一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法

1.本发明涉及胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控技术领域，具体为一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法。


背景技术：

2.脑胶质瘤又称神经胶质瘤，是最常见的成人原发性脑肿瘤的一种类型，其发病率位居颅内肿瘤发病率的首位，占到恶性脑肿瘤的80%以上，脑胶质瘤会导致患者出现颅内压增高、语言障碍、脑疝、癫痫和肢体功能活动障碍等等一些症状，严重则会危及生命，因此脑胶质瘤的诊治成为神经医学领域亟待解决的重大科学技术问题；胶质瘤主要的治疗手段为手术治疗、放疗和化疗，但总体治疗效果依然不理想，胶质瘤病人的总体生存情况比较差，平均生存期仅有一年左右；放射疗法是治疗致命脑癌、胶质母细胞瘤的标准疗法的关键组成部分；然而，这种疗法很少能治愈；尽管胶质母细胞瘤细胞的生长经常受到辐射的阻碍，但几乎所有接受治疗的患者都不可避免地会恢复肿瘤的生长，其中主要的原因就是因为胶质母细胞瘤会对放射疗法产生一定的“耐受性”；脑胶质瘤治疗困难的主要原因还包括：肿瘤细胞的过度增殖和广泛的组织浸润、发病位置难以进行手术切除、病理类型不易确定等；因此寻找有效的脑胶质瘤分子诊断标记和分子靶点，阻断肿瘤细胞的恶性增殖，提升治疗效率一直是研究的热点；放射疗法是目前治疗胶质瘤的最佳手段，在目前的医学发展背景下，何时能够研究出一种用于临床胶质瘤治疗的全新手段还未可知，为了保证放射疗法对于胶质瘤患者治疗能够持续的进行并提高治疗效果，需要提高胶质瘤细胞对辐射的敏感程度，来实现放射治疗对胶质瘤细胞最大程度的抑制及杀灭效果，因此，我们提出一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法，以便于解决上述中提出的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法，以改变上述背景技术中提出的在现有的技术背景下没有切实可行的关于提高胶质瘤细胞辐射敏感性，来达到提高治疗效果、抑制胶质瘤细胞扩散的方法的现状。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法，所述辐射敏感性调控提高方法包括以下步骤：步骤一：在脑胶质瘤细胞基因层面，通过基因干扰技术，使脑胶质瘤细胞组织基因中lncrna uca1沉默，降低胶质瘤细胞增殖侵袭；步骤二：找出与lncrna uca1存在靶向关系的候选mirnas，通过抑制mirnas表达抑制胶质瘤增殖和迁移；步骤三：在脑胶质瘤细胞组织内，注入芒果苷，抑制atm磷酸化、tp53bp1和γ-h2ax，抑制非同源末端连接，提高胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性；步骤四：向细胞组织内注入抑制剂，使抑制剂抑制gsk3β在ser166位点诱导53bp1
的磷酸化，从而抑制胶质母细胞瘤dna双链断裂修复，提高胶质母细胞瘤细胞对辐射敏感性。
5.进一步地说，所述步骤二中uca1对mirnas过表达或抑制的反应测定包括以下步骤：步骤1：获取脑胶质瘤细胞组织样本，进行多组对比试验；步骤2：利用脑胶质瘤非编码rna测序数据，筛选出了脑胶质瘤中异常非编码rna，建立脑胶质瘤细胞组织相关基因库；步骤3：结合基因干扰技术，使脑胶质瘤细胞组织基因中lncrna uca1沉默，且找出与lncrna uca1存在靶向关系的mirnas；步骤4：选择在细胞增殖或迁移中具有生物学功能的mirnas，在沉默uca1的情况下，对mirnas的表达进行检测；步骤5：筛选出表达最具显著促进作用的mirna。
6.进一步地说，所述uca1与mirna的相互作用验证过程中构建野生型荧光素酶报告载体（wt-uca1）和突变型荧光素酶报告载体（mut-uca1），其在uca1的预测的mirna结合位点上具有4bp突变。
7.进一步地说，所述wt-uca1/mut-uca1载体和irna模拟物/抑制剂和对照共转染u251细胞。
8.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法，通过对脑胶质瘤细胞组织基因中lncrna uca1沉默，降低胶质瘤细胞增殖侵袭，且通过对存在靶向关系的mirnas抑制表达从而抑制胶质瘤增殖和迁移，有利于配合芒果苷，抑制atm磷酸化、tp53bp1和γ-h2ax，抑制非同源末端连接，提高胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性，同时向细胞组织内注入抑制剂，抑制gsk3β在ser166位点诱导53bp1的磷酸化，从而抑制胶质母细胞瘤dna双链断裂修复，提高胶质母细胞瘤细胞对辐射敏感性，有利于提高治疗效果，降低治疗成本。
