一种用于培养MDCK细胞及扩增病毒的组合培养基及其应用的制作方法

一种用于培养mdck细胞及扩增病毒的组合培养基及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于培养mdck细胞及扩增病毒的组合培养基及其应用。


背景技术：

2.病毒（biological virus）是一种个体微小、结构简单、只含一种核酸（dna或rna）、必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物，同时，病毒也是常见的病原。由于病毒没有细胞结构，仅由遗传物质核酸和蛋白质外壳组成。因此，其一切生命活动必须依赖宿主细胞，即病毒的扩增必须依赖于宿主细胞。
3.犬肾(madin-darby canine kidney cells，mdck)细胞由madin和darby分离培育建立，具有培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高等优点，可以用于扩增病毒。
4.然而，目前利用mdck细胞培养病毒的培养基和方法仍有待研究。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地利用低血清mdck细胞培养基贴壁培养mdck细胞并结合病毒维持液以扩增病毒的方法。
6.本技术是基于发明人的下列发现而完成的：传统的mdck细胞培养方式是在含有10%左右血清的mem培养基中贴壁生长，血清能够为细胞的生长增殖提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质。但是血清的成分复杂，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。另外，利用含血清培养基培养细胞获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍，残留的血清进入人体内会不可避免地引发不必要的免疫反应。
7.有鉴于此，发明人结合之前在细胞培养领域积累的丰富经验，进行了大量的筛选和优化工作，在减少血清用量的前提下，意外获得了一种添加在mem培养基中的添加剂，利用添加有该添加剂的mem培养基可以在低血清条件下更快地完成对mdck细胞的驯化适应，支持mdck细胞在固定床生物反应器内高密度贴壁培养，细胞活率高，结团率低，能够在多项指标上获得优异表现，同时提高了被病毒感染能力，有助于病毒感染。进一步地，为了能够使得病毒感染细胞后更好地扩增，发明人经过大量实验筛选和优化获得了一种病毒维持液，感染细胞后的病毒可以在该病毒维持液中有效扩增，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产，提高生产效率。
8.为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于扩增病毒的组合培养基。根据本发明的实施例，所述用于扩增病毒的组合培养基包括：用于贴壁培养mdck细胞的培养基；病毒维持液；其中，所述用于贴壁培养mdck细胞的培养基包括：mem培养基；3~5体积%的血清；添加剂，所述添加剂包括：65.2重量份的l-丙氨酸；55.384重量份的l-盐酸精氨酸；11.08重量份的l-天门冬氨酸；27.04重量份的l-门冬酰胺；13重量份的l-半胱氨酸盐酸盐
一水合物；20重量份的l-胱氨酸二盐酸盐；75.944重量份的l-谷氨酸；105.784重量份的l-谷氨酰胺；36.928重量份的甘氨酸；5.704重量份的l-盐酸组氨酸一水合物；22.4重量份的l-羟脯氨酸；15.92重量份的l-异亮氨酸；20.4重量份的l-亮氨酸；21.472重量份的l-盐酸赖氨酸；12.944重量份的l-甲硫氨酸；7.872重量份的l-苯丙氨酸；40.424重量份的l-脯氨酸；39.184重量份的l-丝氨酸；6.224重量份的l-苏氨酸；4.144重量份的l-色氨酸；14.44重量份的l-缬氨酸；695.2重量份的丙氨酰谷氨酰胺；83重量份的丙酮酸钠；960重量份的hepes；640重量份的大豆水解物；640重量份的酵母水解物；196.4重量份的无水磷酸氢二钠；1590.384重量份的d-无水葡萄糖；0.208重量份的还原型谷胱甘肽；0.248重量份的七水硫酸亚铁；0.272重量份的七水硫酸锌；1.2重量份的维生素c；13.32重量份的氯化胆碱；0.504重量份的d-泛酸钙；0.46重量份的叶酸；13.4424重量份的肌醇；0.02重量份的九水硝酸铁；0.5重量份的氯化锂；2.2重量份的柠檬酸；4重量份的牛磺酸；0.8重量份的重组人胰岛素；4重量份的柠檬酸铁；0.96重量份的乙醇胺；0.84重量份的edta；1.112重量份的烟酰胺；1.0344重量份的维生素b6；0.328重量份的维生素b1；2.552重量份的维生素b12；6.4重量份的无水l-酪氨酸二钠盐；0.00104重量份的五水硫酸铜；33.52重量份的六水氯化镁；0.072重量份的d-生物素；1.432重量份的次黄嘌呤；0.0496重量份的亚油酸；0.168重量份的硫辛酸；0.048重量份的1，4-丁二胺二盐酸盐；0.104重量份的维生素b2；0.312重量份的胸苷；0.208重量份的对氨基苯甲酸；0.00016006重量份的氯化铝；0.000460172重量份的乙酸钡；0.000200075重量份的六水氯化钴；1.6006e-05重量份的四水氯化锰；0.000600224重量份的氟化钠；0.000140052重量份的氯化亚锡；0.000140052重量份的氯化镉；6.00224e-05重量份的二氧化锗；0.004重量份的亚硒酸钠；0.000800299重量份的九水偏硅酸钠；2.00075e-05重量份的氯化镍；4.00149e-05重量份的偏钒酸铵；5.00e-06重量份的溴化钾；1.6006e-05重量份的碘化钾；8.00e-07重量份的氯化铷；1.00037e-05重量份的钼酸铵；6.00e-07重量份的硝酸银；0.06重量份的腺嘌呤；0.02重量份的盐酸鸟嘌呤；0.01重量份的维生素d2；0.1328重量份的维生素e；0.016重量份的维生素a醋酸酯；0.0024重量份的5-氨基-4-甲酰胺咪唑；0.004重量份的烟酸；0.06重量份的2d-脱氧核糖；0.0008重量份的氢化可的松；0.016184561重量份的肉豆蔻酸；0.016184561重量份的油酸；0.016184561重量份的棕榈酸；0.016184561重量份的硬脂酸；0.0048重量份的egf；0.0024重量份的igf；所述病毒维持液包括：所述用于贴壁培养mdck细胞的培养基且不含有大豆水解物、酵母水解物、egf和igf。
