz
=流体力学直径(粒径)d
t,avg
=平移扩散系数(通过dls)kb=玻尔兹曼常数t=热力学温度η=动态粘度。
[0121]
多分散性源自多分散性指数，其从dls-测量的强度自相关函数的累积量分析计算得到。假设单一粒径模式，单指数拟合应用于自相关函数且多分散性描述了假设的高斯分布的宽度。通常，该参数是无量纲的和按比例缩放的，使得值范围为0.05至0.7，其中小值指示单分散大小分布(“iso 22412:2017
ꢀ‑ꢀ
粒径分析
ꢀ‑ꢀ
动态光散射(dls)”日期不详)。
[0122]
使用碳电极室经由电泳光散射测量ζ电位。为了该目的，将样品在甘露醇溶液(5.2 (w/v)%，ph 7.2)中1:10稀释。误差被计算为十次独立测量值的标准偏差s.d.，并且平均电位以毫伏[mv]为单位给出。
[0123]
颗粒在剪切面上的电荷被称为ζ电位。电泳光散射方法利用了带电颗粒在施加的电场中移动的事实。由于多普勒频移，散射光的频率是颗粒速度的函数。然后使用测量的频移幅度来确定颗粒速度。从已知的施加电场和测量的颗粒速度，容易地确定颗粒迁移率。然
v, perkinelmer)。
[0131]
通过应用获得的每种核酸类型的相应校准曲线的线性函数来计算核酸回收率和负载能力。稀释因子被调整至测定的线性范围。
[0132]
实施例4：体外细胞培养使j774-dual
tm
细胞(invivogen, 鼠nf-κb和1rf报告巨噬细胞样细胞)在具有高d-葡萄糖含量、1 mm丙酮酸钠和4 mm稳定谷氨酰胺的dulbecco氏最低必需培养基(dmem)中生长。dmem补充有10% fbs、50 μg/ml链霉素、50 u/ml青霉素g和100 μg/ml normocin
tm
。每隔一周，培养基额外补充有200 μg/ml zeocin
tm
和20 μg/ml杀稻瘟菌素。
[0133]
对于实验系列，制备不含酚红的无血清dmem，其含有1 mm丙酮酸钠、4 mm l-谷氨酰胺、50 μg/ml链霉素、50 u/ml青霉素g、100 μg/ml normocin
tm
、200 μg/ml zeocin
tm
和20μg/ml杀稻瘟菌素。j774-dual
tm
细胞系每周分裂一次，其中分裂比为1:4。
[0134]
j774-dual
tm
细胞在heracell
tm
150培养箱(thermo scientific)中在37℃与5% co2和95%加湿空气下培养。对于接种，使用体积为0.1 mm3的neubauer亮线血细胞计数器(marienfeld)对细胞进行计数。定期检查细胞系是否存在支原体污染。
[0135]
实施例5：j774双报告细胞系中的免疫读出值j774-dual
tm
是由invivogen提供的报告细胞系，其使得能够同时研究导致nf-κb和/或irf途径的激活的信号转导。
[0136]
nf-κb依赖性途径j774-dual
tm
细胞在nf-κb途径的控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。seap被分泌至细胞培养上清液中。因此，nf-κb激活的半定量分析是可能的(invivogen产品信息(“j774-dual cells | nf-kb & irf/ifn reporter macrophage”日期不详, 774))。对硝基苯磷酸酯(pnpp)是一种广泛使用的显色化学品，用于快速测定碱性磷酸酶活性。在碱性磷酸酶存在的情况下，该物质被水解为磷酸盐和黄色的对硝基苯酚，所述对硝基苯酚可以通过分光光度法测量(bessey, otto a., o. h. lowky, 和mary jane brock. "a method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum." journal of biological chemistry 164 (1946): 321-329.)。
[0137]
将细胞以每孔1x105个细胞的密度接种至96-孔微孔板中，并给予24 h用于粘附。除去培养基，并将细胞与裸cpg核酸、脂质体或脂质体-核酸复合物在无血清培养基中在37℃与5% co2和95%加湿空气(heracell
tm 150，thermo scientific)下孵育。在实验系列中包括lc
20 》40μm的脂质体。孵育48小时后，将每个样品的100 μl上清液转移至96-孔微孔板(spectraμlate
tm-96 tc, perkin elmer)中，并使用对硝基苯磷酸酯测定法通过分光光度法分析。
[0138]
为此，将100 μl pnpp工作试剂(由50 mm nahco3缓冲液(ph9.6)中的20 mm pnpp组成)添加至含有样品、对照或校准标准品的每个孔中。将混合物在37℃下孵育1 h后，使用配备有405 nm吸光度滤光片的victor3
tm v多模式读板器(perkin elmer)测定吸光度。来自肠炎沙门氏菌(salmonella anterica)血清型minnesota的脂多糖用作确定测定的线性范围的校准标准并用作阳性对照。所有实验一式三份进行。
[0139]
原始数据针对10 μg/ml蛋白含量归一化，并减去未处理对照的平均值。
[0140]
干扰素调节因子途径
j774-dual
tm
细胞还在irf途径的控制下表达lucia荧光素酶基因。在后者激活后，荧光素酶被转录并分泌至细胞培养上清液中。通过使用quanti-luc
tm
试剂，可对irf激活进行半定量分析(invivogen产品信息(“j774-dual cells | nf-kb & irf/ifn reporter macrophage”日期不详,774)。