附图说明
9.图1为本发明uca1沉默对胶质瘤细胞株u251和shg44增殖侵袭的影响示意图；图2为本发明uca1与mir-182间靶向互作关系示意图；图3为本发明uca1对脑胶质瘤细胞株u251和shg44中tmz敏感性的影响示意图。
具体实施方式
10.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。此次只选取部分实施案例进行描述，并非全部实施案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
11.本发明提供技术方案如下，请参阅图1-3：一种胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性调控提高方法，上述辐射敏感性调控提高方法包括以下步骤：步骤一：在脑胶质瘤细胞组织内，通过基因干扰技术，使脑胶质瘤细胞组织基因中lncrna uca1沉默，降低胶质瘤细胞增殖侵袭；
在具体的应用环境中，在细胞水平实验的结果表明，uca1沉默后，胶质瘤细胞株u251和sgh44的增殖活力下降明显，且细胞侵袭能力降低，如图1中所示。
12.步骤二：找出与lncrna uca1存在靶向关系的候选mirnas，通过抑制mirnas表达抑制胶质瘤增殖和迁移；在具体的应用环境中，利用在线工具结合现有技术，找出了与uca1存在靶向关系的候选mirnas，并选择了7个mirnas：mir-129、mir-184、mir-182、mir-124、mir-143、mir-18a和mir-214，这些mirnas在细胞增殖或迁移中具有生物学功能。
13.在沉默uca1的情况下，对七种mirnas的表达进行了检测，其中五种mirnas显示出显著的促进作用，包括：mir-182、mir-124、mir-143、mir-18a和mir-214；其中mir-182的促进作用最为显著，如图2中a所示。
14.为了研究mir-182在胶质瘤细胞中的功能作用，通过对u251和sgh44细胞转染mir-182模拟物或mir-182抑制剂来对mir-182过表达或抑制。分别测定mir-182过表达或抑制对uca1的影响。qpcr结果所示， mir-182抑制使uca1表达上调，而mir-182过表达使uca1表达下调，如图2.b-c所示。
15.为了验证uca1与mir-182的相互作用，我们构建了野生型荧光素酶报告载体（wt-uca1）和突变型荧光素酶报告载体（mut-uca1），其在uca1的预测的mir-182结合位点上具有4bp突变；然后将wt-uca1/mut-uca1载体和mir-182模拟物/抑制剂以及对照共转染u251细胞。与对照组相比，wt-uca1荧光素酶报告载体的荧光素酶活性在与mir-182模拟物共转染中被显著抑制，在与mir-182抑制剂共转染组中显著提高；此外，uca1中的突变抵消了这些变化。如图2.d-e所示。这些数据表明uca1通过靶向作用与mir-182相互作用。
16.步骤三：在脑胶质瘤细胞组织内，注入芒果苷，抑制atm磷酸化、tp53bp1和γ-h2ax，抑制非同源末端连接，提高胶质母细胞瘤细胞辐射敏感性；在具体的应用环境中，首先通过细胞和动物模拟实验，进行效果模拟，同时通过免疫荧光技术利用抗原抗体反应的原理，实现对组织或细胞内抗原物质的定位；通过transwell迁移、侵袭实验，观察细胞的迁移和侵袭；同时利用mtt或流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡情况，在动物模拟实验中，通过裸鼠进行多组移植瘤对比试验，观察不同治疗环境下裸鼠的肿瘤生长情况，如下表：序号（nudemouse）治疗方法治疗时间存活时间/dnm1//21nm2给药治疗第3天-第23天28nm3放射治疗三天一次32nm4放射治疗两天一次34nm5放射治疗 调控三天一次38nm6放射治疗 调控三天一次37nm7放射治疗 调控两天一次42nm8放射治疗 调控两天一次43步骤四：向细胞组织内注入抑制剂，抑制gsk3β在ser166位点诱导53bp1的磷酸化，从而抑制胶质母细胞瘤dna双链断裂修复，提高胶质母细胞瘤细胞对辐射敏感性；此外，利用uca1 sirna及其对照瞬时转染u251和shg44细胞，沉默uca1，mtt结果显
示，两者的ic50值均有明显降低，提示肿瘤细胞对tmz的敏感性升高。如图3中所示。
17.本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。