一种金黄色葡萄球菌的富集培养方法和检测方法与流程

1.本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种利用纤维素磁珠进行金黄色葡萄球菌的富集培养和检测方法。


背景技术：

2.检测食品样本中的致病菌时，通常由于目标菌含量低以及干扰物质的存在，大大降低检测结果的灵敏度和特异性，需要预増菌和选择性增菌，这就延长了检测时间。为缩短预増菌时间，需要对细菌进行浓缩富集。当前市场上细菌富集的磁珠包括功能化磁珠、静电吸附磁珠和裸磁珠等。
3.功能化磁珠目前应用广泛的技术是免疫磁分离技术。基于磁性微珠的免疫磁分离法(ims)是将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集、磁分离。如中国专利cn103333818a公开了一种金黄色葡萄球菌分离的方法，其制备的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-抗体-sa复合物，借助树状分子的级联放大效应，将磁细菌信号成指数级扩大，在较低的磁场强度下就能实现磁细菌的分离，较常规免疫磁珠分离方法分离到目的菌能力更强。但是免疫磁分离中使用的抗体成本较为昂贵，且环境耐受能力差，方法繁琐操作复杂。
4.静电吸附磁珠能够吸附革兰氏阳性菌和阴性菌，但是不能特异性吸附细菌，操作复杂，耗时久，方法不够成熟。中国专利cn114774508a公开了一种磁珠富集金黄色葡萄球菌的方法，其制备得到金黄色葡萄球菌-头孢吡肟-聚氧乙烯二胺-磁性纳米粒子复合物，相比于基于氢键或静电相互作用力的识别元件功能化磁性纳米粒子，该聚氧乙烯二胺介导的头孢吡肟功能化磁性纳米粒子复合物与细菌相互作用力更稳定，可以将基质中的低浓度的细菌几乎都分离出来，提高金黄色葡萄球菌的捕获效率。但该磁性纳米粒子不能达到特异性吸附，且制备方法复杂，步骤繁多，仍是影响其推广的主要阻碍因素。