9.根据本技术的实施例，本技术的发明人发现不同细胞所适用的培养条件的通用性差，需要基于细胞自身的生长特性开发不同的培养方法，才能实现有效地细胞扩增或者培养。进而，发明人针对mdck细胞特性进行了大量的优化和筛选实验，获得了上述添加剂，将其添加至mem培养基中可以实现在低血清条件下培养mdck细胞，更快地完成对mdck细胞的驯化适应，支持mdck细胞在固定床生物反应器内高密度贴壁培养，细胞活率高，结团率低，能够在多项指标上获得优异表现，同时提高了被病毒感染能力，有助于病毒感染。进一步地，为了能够使得病毒感染细胞后更好地扩增，发明人经过大量实验筛选和优化获得了上述病毒维持液，在用于贴壁培养mdck细胞的培养基中减少了大豆水解物、酵母水解物、egf和igf，既可以使mdck细胞生长，也有助于病毒扩增，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产，提高生产效率。
10.在本发明的另一方面，本发明提出了一种扩增病毒的方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述用于扩增病毒的组合培养基中的用于贴壁培养mdck细胞的培养基，对mdck细胞进行贴壁培养；收集所述培养所得细胞并加入至前面述用于扩增病毒的组合培养基中的病毒维持液，得到细胞液；将病毒接种于所述细胞液中进行培养，以便对所述病毒进行扩增。由此，采用根据本发明实施例的方法培养所得mdck细胞培养液有助于实现病毒增殖，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产，提高生产效率。
11.根据本发明的实施例，所述病毒选自季节性流感病毒，如甲型流感病毒h1n1、h3n2，乙型流感病毒by、bv等。
12.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述扩增病毒的方法扩增病毒。由此，利用根据本发明实施例的方法可以获得高病毒滴度且高产量的疫苗，并且制备方法操作简便，产能高，适于规模化生产应用。
13.根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。由此，可以避免病毒进入机体产生不良反应。
14.根据本发明的实施例，所述疫苗选自人季节性流感疫苗、禽流感疫苗、猪流感疫苗。
15.术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的针对某一病原体或疾病的免疫性的活性组分的组合物，它将引起与被该病原体或该疾病感染有关的症状的严重程度、持续时间或其他表现的至少降低(多达完全缺乏)。受试者优选地是哺乳动物，例如猪、牛、羊、禽类、鼠或人类。
16.在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是通过前面所述制备疫苗的方法获得的。由此，根据本发明实施例的疫苗安全、有效，接种后不良反应小，适于推广应用。
17.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述疫苗在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。
18.根据本发明的实施例，所述病毒相关疾病选自人季节性流感、禽流感或猪流感疫苗。
19.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
20.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的mdck细胞在不同培养基中连续传代的细胞总量分析图；图2显示了根据本发明一个实施例的mdck细胞在不同培养基中连续传代倍增时间分析图；图3显示了根据本发明一个实施例的mdck接种h1n1病毒后使用不同维持液的毒效价分析图。
具体实施方式
21.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，其中，豌豆水解物（希凯生物，货号a2501）、大豆水解物（希凯生物，a1603）、酵母水解物（希凯生物，a1202）、重组人胰岛素（通化东宝）。
22.实施例11、配制培养基和病毒维持液1.1 mem培养基1.2 slm1培养基和slm2培养基在mem培养基中添加3%nbs和分别添加如下成分：
1.3 商品培养基
gibco（货号12559027），按使用说明配制。
23.1.4 病毒维持液a1和a2分别配置与slm1培养基和slm2培养基对应的病毒维持液a1和a2，区别在于，不含有大豆水解物、酵母水解物、重组人胰岛素、egf和igf。
24.1.5病毒维持液a3组成与slm1培养基相同。
25.2、细胞培养和检测用上述配制的slm1、slm2、商品培养基、mem 10%nbs，按照下列方式对mdck细胞进行贴壁培养：将mdck细胞按6
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106cells的量接种至t175方瓶，置于37℃、5%二氧化碳培养箱静置培养，48h后按上述细胞量接种至新培养瓶进行连续传代，记录培养48h的细胞总量，计算不同培养基培养的mdck细胞倍增时间。
26.不同培养基传代过程中细胞总量、细胞倍增时间如图1、2所示，在连续传代过程中，48h的细胞总量slm1＞商品培养基＞slm2＞mem 10%nbs；细胞倍增时间slm1＜商品培养基＜slm2＜mem 10%nbs。本发明的低血清培养基slm1，培养效果明显优于血清培养基，同时比市售商品培养基生长速度更快，满足mdck的高密度生长。
27.3、病毒接种及病毒滴度检测将分别使用slm1、slm1、slm2培养基培养的方瓶，细胞长满单层后用不含血清培养液清洗两次，分别更换a1、a3、a2病毒维持液，按照moi 0.001接种流感病毒（h1n1），接毒后24h、48h取样检测血凝效价ha。结果如图3所示，slm1 a1血凝效价均优于其他组合，mdck细胞感染病毒后可在本发明的病毒维持液中有效扩增，提高病毒效价。
28.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、
ꢀ“
示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
29.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。