用于糖尿病肾脏病变疾病诊断的试剂、产品及其应用的制作方法

1.本发明属于基因生物制剂领域，具体涉及用于糖尿病肾脏病变疾病诊断的试剂、产品及其应用。


背景技术：

2.糖尿病肾脏病变疾病是糖尿病最严重的并发症之一，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，dn)为糖尿病主要的微血管并发症，dn主要是指糖尿病性肾小球硬化症，一种以血管损害为主的肾小球病变。早期多无症状，血压可正常或偏高。其发生率随着糖尿病的病程延长而增高。糖尿病早期肾体积增大，肾小球滤过率增加，呈高滤过状态，逐渐出现间隙蛋白尿或微量白蛋白尿，随着病程的延长出现持续蛋白尿、水肿、高血压、肾小球滤过率降低，进而肾功能不全、尿毒症，是糖尿病主要的死亡原因之一。
3.dn是导致终末期肾脏病(end stage renal disease，esrd)的主要病因，一旦患者进展至esrd，需要接受肾脏替代以及肾移植治疗，其预后转归欠佳，且血糖波动、非杓型血压及夜间收缩压、血尿酸、维生素d水平、甲状腺功能异常等均是dn的进展风险，严重影响患者的生活质量，给家庭带来严重的经济负担，因此，阐明dn发生发展机制，发现和验证dn患者的早期诊断的非创伤性标志物具有非常重要的意义。
4.目前糖尿病肾病患者在临床上最常用的早期诊断标志物是微量白蛋白尿。但实际上，微量白蛋白尿作为诊断用标志物仍存在很多的不足和局限性，患者微量白蛋白尿的水平在临床中受到很多其他生理和病理因素的影响，如体温升高、饮食、体重等。其次，微量白蛋白尿的水平并稳定，如降压药物的使用可能降低微量白蛋白尿的水平，影响其对dn患者肾脏病变的判断；并且在dn的早期阶段，微量白蛋白尿的水平和糖尿病肾病的相关性较差。鉴于此，本领域亟需寻找到合适的可以用于诊断dn，尤其是早期诊断dn的标志物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，基于机器学习和多种统计分析方法提供一种能够用于糖尿病肾病早期筛查、诊断的试剂及产品，所述试剂及产品可用于糖尿病肾病的早期筛查诊断中，预测疾病的发生发展情况，为临床上早期诊断糖尿病肾病提供了一种辅助诊断方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一方面，本发明提供了用于检测样本中生物标志物的试剂在制备糖尿病肾病的诊断产品中的应用。
8.进一步，所述生物标志物为tnfaip6、runx3。
9.更进一步，所述样本选自血液或组织。
10.更进一步，所述样本来源于受试者，所述受试者优选为人。
11.更进一步，所述诊断产品包括检测样本中tnfaip6、runx3表达水平的试剂。
12.更进一步，所述试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测样本中tnfaip6、runx3表达水平的试剂。
13.更进一步，所述测序技术为核酸测序技术，包括链终止子(sanger)测序技术和染料终止子测序技术，本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此，在测序前通常将rna逆转录成dna，此外，所述测序技术还包括下一代测序技术(即深度测序/高通量测序技术)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。
14.更进一步，所述核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。
15.更进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt
‑
pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。
16.更进一步，所述蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心elisa，其中使用识别生物标志物tnfaip6、runx3上不同表位的两种抗体进行该生物标志物tnfaip6、runx3的检测；放射免疫测定(ria)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(elisa)、酶免疫测定(eia)、荧光免疫测定(fia)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。
17.更进一步，所述试剂选自：
18.特异性扩增tnfaip6、runx3的引物；或
19.特异性识别tnfaip6、runx3的探针；或
20.特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂。
21.更进一步，所述特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂包括所述蛋白的受体、针对蛋白的抗体、针对蛋白的肽抗体、结合蛋白的凝集素、双特异性双重结合剂或双特异性抗体。
22.更进一步，所述特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂为针对所述蛋白的抗体。
23.另一方面，本发明提供了一种糖尿病肾病的诊断产品。
24.进一步，所述诊断产品包括检测生物标志物tnfaip6、runx3的试剂。
25.进一步，所述试剂选自：
26.特异性扩增tnfaip6、runx3的引物；或
27.特异性识别tnfaip6、runx3的探针；或
28.特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂。
29.更进一步，所述特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂包括所述蛋白的受体、针对蛋白的抗体、针对蛋白的肽抗体、结合蛋白的凝集素、双特异性双重结合剂或双特异性抗体。
30.更进一步，所述特异性结合tnfaip6、runx3编码的蛋白的结合剂为针对所述蛋白的抗体。
31.进一步，所述诊断产品包括制剂、试剂盒、芯片、试纸条。
32.进一步，所述制剂为包含检测生物标志物tnfaip6、runx3的试剂的生物制剂；
33.更进一步，所述试剂盒包括elisa试剂盒、qpcr试剂盒、电化学发光检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒；