[0141]
将细胞以每孔1x105个细胞的密度接种至96-孔微孔板中，并给予24 h用于粘附。除去培养基，并将细胞与裸cpg核酸、脂质体或复合物在无血清培养基中在37℃与5% co2和95%加湿空气(heracell
tm 150，thermo scientific)下孵育。在实验系列中包括lc
20 》40μm的脂质体。孵育48小时后，将每个样品的50 μl上清液转移至96-孔微孔板(optiplate
tm-96 hs, perkin elmer)中，并使用quanti-luc
tm
发光测定法根据制造商的说明书进行分析。
[0142]
将quanti-luc
tm
试剂溶解在25 ml无内毒素水中，并将50 μl添加至含有样品、对照或校准标准品的每个孔中。使用enspire
®
多模式读板器(perkin elmer)立即测定发光并测量为相对光单位(rlu)。重组lucia荧光素酶蛋白用作校准标准以确定测定的线性范围，并且将重组ifnα用作阳性对照。所有实验一式三份进行。
[0143]
将原始数据针对10μg/ml蛋白含量归一化，并减去未处理对照的平均值。
[0144]
附图的简要说明在下文中将参考描绘本发明的某些实施方案的附图来描述本发明。然而，本发明如在权利要求中所限定和本文所一般描述。其不应限于在下面的附图中出于说明性目的而显示的实施方案。
[0145]
以下附图中的一些包括显著性水平(p《0.05 (*)，p《0.01 (**)和p《0.001(***))。这些通过用graphpad instat3的统计分析确定。使用单向方差分析(anova)、随后为dunnett多重比较检验，进行计算数据与各自的对照(以及一组分别与所有其他)的比较。进行未配对t-检验与welch校正用于组间比较。
[0146]
图1：图1显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，c类免疫刺激性寡核苷酸odn 2395 (seq id no.1)和odn m362 (seq id no.2)对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体(即未复合的脂质体)和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸(即游离或未复合的免疫刺激性寡核苷酸)处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸(即40 μm脂质体脂质和1.85 μg/ml免疫刺激性寡核苷酸)。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
sd给出。除非另有说明，否则复合物与各自未复合的odn的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。尽管开发了odn 2395(seq id no.1)和odn m362(seq id no.2)以激活nf-κb免疫应答途径(参见，例如，hartmann, gunther, 和arthur m. krieg. "mechanism and function of a newly identified cpg dna motif in human primary b cells." the journal of immunology 164.2 (2000): 944-953; marshall, jason d., 等人 "identification of a novel cpg dna class and motif that optimally stimulate b cell and plasmacytoid dendritic cell functions." journal of leukocyte biology 73.6 (2003): 781-792)，但未观察到有效的nf-κb途径激活。3倍的刺激最多可以被认为是与未复合的cpg odn应用相比，免疫应答略微增加。
[0147]
图2：图2显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数
据针对蛋白含量归一化，c类免疫刺激性寡核苷酸odn 2395 (seq id no.1)和odn m362 (seq id no.2)对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
sd给出。除非另有说明，否则复合物与各自未复合的odn的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。在odn 2395(seq id no.1)和odn m362(seq id no.2)与包含脂质dotap dope、dotma dope或dda dope的脂质体复合后，观察到有效的irf途径激活。
[0148]
图3：图3显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，b类免疫刺激性寡核苷酸odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±
sd给出。除非另有说明，否则复合物与未处理的j774-dual
tm
的统计比较并不显著。与未处理的j774-dual
tm
相比，未复合的和复合的odn 1668 (seq id no.3)显示增加的nf-κb途径激活。除了与包含脂质dotma dope的脂质体形成的复合物之外，odn 1668 (seq id no.3)的免疫刺激性功效与未复合的odn 1668 (seq id no.3)相比没有显著改善。对于odn 2006 (seq id no.4)复合物，nf-κb途径激活在大多数情况下与未处理的对照没有显著不同。
