一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物及其制备方法和应用，属于天然药物化学及医药技术领域。


背景技术：

2.癌症，又名为恶性肿瘤，指的是细胞不正常过度增殖，且这些过度增殖的细胞可能侵犯身体的其他部分，为由控制细胞分裂增殖机制失常而引起的疾病。目前癌症已经成为严重威胁人类健康的疾病，我国传统高发而预后较差的食管癌、胃癌、肝癌等肿瘤死亡率逐年降低，但宫颈癌死亡率仍呈上升趋势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿。总之，我国恶性肿瘤负担日益加重，城乡差异较大，地区分布不均衡，癌症防控形势严峻；发达国家和发展中国家癌谱并存，防治难度巨大。
3.因此，寻找抗肿瘤先导化合物，尤其是从中草药中提取能够预防或治疗肿瘤的化合物具有积极意义。
4.丁葵草，别称：铺地锦、二叶人字草、翼草、人字草、苍蝇翼、丁贵草、二叶丁癸草等，是豆科，丁葵草属植物丁葵草(zornia diphylla)；主要分布于广东、广西、福建、四川、云南、江西、浙江等地。
5.丁葵草的地上部分可以入药，有清热解毒、祛瘀消肿、调起利湿的功效，被用于治疗感冒、胃肠炎、肝炎、痢疾等疾病。
6.目前丁葵草化学成分研究报道尚不多见。


