一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药生产技术领域，尤其是涉及一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法。
背景技术：
2.溶栓治疗是使用药物使血栓溶解，达到血管再通的目的，从而使受阻的血管灌流区域的脑组织重新获得血氧供应。由于纤维蛋白是血栓的一个重要成分，所以，目前主要使用溶解纤维蛋白的药物，进行溶栓治疗。注射用替奈普酶是最新一代溶栓药物，由于其能特异地与血栓中的纤维蛋白结合，达到局部溶栓，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等破坏作用较小，克服了早期溶栓药物链激酶、尿激酶等由于激活全身纤溶系统所带来的潜在的出血危险。同时本品还具有高度的纤维蛋白特异性，能显著减少溶栓时的出血不良反应；且其半衰期长，仅需单次静脉推注给药即可，使用方便，可用于入院前急救。
3.注射用替奈普酶在生产过程中离不开cho细胞培养技术，目前常用的cho细胞培养工艺主要有两种：一种是在培养皿中通过贴壁方式小规模、手动的进行细胞培养，如市面上常见的corning公司的pe包被塑料培养皿，该装置具有生产成本低、操作简便、细胞生长状态稳定等特点；另一种是近年来在上述技术的基础上开发的可进行贴壁细胞规模化扩增的细胞工厂，其也被广泛应用于疫苗生产、抗体制备等研究和应用领域；然而，在实际生产中上述两种细胞培养方式都存在一定的不足，其中培养皿空间利用率低、人工操作效率低的缺点导致其无法进行大规模应用，而细胞工厂中的细胞难以进行观测和调整，导致其生长过程中易出现细胞分布不均，单位面积细胞产率明显低于培养皿。
4.因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法；该方法工艺稳定，传代培养效率高，且批间一致性较好，占地面积小，成本低，可以进行规模化生产。
6.为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
7.一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法，包括如下步骤：
8.步骤1：取工作细胞，进行水浴解冻，得到细胞液；而后将细胞液加入含有预热复苏培养基的离心管中进行离心，5-7min后，弃上清液，在离心管中加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液；
9.步骤2：将所述细胞悬浮液接种至方瓶中进行复苏培养，待方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上后，将复苏的细胞接种至细胞工厂内进行扩增培养；待所述细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x109个后，收集细胞悬液将其接种至生物反应器内进行灌流培养；
10.步骤3：调整生物反应器的培养参数，而后在生物反应器内灌流罐扩增培养基，进
行灌流培养，待所述生物反应器内的葡萄糖消耗量达到要求时，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，进行灌流培养并进行培养上清液的收获。
11.优选的，所述步骤1中，水浴解冻的温度为37-40℃。
12.优选的，所述步骤2中，进行扩增培养的过程中，依次使用一套1-3层、10-13层、40-50层的细胞工厂培养瓶进行逐级放大培养。
13.优选的，所述步骤2中，进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为imdm液体培养基，其组分为4-10％dfbs、1-3x10-6
mmtx、2-4g/l碳酸氢钠。
14.优选的，所述步骤3中，所述生物反应器为固定床式生物反应器，其内部聚酯片装量为800-1500g。
15.优选的，所述步骤3中，生物反应器的培养参数为：temp 37
±
1℃、agit 90～120rpm、ph7.10～7.40、do 30％～90％、gas 0.4～5.0slpm。
16.优选的，所述步骤3中，所述罐扩增培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、1-3x10-6
mmtx。
17.优选的，所述步骤3中，所述罐收获培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、2-4mg/l抑肽酶。
18.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19.本发明通过采用细胞工厂和生物反应器相结合的方法进行细胞培养，简化了操作步骤，减少了培养空间的占用，同时降低了培养时间，从而提高了培养效率，降低了培养成本；同时本发明所采用的方法传代培养效率高，且批间一致性较好，使用相对规模设备和空间即可达到2000l到4000l上清液生产规模。
具体实施方式
20.为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
21.本发明提供的一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法；包括如下步骤：
22.步骤1：取工作细胞，置于37
±
0.5℃的水浴中，摇动直至全部融化，得到细胞液；而后在无菌条件下将细胞液快速加入装有10倍体积预热复苏培养基的15ml离心管中，以800-1000rpm速率离心5-7分钟后，弃上清液，然后在离心管内再次加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液。