技术实现要素：

5.本发明提供一种金黄色葡萄球菌的富集培养和检测方法，对金黄色葡萄球菌能够达到特异性吸附，方法简单易行，大大缩短检测时间。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种金黄色葡萄球菌的富集培养方法，包括以下步骤：将纤维素磁珠用无菌水重复洗涤，最后用无菌水重悬纤维素磁珠，得到磁珠液；将含有金黄色葡萄球菌的样本与所述磁珠液混合培养一段时间，分离磁珠，得到富集金黄色葡萄球菌的磁珠。
8.优选的，所述无菌水洗涤的次数为三次。
9.优选的，所述磁珠液中，无菌水的体积为纤维素磁珠原始磁珠液的1/10-1/5。
10.本发明中，所述培养为在金黄色葡萄球菌的增菌培养基中进行。进一步优选，所述增菌培养基为bhi培养基。
11.本发明中，所述培养的温度为37℃，培养条件为震荡培养。进一步优选震荡频率为
180-220rpm。
12.优选的，所述培养的时间为3-5h。
13.本发明中，所述磁珠液现用现配。
14.本发明还提供了一种检测样本中金黄色葡萄球菌的方法，采用上述的方法富集培养金黄色葡萄球菌，在得到的富集有金黄色葡萄球菌的磁珠中加入裂解液，提取核酸进行pcr检测。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
16.本发明采用纤维素磁珠特异性吸附金黄色葡萄球菌，从而实现了金黄色葡萄球菌的富集和培养。利用纤维素磁珠表面孔径对金黄色葡萄球菌进行特异性吸附，不用连接抗体，解决了免疫磁珠昂贵的问题。
17.本发明用无菌水对纤维素磁珠进行洗涤和重悬，去除了影响磁珠吸附和金黄色葡萄球菌生长的成分，制备方法简单快速，解决了操作复杂耗时久的问题。
18.本发明的方法能够在3小时内将低浓度菌液富集，并且増菌到pcr能够检测到的浓度，缩短金黄色葡萄球菌至少1小时的检测时间。
附图说明
19.图1为染24个金黄色葡萄球菌后纤维素磁珠的吸附检测效果。
具体实施方式
20.本发明提供了一种金黄色葡萄球菌的富集培养方法，包括以下步骤：将纤维素磁珠用无菌水重复洗涤，最后用无菌水重悬纤维素磁珠，得到磁珠液；将含有金黄色葡萄球菌的样本与所述磁珠液混合培养一段时间，分离磁珠，得到富集金黄色葡萄球菌的磁珠。
21.本发明发现，原始纤维素磁珠悬液的成分中有杀菌作用，将纤维素磁珠磁吸去掉残液后，用无菌水重悬磁珠能够特异性吸附金黄色葡萄球菌，实现金黄色葡萄球菌的富集培养和快速检测。
22.作为一种实施方式，预先将纤维素磁珠液置于磁力架，磁吸去掉残液，用无菌水重复洗涤。本发明中，所述无菌水洗涤的次数优选为2-3次。
23.本发明洗涤完成后，将无菌水重悬纤维素磁珠，得到磁珠液。优选的，所述磁珠液中，无菌水的体积为纤维素磁珠原始磁珠液的1/10-1/5。
24.本发明将含有金黄色葡萄球菌的样本与所述磁珠液混合富集培养一段时间。本发明中，所述培养为在金黄色葡萄球菌的增菌培养基中进行。进一步优选，所述增菌培养基为bhi培养基。所述培养的温度优选为金黄色葡萄球菌的适宜培养温度，例如为37℃；培养条件为震荡培养，进一步优选震荡频率为180-220rpm。优选的，所述培养的时间为3-5h。
25.本发明中，所述磁珠液现用现配。由于磁珠悬液为磁珠的保护、保存剂，与磁珠的功能、形态有关。本发明所用磁珠液为现用现配，若配制时间过长，则影响纤维素磁珠对金黄色葡萄球菌的富集培养效果。
26.本发明还提供了一种检测样本中金黄色葡萄球菌的方法，采用上述的方法富集培养金黄色葡萄球菌，在得到的富集有金黄色葡萄球菌的磁珠中加入裂解液，提取核酸进行pcr检测。作为一种实施方式，本发明用sat试剂盒提取核酸，所用方法参照试剂盒说明进
行。pcr检测方法为本领域中的常规方法进行，本发明对此方法不做明确限定。经实验证明，本发明将纤维素磁珠重悬于无菌水中，与金黄色葡萄球菌共同培养，能够实现金黄色葡萄球菌的富集培养。纤维素磁珠能够特异性吸附金黄色葡萄球菌，缩短检测金黄色葡萄球菌至少1小时的时间。
27.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
28.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
29.以下实施例中所用纤维素磁珠型号为cb-clso1，购自于恺硕生物科技(厦门)有限公司，磁珠粒径为5μm。
30.实施例1
31.纤维素磁珠对金黄色葡萄球菌的吸附实验