技术实现要素：

7.鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物，其中，
8.所述一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物具有以下式(i)的结构式：
[0009][0010]
本发明另一方面提供了一种从植物中提取上述式(i)的齐墩果烷型三萜皂苷化合物的方法，其中，
[0011]
步骤1)：获取丁葵草地上部分的粉末，且所述粉末的目数小于等于10目；
[0012]
步骤2)：对所述步骤1)获取的粉末，采用乙醇进行回流提取，将获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏；
[0013]
步骤3)：将所述步骤2)获得的总浸膏分散于水中，依次采用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，获取正丁醇相提取物；
[0014]
步骤4)：将步骤3)获得的所述正丁醇相提取物，过硅胶柱层析分离；所述硅胶柱层析使用第一洗脱剂进行梯度洗脱；所述第一洗脱剂为乙酸乙酯：甲醇：水的体积比从60：2：1至3：2：1的梯度洗脱剂；对获得的洗脱液进行tlc检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且rf值为0.60的洗脱组分；
[0015]
步骤5)：将步骤4)获得的洗脱组分，通过mci微孔树脂色谱柱进行分离，以第二洗脱剂进行梯度洗脱；所述第二洗脱剂为甲醇：水的体积比从0：100至100：0的梯度洗脱剂；对获得的洗脱液进行tlc检视，采用体积比为6：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取10％硫酸乙醇显色为紫色，且rf值为0.4的洗脱组分；
[0016]
步骤6)：将步骤5)获得的洗脱组分，通过反相c-18硅胶层析分离获得上述式(i)的齐墩果烷型三萜皂苷化合物。
[0017]
优选的，在所述步骤2)中，对所述步骤1)获取的粉末，采用体积浓度为90％的乙醇，在85～95℃的温度下加热回流提取至少3次，每次至少1.5小时，将过滤获得的提取液减压浓缩后获得所述总浸膏。
[0018]
优选的，在所述步骤6)中，所述反相c-18硅胶层析分离使用的流动相为乙腈：含0.1％wt三氟乙酸的水溶液的体积比为20:80的洗脱剂。
[0019]
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述式(i)的齐墩果烷型三萜皂苷化合物和药学上接受的载体。
[0020]
本发明再一方面提供了上述式(i)的齐墩果烷型三萜皂苷化合物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
[0021]
优选的，所述应用为在制备治疗或预防乳腺癌药物中的应用。
[0022]
本发明涉及一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域；本发明的发明人从丁葵草中分离得到一种新的齐墩果烷型三萜皂苷化合物，并在进一步的药效研究过程中意外地发现该化合物能够显著抑制乳腺癌细胞的增值，具有抗肿瘤方面的活性；因此，本发明的式(i)结构式的齐墩果烷型三萜皂苷化合物及其药物组合物未来具有治疗或预防癌症，特别是治疗或预防乳腺癌的临床应用前景。
附图说明
[0023]
图1为本发明式(i)化合物的高分辨质谱；
[0024]
图2为本发明式(i)化合物的氢谱；
[0025]
图3为本发明式(i)化合物的碳谱和dept谱；
[0026]
图4为本发明式(i)化合物的1h-1
h cosy谱；
[0027]
图5为本发明式(i)化合物的hsqc谱；
[0028]
图6为本发明式(i)化合物的hmbc谱；
[0029]
图7为本发明式(i)化合物的roesy谱；
[0030]
图8为本发明式(i)化合物的紫外吸收图谱；
[0031]
图9为本发明式(i)化合物的红外图谱。
具体实施方式
[0032]
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
[0033]
以下实施例中采用的仪器与试剂：
[0034]
核磁共振仪：bruckeravance drx-600型
[0035]
质谱仪：waters-zq2000；
[0036]
红外光谱仪：brukervector 22；
[0037]
旋光仪：autopolvi90079；
[0038]
高效液相色谱仪：agilent 1100，带四元泵，自动进样器和dad检测器；
[0039]
柱层析填料：柱层析硅胶(200-300，300-400目)与硅藻土均为青岛海洋化工厂产品；
[0040]
rp-c18反相硅胶柱：rp-18(40-63μm)，merck公司；
[0041]
层析硅胶板：hsgf
254
硅胶板，烟台江友硅胶开发有限公司产品；
[0042]
植物来源：
[0043]
丁葵草药材购于广西省宜州市石别镇。
[0044]
实施例1
[0045]
从植物丁葵草中提取新化合物
[0046]
步骤1)：获取丁葵草地上部分，经粉碎后过筛获得3.0kg的粉末(粉末的目数小于等于10目)。
[0047]
步骤2)：对步骤1)获取的粉末，采用乙醇进行回流提取，将获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏。
[0048]
在本技术的一个具体实施方案中，回流提取的溶剂采用纯度为90％v/v的乙醇。
[0049]
在本技术的一个更优选的实施方案中，对所述步骤1)获取的粉末，采用纯度为90％v/v的乙醇，在85～95℃的温度下加热回流提取至少3次，每次至少1.5小时，将过滤获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏。
[0050]
一般来说，回流提取的溶剂的量远大于样品的量。具体在本实施例中，每次回流提取的溶剂的重量是粉末样品的5倍以上。
[0051]
步骤3)：将所述步骤2)获得的总浸膏分散于水中，依次采用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，获取正丁醇相提取物。
[0052]
具体在本实施例中，依次采用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，获得了石油醚相提取物约30g，乙酸乙酯相提取物约60g和正丁醇相提取物约90g。
[0053]
步骤4)：将步骤3)获得的正丁醇相提取物，过硅胶柱层析分离。
[0054]
具体在本实施例中，将步骤3)获得的正丁醇相提取物约90g，经硅胶柱层析分离；硅胶柱层析使用第一洗脱剂进行梯度洗脱，具体在本实施例中，所述第一洗脱剂为乙酸乙酯：甲醇：水的体积比从60：2：1至3：2：1的梯度洗脱剂(即梯度洗脱剂中的甲醇和水的体积没有发生改变，仅乙酸乙酯的体积发生梯度变化)。
[0055]
对硅胶柱层析获得的洗脱液进行tlc检视，采用体积比为8:1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了4个组分(按照rf值由低到高，依次命名为a、b、c和d组分)；同时对它们进行10％硫酸乙醇溶液显色实验；其中，显色为紫色，且显色效果最强的(即含皂苷类化合物浓度最高的组分)，为rf值为0.60的d洗脱组分。
[0056]
具体在本实施例中获得了约5.2g的d洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
[0057]
步骤5)：将步骤4)获得的d洗脱组分，通过mci微孔树脂色谱柱进行分离。
[0058]
具体在本实施例中，将步骤3)获得的5.2g的d洗脱组分，过mci微孔树脂色谱柱，以第二洗脱剂进行梯度洗脱；第二洗脱剂为甲醇：水的体积比从0：100至100：0的梯度洗脱剂。
[0059]
对经过mci微孔树脂色谱柱分离获得的洗脱液进行tlc检视，采用体积比为6:1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了4个组分(按照rf值由低到高，依次命名为d1、d2、d3和d4组分)；同时对他们进行硫酸乙醇(含10％v/v的硫酸的乙醇溶液)显色实验，其中显色为紫色，且显色效果最强的(即含皂苷类化合物浓度最高的组分)，为rf值为0.4的d2洗脱组分。
[0060]
具体在本实施例中获得了约1.6g的d2洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
[0061]
步骤6)：将步骤5)获得的d2洗脱组分，通过反相c-18硅胶层析分离。
[0062]
具体在本实施例中，反相c-18硅胶层析分离使用的流动相为乙腈：含0.1％wt三氟乙酸的水溶液的体积比为20:80的洗脱剂。
[0063]
经反相c-18硅胶层析分离，减压干燥处理后，获得15mg无定型粉末。
[0064]
产品鉴定
[0065]
将上述实施例1获得的无定型粉末进行产品鉴定。
[0066]
实施例1获得的无定型粉末，可溶于甲醇。
[0067]
实施例1获得的无定型粉末，高分辨质谱如图1所示；从图中分析出：高分辨质谱m/z 1061.5892[m h]