23.步骤2：将上述细胞悬浮液加入至t75方瓶中，并在t75方瓶内加入40ml含10％血清的培养基，并将t75方瓶置于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养，6-12小时后在无菌条件下更换培养基；培养2～3天后，待t75方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上，将复苏的细胞接种至细胞工厂培养瓶中进行扩增培养；其中进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为imdm液体培养基，其组分为4-10％dfbs、1-3x10-6
mmtx、2-4g/l碳酸氢钠；
24.细胞工厂扩增的操作步骤如下：
25.步骤a：从二氧化碳培养箱取出t75方瓶，擦拭消毒后传入层流罩下，将t75方瓶中的培养液倒入烧杯中，而后在烧杯中加入hbss溶液(1个t75瓶对应4ml hbss溶液)，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；然后再加入0.25％胰酶溶液(1个t75瓶对应4ml hbss溶液)，浸
过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察烧杯内的细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基10ml终止，并摇匀；接着取样计数，并分装至1层细胞工厂内，同时在1层细胞工厂内补入400ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
26.步骤b：3-5天后，取长满细胞的1层细胞工厂，在无菌条件下，将细胞工厂内的培养液吸取到烧杯内，而后在烧杯内加入0.25％胰酶溶液40ml，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基400ml终止，并摇匀；而后取样计数，并分装至10层细胞工厂内，同时在10层细胞工厂内补入3200ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
27.步骤c：3-5天后，取长满细胞的10层细胞工厂，在无菌条件下，将细胞工厂内的培养液吸取到烧杯内，而后在烧杯内加入0.25％胰酶溶液360ml，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基3600ml终止，并摇匀；而后取样计数，并分装至2个40层细胞工厂，同时在每个40层细胞工厂内补12600ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
28.步骤d：3-5天后，待40层细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x109个后，在无菌条件下，将40层细胞工厂内的细胞悬液全部吸取到2l接种瓶内，进行取样计数；而后将细胞悬液接种生物反应器内进行灌流培养。
29.步骤3：采用美国nbs公司40l bioflo510celliggen plus填充床生物反应器；其工作体积30l，disk 1250克，接种量1.0
×
10
10
cells；设置培养条件：temp 37℃、agit 90～120rpm、ph7.40
±
0.5、do 35～80％、gas 0.4～5.0slpm；当生物反应器内的葡萄糖的含量降到2～3g/l时，开始灌流罐扩增培养基；随着生物反应器内葡萄糖消耗量的逐渐增加，相应的扩大灌流量，扩增培养8～10天；当葡萄糖消耗量达到400～600g/24h，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，开始灌流培养并进行培养上清液的收获；当葡萄糖消耗量到降到0.9-1.5g/l，停止灌流，罐培养收获周期不超过65天。
30.其中，步骤3中，所述罐扩增培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、1-3x10-6
mmtx；罐扩增培养基每日最大使用量可达2-3倍罐体积，总使用量约为8-12倍罐体积。
31.所述罐收获培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、2-4mg/l抑肽酶；罐收获培养基每日最大灌流量可达2-3倍罐体积，总收获量根据细胞生长情况及糖值来确定，使用量在2000l-4000l。
32.本发明所采用的细胞培养工艺中，细胞工厂的单层培养面积是632平方厘米，一个10层细胞工厂相当于80.5个10厘米培养皿或者36.1个175培养瓶；不仅大大的简化了操作步骤，而且减少了培养空间以及培养时间，同时极大的降低了多次开盖引入染菌的风险，细胞培养过程中活率＞90％；具有效率高，成本低的优点；更重要的是，线性放大保持绝佳的一致性，无需花费精力摸索工艺放大过程，极大缩短pd周期；而使用40l大规模生物反应器培养具有生产规模大、细胞生长密度高、培养基利用效率高等突出优点，能降低生产周期，且批间一致性高，能够连续稳定实现2000-4000l规模上清生产。
33.通过采用本发明的方法培养细胞生产注射用替奈普酶重组蛋白，注射用替奈普酶重组蛋白的表达量在10-20mg/l，且表达的目的蛋白结构稳定。
34.所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本
文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