[0149]
图4：图4显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，b类免疫刺激性寡核苷酸odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸免疫刺激性寡核苷酸处理。对于用寡核苷酸-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和免疫刺激性寡核苷酸。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±
sd给出。除非另有说明，否则复合物与未处理的j774-dual
tm
的统计比较并不显著。通过括号分组的条具有相同的显著性水平。在odn 1668 (seq id no.3)和odn 2006 (seq id no.4)与包含脂质dotap dope、dotma dope或dda dope的脂质体复合后，观察到有效的irf途径激活。
[0150]
图5：图5显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )对nf-κb途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸质粒处理。对于用质粒-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和质粒(即40 μm脂质体脂质和1.85 μg/ml质粒)。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
s.d.给出。除非另有说明，否则复合物与pc chol复合物的统计比较并不显著。对于所述复合物未观察到有效的nf-κb途径激活(与未处理的j774-dual
tm
相比，观察到约4的最大扩增因子)。
[0151]
图6：图6显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )对irf途径的激活。j774-dual
tm
细胞用浓度为40 μm脂质体脂质的裸脂质体和浓度为1.85 μg/ml的裸质粒处
理。对于用质粒-脂质体复合物处理j774-dual
tm
细胞，所用的复合物含有相应浓度的脂质体脂质和质粒。结果作为三次独立实验的平均值
ꢀ±ꢀ
s.d.给出。除非另有说明，否则复合物与pc chol复合物的统计比较是显著的(p《0.01 (**))。对于核酸-脂质体复合物，除了包含含有dobaq pc chol或pc chol的脂质体的复合物以外，观察到强烈的irf途径激活。
[0152]
图7：图7显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )以及未复合的odn 2395(seq id no.1)、odn m362(seq id no.2)、odn 1668(seq id no.3)和odn 2006(seq id no.4)对nf-κb途径的激活。
[0153]
图8：图8显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的seap水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的odn 2395 (seq id no. 1)、odn m362 (seq id no. 2)、odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对nf-κb途径的激活。
[0154]
图9：图9显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的质粒pex k-248、pgcmb75.6和pcdna3.1( )以及未复合的odn 2395(seq id no.1)、odn m362(seq id no.2)、odn 1668(seq id no.3)和odn 2006(seq id no.4)对irf途径的激活。
[0155]
图10：图10显示基于j774-dual
tm
的上清液中测量的荧光素酶水平的增加和后续将数据针对蛋白含量归一化，未复合的odn 2395 (seq id no. 1)、odn m362 (seq id no. 2)、odn 1668 (seq id no. 3)和odn 2006 (seq id no. 4)对irf途径的激活。
[0156]
图11：图11显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的z-平均值，其如实施例2中所述测定。
[0157]
图12：图12显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的ζ-电位，其如实施例2中所述测定。
[0158]
图13：图13显示包含寡核苷酸odn 2395(seq id no.1)或odn m362(seq id no.2)的新鲜制备的脂质体-寡核苷酸复合物与六个月龄的脂质体-寡核苷酸复合物相比的多分散性，其如实施例2中所述测定。
[0159]
图14：图14显示不同脂质体制剂的负载能力，其如实施例3中所述测定。
再多了解一些
本文用于创业者技术爱好者查询，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。