，提示其分子式为c
53h89o21
(分子量计算值为1061.5896)。
[0068]
实施例1获得的粉末的核磁数据如下表1所示：
[0069]
表1化合物zordiphyllosidei的氢谱和碳谱数据
[0070]
[0071]
[0072][0073]
从表1的核磁数据可知，该化合物含有53个碳原子，其中30个碳原子为苷元结构，23个碳原子为糖单元结构。通过对核磁数据的详细分析，发现该化合物氢谱中具有7个单峰甲基质子信号，δ
h 1.34,1.03,0.86,1.18,1.37,0.89,和1.05，同时对应7个sp3杂化的碳原子信号δ
c 28.2,17.0,15.8,17.1,27.3,33.5和24.5。化学位移在δ
h 5.34的烯氢质子信号和δ
c 123.1的碳信号表明该化合物含有一个双键。
[0074]
实施例1获得的粉末的氢谱如图2所示，碳谱和dept谱如图3所示，1h-1
h cosy谱如图4所示，hsqc谱如图5所示，hmbc谱如图6所示，roesy谱如图7所示，紫外吸收图谱如图8所示，红外图谱如图9所示。
[0075]
红外光谱显示该化合物含有羟基(3358cm-1
)。
[0076]
roesy谱中的h-3,h-23,h-5,h-9,h-27,h-16和h-29的相关信号表明这些质子为α构型，同时h-24,h-25,h-26,h-28,h-18和h-30的相关信号表明这些质子为β构型。
[0077]
通过上述信息可以确定该化合物的苷元是一个具有12-烯齐墩果烷型的三萜。
[0078]
另外，通过核磁数据可知该化合物中含有4个糖单元，4个糖端基氢的化学位移及耦合常数分别为δ
h 4.94(1h,d,j＝7.7hz),6.44(1h,brs),5.18(1h,d,j＝7.4hz)和4.84(1h,d,j＝7.4hz)，端基碳的化学位移分别是δc106.8,101.6,107.3和103.2。通过进一步水解与相应的单糖标准品比对发现四个单糖分别为2个d-葡萄糖，1个l-鼠李糖和1个d-木糖。
[0079]
通过对hmbc谱分析可以，葡萄糖1位氢原子δ
h 4.94与三萜3位的碳原子δ
c 88.8的相关信号，以及与三萜3位的氢原子δ
h 3.39与葡萄糖1位碳原子δ
c 107.3表明葡萄糖结构通过氧桥连接在苷元的3位上。同时鼠李糖1位氢原子δ
h 6.44与葡萄糖4位碳原子δ
c 79.1和木糖1位氢原子δ
h 5.18与鼠李糖4位碳原子δ
c 85.2的相关信号说明木糖通过1
→
4连接与鼠李糖相连，鼠李糖通过1
→
4连接与葡萄糖相连。这个由三个糖组成的糖链连接与三萜皂苷的3位碳原子。另外一个葡萄糖的端基氢原子δ
h 4.84与苷元28位碳原子δc74.5存在hmbc远程相关信号，说明另外一个葡萄糖连接在苷元的28位碳原子。
[0080]
通过上述信息，我们将该化合物鉴定为下述式(i)化合物：
[0081][0082]
查阅scifinder后，该化合物为首次从天然界发现的新化合物，最终发明人将该化合物命名为齐墩果烷型三萜皂苷化合物(zordiphylloside i)。
[0083]
效果数据
[0084]
发明人意外发现上述式(i)结构的zordiphylloside i具有可以抑制人乳腺癌细胞(mcf-7)增殖的生物学活性，并进行了下述实验进行效果验证。
[0085]
人乳腺癌细胞(mcf-7)购自上海中科院细胞库，分别用含10％胎牛血清的dmem培养基培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0086]
以细胞密度5000个/孔接种于96孔板，24h后分别加入不同浓度的本发明的齐墩果烷型三萜皂苷化合物(该化合物终浓度分别为5、25、50、100μm)并置于5％co2培养箱中37℃继续培养。
[0087]
空白对照组：按照相同培养条件，添加相同量的培养基；
[0088]
模型对照组：按照相同培养条件，加入与化合物等体积的dmso空白溶液。
[0089]
培养72h后吸去原有培养基,每孔加入100μl含10％细胞计数溶液cck-8(cell counting kit-8)液的培养基,放入5％co2培养箱中37℃继续培养1h,在酶标仪(glomaxmuiti ，promega,e8032,usa)450nm波长处测量各孔的吸光度，用spss 20.0分析工具计算ic
50
值。具体实验数据详见表2。
[0090]
表2zordiphylloside i抑制mcf-7细胞增殖实验的吸光值结果(450nm)
[0091][0092]
通过表2中数据可以看出，本发明的齐墩果烷型三萜皂苷化合物具有显著抑制mcf-7细胞增殖的作用，具体来说，本发明的齐墩果烷型三萜皂苷化合物抑制mcf-7细胞增殖的ic
50
值为26.52μm。
[0093]
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可
以理解的其他实施方式。
[0094]
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。