技术领域
1.本发明涉及生物医药生产技术领域，尤其是涉及一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法。
背景技术：
2.溶栓治疗是使用药物使血栓溶解，达到血管再通的目的，从而使受阻的血管灌流区域的脑组织重新获得血氧供应。由于纤维蛋白是血栓的一个重要成分，所以，目前主要使用溶解纤维蛋白的药物，进行溶栓治疗。注射用替奈普酶是最新一代溶栓药物，由于其能特异地与血栓中的纤维蛋白结合，达到局部溶栓，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等破坏作用较小，克服了早期溶栓药物链激酶、尿激酶等由于激活全身纤溶系统所带来的潜在的出血危险。同时本品还具有高度的纤维蛋白特异性，能显著减少溶栓时的出血不良反应；且其半衰期长，仅需单次静脉推注给药即可，使用方便，可用于入院前急救。
3.注射用替奈普酶在生产过程中离不开cho细胞培养技术，目前常用的cho细胞培养工艺主要有两种：一种是在培养皿中通过贴壁方式小规模、手动的进行细胞培养，如市面上常见的corning公司的pe包被塑料培养皿，该装置具有生产成本低、操作简便、细胞生长状态稳定等特点；另一种是近年来在上述技术的基础上开发的可进行贴壁细胞规模化扩增的细胞工厂，其也被广泛应用于疫苗生产、抗体制备等研究和应用领域；然而，在实际生产中上述两种细胞培养方式都存在一定的不足，其中培养皿空间利用率低、人工操作效率低的缺点导致其无法进行大规模应用，而细胞工厂中的细胞难以进行观测和调整，导致其生长过程中易出现细胞分布不均，单位面积细胞产率明显低于培养皿。
4.因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法；该方法工艺稳定，传代培养效率高，且批间一致性较好，占地面积小，成本低，可以进行规模化生产。
6.为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
7.一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法，包括如下步骤：
8.步骤1：取工作细胞，进行水浴解冻，得到细胞液；而后将细胞液加入含有预热复苏培养基的离心管中进行离心，5-7min后，弃上清液，在离心管中加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液；
9.步骤2：将所述细胞悬浮液接种至方瓶中进行复苏培养，待方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上后，将复苏的细胞接种至细胞工厂内进行扩增培养；待所述细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x109个后，收集细胞悬液将其接种至生物反应器内进行灌流培养；
10.步骤3：调整生物反应器的培养参数，而后在生物反应器内灌流罐扩增培养基，进
行灌流培养，待所述生物反应器内的葡萄糖消耗量达到要求时，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，进行灌流培养并进行培养上清液的收获。
11.优选的，所述步骤1中，水浴解冻的温度为37-40℃。
12.优选的，所述步骤2中，进行扩增培养的过程中，依次使用一套1-3层、10-13层、40-50层的细胞工厂培养瓶进行逐级放大培养。
13.优选的，所述步骤2中，进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为imdm液体培养基，其组分为4-10％dfbs、1-3x10-6
mmtx、2-4g/l碳酸氢钠。
14.优选的，所述步骤3中，所述生物反应器为固定床式生物反应器，其内部聚酯片装量为800-1500g。
15.优选的，所述步骤3中，生物反应器的培养参数为：temp 37
±
1℃、agit 90～120rpm、ph7.10～7.40、do 30％～90％、gas 0.4～5.0slpm。
16.优选的，所述步骤3中，所述罐扩增培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、1-3x10-6
mmtx。
17.优选的，所述步骤3中，所述罐收获培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、2-4mg/l抑肽酶。
18.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19.本发明通过采用细胞工厂和生物反应器相结合的方法进行细胞培养，简化了操作步骤，减少了培养空间的占用，同时降低了培养时间，从而提高了培养效率，降低了培养成本；同时本发明所采用的方法传代培养效率高，且批间一致性较好，使用相对规模设备和空间即可达到2000l到4000l上清液生产规模。
具体实施方式
20.为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
21.本发明提供的一种cho细胞贴壁连续灌流罐培养方法；包括如下步骤：
22.步骤1：取工作细胞，置于37
±
0.5℃的水浴中，摇动直至全部融化，得到细胞液；而后在无菌条件下将细胞液快速加入装有10倍体积预热复苏培养基的15ml离心管中，以800-1000rpm速率离心5-7分钟后，弃上清液，然后在离心管内再次加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液。