34.更进一步，所述试剂盒还包括如何对受试者是否患有糖尿病肾病或者患糖尿病肾病的风险的说明书。
35.进一步，所述诊断产品还包括对受试者样本进行处理的试剂。
36.再一方面，本发明提供了tnfaip6、runx3在构建预测糖尿病肾病的计算模型或嵌入了所述计算模型的系统中的应用；
37.其中，所述计算模型以tnfaip6、runx3的表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出糖尿病肾病的患病风险概率。
38.再一方面，本发明提供了一种诊断糖尿病肾病的装置。
39.进一步，所述装置包括处理器、输入模块、输出模块；
40.其中，处理器用于对输入的信息采用生物信息学方法进行逻辑运算；输入模块用于输入样本中tnfaip6、runx3的表达水平，包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在tnfaip6、runx3的输入表达水平上执行算法；输出模块用于输出受试者是否患有糖尿病肾病或者患有糖尿病肾病的风险。
41.有益效果：
42.本发明选择tnfaip6、runx3作为诊断用的基因标志物，可实现糖尿病肾病的快速有效的诊断，为临床医生提供了一种早期诊断糖尿病肾病的辅助诊断方法，进而为受试者提供警示，以实现早期的干预。
附图说明
43.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
44.图1显示tnfaip6、runx3基因mrna差异表达图，其中，图a：tnfaip6、训练集，图b：tnfaip6、验证集，图c：runx3、训练集，图d：runx3、验证集；
45.图2显示tnfaip6、runx3基因诊断糖尿病肾病的roc曲线图，其中，图a：tnfaip6、训练集，图b：tnfaip6、验证集，图c：runx3、训练集，图d：runx3、验证集；
46.图3显示tnfaip6 runx3联合诊断糖尿病肾病的roc曲线图，其中，图a：训练集，图b：验证集。
具体实施方式
47.在本发明的上下文中，术语“标志物”，同“生物标志物”、“基因标志物”，是指患者表型的指示物，例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性的指示物，其可以在所述患者的生物样本中检测到，生物标志物包括但不限于dna、rna、蛋白质、小分子代谢物质、糖类、基于糖脂的分子等；
48.在本发明的具体实施例中，所述标志物为tnfaip6和/或runx3，优选地，所述标志物为基因tnfaip6(tnf alpha induced protein 6，gene id：7130)和基因runx3(runx family transcription factor 3，gene id：864)，涵盖全长、未加工的基因、以及源自细胞中经加工的任何形式的基因，所述标志物涵盖所述基因的天然发生变体。所述基因tnfaip6
和基因runx3的详细信息可在h ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
49.在本发明的上下文中，术语“样本”，同“样品”、“受试者样本”，是指获自或衍生自目标受试者的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。术语“样本”包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于全血、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合。
50.在本发明的上下文中，术语“引物”，同“扩增引物”，是指包含5
‑
100个核苷酸的核酸片段，优选地，所述引物或扩增引物包含能起始酶促反应(例如，酶促扩增反应)的15
‑
30个核苷酸。
51.在本发明的上下文中，术语“探针”，是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，例如，包含5
‑
100个核苷酸，所述探针能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物。杂交探针上还可以包括用于检测的标记物。所述标记物包括但不限于用于荧光定量pcr或荧光原位杂交的标记物。
52.在本发明的上下文中，术语“试剂盒”，是指包含用于特异性检测本发明的生物标志基因或蛋白质的探针的制成品(例如，包装或容器)；
53.在某些实施方案中，该制成品作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。这类试剂盒可以包含区室化来紧密限制地容纳一个或多个容器手段(如小瓶、管等)的载体手段，每个容器手段包含将要在方法中使用的分开的组成部分之一。例如，容器手段之一可以包含进行可检测标或可以进行可检测标记的探针。这种探针可以是对包含基因表达特征的一个或多个基因的多核苷酸特异的多核苷酸。在试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒还可以具有包含用于扩增靶核酸序列的一种或多种核酸的容器和/或包含报道手段的容器，如生物素结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，结合于报道分子，如酶、荧光或放射性同位素标记；
54.试剂盒通常将包含上述容器和一个或多个其他容器，该其他容器包含商业和用户角度希望的物质，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。容器上可以存在标签来指示该组合物用于具体的治疗或非治疗性应用，且还可以指示体内或体外使用的方向，如上文所述的那些。试剂盒中的其他可选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。
55.在本发明的上下文中，术语“诊断”或“辅助诊断”，是指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类。例如，通过分子特征(例如，表征为特定基因或该基因所编码的蛋白质之一或其组合的表达)，鉴定是否患有糖尿病肾病以及患有糖尿病肾病的风险。