32.制备磁珠液：取5ml磁珠液置于磁力架，磁吸去掉残液，使用灭菌超纯水洗涤磁珠三次，最后加入0.5ml灭菌超纯水重悬磁珠；
33.将金黄色葡萄球菌在bhi培养基上培养，并计数备用；
34.在离心管中分别分装30ml bhi培养基，并加入重悬磁珠液300ul，在各离心管中染金黄色葡萄球菌若干个，以不染菌的离心管作为对照。37℃，220rpm摇床震荡培养，间隔一定时间分离磁珠。向磁珠中加入裂解液，用sat试剂盒提取核酸，进行pcr检测。每个处理重复三次，结果见表1。
35.表1金黄色葡萄球菌不同培养方式下的检测结果
[0036][0037]
从表1可以看出，在金黄色葡萄球菌培养液中加入纤维素磁珠能明显缩短增菌培养的可检测时间，最短3h即可检测出待测金黄色葡萄球菌，缩短最短1小时的检测时间。
[0038]
实施例2
[0039]
纤维素磁珠对表皮葡萄球菌的吸附实验
[0040]
制备磁珠液：取5ml磁珠液置于磁力架，磁吸去掉残液，使用灭菌超纯水洗涤磁珠三次，最后加入0.5ml灭菌超纯水重悬磁珠；
[0041]
将表皮葡萄球菌在bhi培养基上培养，并计数备用；将培养得到的表皮葡萄球菌用灭菌超纯水稀释至10-6
菌液。将900ul菌液与100ul重悬磁珠液混合，置于摇床上37℃，220r/min震荡培养30min。以加入100ul灭菌超纯水作为对照。
[0042]
培养结束后，加入磁珠的取残液100ul涂板计数，未加磁珠的取混合液100ul涂板计数。做3个平行，取其平均数作为磁珠吸附后的残留菌数。
[0043]
按照公式:吸附效率＝[1-残留菌数(cfu)/对照菌数(cfu)]
×
100％，计算磁珠粒子对细菌的吸附效率。
[0044]
表2纤维素磁珠对表皮葡萄球菌的吸附结果
[0045][0046]
由以上实验结果可以看出：纤维素磁珠对表皮葡萄球菌没有吸附效果。
[0047]
实施例3
[0048]
纤维素磁珠对腐生葡萄球菌的吸附实验
[0049]
制备磁珠液：取5ml磁珠液置于磁力架，磁吸去掉残液，使用灭菌超纯水洗涤磁珠三次，最后加入0.5ml灭菌超纯水重悬磁珠；
[0050]
将腐生葡萄球菌在bhi培养基上培养，并计数备用；将培养得到的腐生葡萄球菌用灭菌超纯水稀释至10-6
菌液。将900ul菌液与100ul重悬磁珠液混合，置于摇床上37℃，220r/min震荡培养30min。以加入100ul灭菌超纯水作为对照。
[0051]
培养结束后，加入磁珠的取残液100ul涂板计数，未加磁珠的取混合液100ul涂板计数。做3个平行，取其平均数作为磁珠吸附后的残留菌数。
[0052]
按照公式:吸附效率＝[1-残留菌数(cfu)/对照菌数(cfu)]
×
100％，计算磁珠粒子对细菌的吸附效率。
[0053]
表3纤维素磁珠对腐生葡萄球菌的吸附结果
[0054][0055]
由以上实验结果可以看出：纤维素磁珠对腐生葡萄球菌没有吸附效果。
[0056]
实施例4
[0057]
纤维素磁珠对大肠杆菌的吸附实验
[0058]
将磁珠摇匀后倒入50ml的离心管中每管45ml，高速离心去掉悬液，加入30ml超纯
水，重悬磁珠，重复以上步骤三次。然后用4.5ml超纯水重悬磁珠备用。
[0059]
将大肠杆菌在改良ec肉汤培养基上培养，并计数备用；将培养得到的大肠杆菌用灭菌超纯水稀释。理论细菌接种细菌为80个，与此同时加50ul涂板计数，以平板计数个数为准。用伊红美兰大肠鉴定培养基涂板，鉴定菌液为纯正没有杂菌的大肠杆菌。
[0060]
将培养得到的大肠杆菌用灭菌超纯水稀释得到菌液。将900ul菌液与100ul重悬磁珠液混合，置于摇床上37℃，220r/min震荡培养。在培养3h、4h和5h后，测定未加磁珠加入超纯水正常培养时液体中的大肠杆菌数量，以及加磁珠后培养液体中的大肠杆菌数量。测定方法采用平板计数法和pcr测定ct值两种方法分别测定，计算三个平行试验的平均数。
[0061]
表4纤维素磁珠对大肠杆菌的吸附结果
[0062][0063]
由以上实验结果可以看出：纤维素磁珠对大肠杆菌没有吸附效果。
[0064]
实施例5
[0065]
纤维素磁珠对阪崎肠杆菌的吸附实验
[0066]
实验方法同实施例4，结果见表5。
[0067]
表5纤维素磁珠对阪崎肠杆菌的吸附结果
[0068][0069]
由以上实验结果可以看出：纤维素磁珠对阪崎肠杆菌没有吸附效果。
[0070]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单
推演、变形或替换。