23.步骤2：将上述细胞悬浮液加入至t75方瓶中，并在t75方瓶内加入40ml含10％血清的培养基，并将t75方瓶置于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养，6-12小时后在无菌条件下更换培养基；培养2～3天后，待t75方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上，将复苏的细胞接种至细胞工厂培养瓶中进行扩增培养；其中进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为imdm液体培养基，其组分为4-10％dfbs、1-3x10-6
mmtx、2-4g/l碳酸氢钠；
24.细胞工厂扩增的操作步骤如下：
25.步骤a：从二氧化碳培养箱取出t75方瓶，擦拭消毒后传入层流罩下，将t75方瓶中的培养液倒入烧杯中，而后在烧杯中加入hbss溶液(1个t75瓶对应4ml hbss溶液)，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；然后再加入0.25％胰酶溶液(1个t75瓶对应4ml hbss溶液)，浸
过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察烧杯内的细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基10ml终止，并摇匀；接着取样计数，并分装至1层细胞工厂内，同时在1层细胞工厂内补入400ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
26.步骤b：3-5天后，取长满细胞的1层细胞工厂，在无菌条件下，将细胞工厂内的培养液吸取到烧杯内，而后在烧杯内加入0.25％胰酶溶液40ml，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基400ml终止，并摇匀；而后取样计数，并分装至10层细胞工厂内，同时在10层细胞工厂内补入3200ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
27.步骤c：3-5天后，取长满细胞的10层细胞工厂，在无菌条件下，将细胞工厂内的培养液吸取到烧杯内，而后在烧杯内加入0.25％胰酶溶液360ml，浸过全部细胞，5～10s后弃去溶液；观察细胞，待细胞成流沙状流下时，在烧杯内加入扩增培养基3600ml终止，并摇匀；而后取样计数，并分装至2个40层细胞工厂，同时在每个40层细胞工厂内补12600ml扩增培养基，盖好盖，编号，在37
±
1℃的培养箱内培养；
28.步骤d：3-5天后，待40层细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x109个后，在无菌条件下，将40层细胞工厂内的细胞悬液全部吸取到2l接种瓶内，进行取样计数；而后将细胞悬液接种生物反应器内进行灌流培养。
29.步骤3：采用美国nbs公司40l bioflo510celliggen plus填充床生物反应器；其工作体积30l，disk 1250克，接种量1.0
×
10
10
cells；设置培养条件：temp 37℃、agit 90～120rpm、ph7.40
±
0.5、do 35～80％、gas 0.4～5.0slpm；当生物反应器内的葡萄糖的含量降到2～3g/l时，开始灌流罐扩增培养基；随着生物反应器内葡萄糖消耗量的逐渐增加，相应的扩大灌流量，扩增培养8～10天；当葡萄糖消耗量达到400～600g/24h，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，开始灌流培养并进行培养上清液的收获；当葡萄糖消耗量到降到0.9-1.5g/l，停止灌流，罐培养收获周期不超过65天。
30.其中，步骤3中，所述罐扩增培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、1-3x10-6
mmtx；罐扩增培养基每日最大使用量可达2-3倍罐体积，总使用量约为8-12倍罐体积。
31.所述罐收获培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/l碳酸氢钠、1.5-2.5g/l葡萄糖、2-5％dfbs、2-4mg/l抑肽酶；罐收获培养基每日最大灌流量可达2-3倍罐体积，总收获量根据细胞生长情况及糖值来确定，使用量在2000l-4000l。
32.本发明所采用的细胞培养工艺中，细胞工厂的单层培养面积是632平方厘米，一个10层细胞工厂相当于80.5个10厘米培养皿或者36.1个175培养瓶；不仅大大的简化了操作步骤，而且减少了培养空间以及培养时间，同时极大的降低了多次开盖引入染菌的风险，细胞培养过程中活率＞90％；具有效率高，成本低的优点；更重要的是，线性放大保持绝佳的一致性，无需花费精力摸索工艺放大过程，极大缩短pd周期；而使用40l大规模生物反应器培养具有生产规模大、细胞生长密度高、培养基利用效率高等突出优点，能降低生产周期，且批间一致性高，能够连续稳定实现2000-4000l规模上清生产。
33.通过采用本发明的方法培养细胞生产注射用替奈普酶重组蛋白，注射用替奈普酶重组蛋白的表达量在10-20mg/l，且表达的目的蛋白结构稳定。
34.所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本
文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
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