56.正如熟练技术人员会熟知的，可以以不同方式实施和实现将生物标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学
方法将标志物值的测定组合。
57.优选地，在生物标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于糖尿病肾病的风险或与有助于评估糖尿病肾病患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体进行分类入组，例如正常人、有患有糖尿病肾病风险的个体、患有糖尿病肾病的患者等等；b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物；c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值；d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
58.用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k
‑
最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估糖尿病肾病中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k
‑
最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
59.受试者工作特征曲线下面积(＝auc)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的受试者工作特征(roc)描述得最好。roc图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。
60.下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
61.实施例1与糖尿病肾病相关的生物标志物的研究
62.本研究的目的是基于机器学习分析筛选出与糖尿病肾病相关的生物标志物，并研究其对糖尿病肾病诊断或预测的价值。
63.1、研究方法
64.(1)研究所采用的数据及预处理的方法
65.在基因表达综合数据库(gene expression omnibus，geo数据库)中以“糖尿病肾病”为关键词，搜索与糖尿病肾病相关的公共基因表达数据及其完整的注释，根据公共基因表达数据中记载的临床信息，选择糖尿病肾病患者的临床样本信息。从geo数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载gse30122(正常:病例＝50：19)的基因表达数据，从geo数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载gse142153(正常:病例＝10：23)的基因表达数据，并利用注释文件对其进行注释；
66.使用fastp软件进行接头处理和质控，得到cleandata，使用icgc软件将cleandata比对至人类参考基因组(参考基因组的版本为grch38.d1.vd1)得到bam文件，使用htseq软件结合注释文件，对比对后bam文件进行基因的表达量的定量，根据基因的id，多样本的表达量合并构建m*n的基因表达量矩阵，多个探针对应同一个基因的取平均值作为其表达量，
将表达量矩阵保存为.rdata对象文件，将临床信息按照样本分组信息进行特征标记，将健康对照组样本命名为normal，将糖尿病肾病组样本命名为case；对数据进行分组，将gse30122来源的数据.rdata对象文件作为验证集，gse142153来源的数据.rdata对象文件作为训练集，分析与糖尿病肾病相关的生物标志物。
67.(2)健康对照组和糖尿病肾病组间的差异表达基因分析
68.根据步骤(1)中的分组，采用r软件中的“limma”包对健康对照组和糖尿病肾病组之间的差异表达基因进行分析，差异表达基因的筛选标准为adj.p.value<0.05，|log2fc|>0.5，筛选在健康对照组和糖尿病肾病组之间呈显著性差异表达的基因。
69.2、研究结果
70.经分析研究得到的结果显示，tnfaip6、runx3在健康对照组和糖尿病肾病组之间呈现显著性的差异表达，其中，相比于健康对照组而言，tnfaip6、runx3在糖尿病肾病组中表达均上调，其表达情况见图1a
‑
d。
71.实施例2对生物标志物tnfaip6、runx3的诊断效能进行评估分析
72.1、评估分析方法
73.使用r包“proc”绘制受试者工作曲线(roc)，分析经实施例1研究得到的在健康对照组和糖尿病肾病组之间呈现显著性的差异表达的生物标志物tnfaip6、runx3、tnfaip6 runx3的auc值、敏感性、特异性，判断指标的诊断效能。其中，在评估分析tnfaip6、runx3对糖尿病肾病的诊断效能时，使用基因的表达量(log2表达量)进行评估分析，选择最大的youden指数所对应的点作为其cutoff值，即最佳划分阈值通过youden指数最大的一点来确定；在评估分析tnfaip6 runx3对糖尿病肾病的诊断效能时，首先对基因tnfaip6 runx3进行logistics回归分析，在logistics回归分析中，自变量为tnfaip6 runx3，因变量为糖尿病肾病的患病情况，通过拟合出的回归曲线可以计算出每个个体患糖尿病肾病与否的概率，确定不同的概率划分阈值即可得到预测结果。最佳概率划分阈值通过youden指数最大的一点来确定，根据确定的概率划分阈值，可以计算得出tnfaip6 runx3联合在训练集和验证集的auc值、敏感性、特异性等。
74.2、评估分析结果
75.经评估分析的结果显示，tnfaip6 runx3联合用于诊断糖尿病肾病优于tnfaip6、runx3，不论是在训练集中，还是在验证集中，tnfaip6 runx3均显示出较高的诊断效能，auc值分别为0.843、0.849，且具有较高的敏感性和特异性(见表1、图2a
‑
d、图3a
‑
b)，证明了tnfaip6 runx3联合可用于糖尿病肾病的诊断中。
76.表1 tnfaip6、runx3在训练集和验证集中的auc值统计结果
77.78.以上实施例仅是本发明的优选实施方式，并不能用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。