一种靶向线粒体的查尔酮衍生物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种靶向线粒体的查尔酮衍生物及其应用。


背景技术：

2.肿瘤是一种由细胞异常增殖所导致的疾病，是威胁人类健康的最常见疾病之一，其发病率和死亡率仅次于心血管疾病，给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。传统的化学疗法和放射疗法已成为癌症治疗的主要方法，虽然在临床上有一定的疗效，但通常伴随有较严重临床副作用，限制了其临床应用。


技术实现要素：

3.为了解决肿瘤治疗中化疗和放疗存在严重副作用的问题，本发明提供了一种靶向线粒体的查尔酮衍生物，该衍生物能够靶向线粒体，对多个肿瘤细胞株展现出抑制活性，可为新型抗肿瘤药物的开发提供先导化合物，为肿瘤的治疗提供新途径。
4.本发明还提供了一种靶向线粒体的查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.本发明公开一种靶向线粒体的查尔酮衍生物，所述查尔酮衍生物的结构式如下所示：
[0007][0008]
其中，r1、r2和r3分别各自为卤素、oh、no2、甲氧基、乙氧基中的任意一种。
[0009]
基于同一发明构思，本发明还公开一种靶向线粒体的查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0010]
进一步的，所述肿瘤包括宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌中的至少一种。
[0011]
进一步的，所述治疗肿瘤药物的剂型包括注射剂和/或口服剂。
[0012]
基于同一发明构思，本发明还公开一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的活性成分包括靶向线粒体的查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐。
[0013]
进一步的，所述抗肿瘤药物的活性成分还包括临床抗肿瘤药物。
[0014]
进一步的，所述临床抗肿瘤药物包括抗肿瘤疫苗或化疗药物。
[0015]
进一步的，所述抗肿瘤药物的剂型包括注射剂和/或口服剂。
[0016]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0017]
1.本发明一种靶向线粒体的查尔酮衍生物，所述衍生物能够靶向线粒体，破坏线粒体的形态，引起肿瘤细胞线粒体自噬，可以显著抑制多种肿瘤细胞，相比传统化学疗法和
放射疗法而言，副作用更低，为肿瘤的治疗提供新途径。
[0018]
2.本发明一种靶向线粒体的查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用，本发明的查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐能够靶向线粒体，显著抑制多种肿瘤细胞，可为新型抗肿瘤药物的开发提供先导化合物，也可制成各种剂型的抗肿瘤药物或与其他药物共同组方制成复合药物，本发明填补了基于线粒体靶点的查尔酮类抗肿瘤药物的空白，为肿瘤的治疗提供了一种新的有效的技术。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0020]
图1为本发明化合物1在肿瘤细胞线粒体中的比例。
[0021]
图2为本发明所述化合物1破坏线粒体形态。
[0022]
图3为本发明所述化合物1诱导细胞自噬。
[0023]
图4为本发明所述化合物1对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度(μm)统计表。
具体实施方式
[0024]
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0025]
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0026]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0027]
本发明整体思路如下：
[0028]
线粒体是细胞必不可少的重要的亚细胞器，是细胞重要的能量来源，同时可以为细胞代谢提供重要的中间体。此外，线粒体是细胞中活性氧(ros)的重要来源。ros对维持细胞中的信号通路及氧化还原稳态具有重要意义。目前，线粒体已经成为抗肿瘤药物设计的重要靶点。
[0029]
基于此，本发明提供一种新的查尔酮衍生物，该衍生物能够靶向线粒体，破坏线粒体的形态，引起肿瘤细胞线粒体自噬，因而可以显著抑制多种肿瘤细胞，且具有更低的临床副作用。
[0030]
下面将结合实施例及实验数据对本技术一种靶向线粒体的查尔酮衍生物及其应用进行详细说明。
[0031]
实施例1
[0032]
一种靶向线粒体的查尔酮衍生物-化合物1，其结构式如下：
[0033][0034]
化合物1合成过程如下：
[0035][0036]
(1)将1.9 2g(10.0mmol)和间硝基苯甲醛1.51g(10.0mmol，1.0equiv)、1.0ml 50％氢氧化钾溶液(w/v)加入25.0ml乙醇中，先在室温搅拌1h，然后在100℃搅拌反应完全(约3h)，冷却至室温，用50.0ml乙酸乙酯萃取，水洗(30.0ml
×
3)，na2so4干燥，减压蒸除溶剂，以正己烷/乙酸乙酯＝3:1为洗脱剂柱层析分离纯化，得到化合物
[0037]
(2)将3.25g(10.0mmol)和5.28g(12.0mmol，1.2equiv)溶解到50.0ml的四氢呋喃与水的混合物中(四氢呋喃：水＝3:1，体积比)。加入三(3-羟丙基三唑甲基)胺(0.15equiv)，cuso4·
5h2o(0.1equiv)，抗坏血酸钠(1.0equiv)，室温搅拌4h后将反应液倒入100ml水中,用20ml乙酸乙酯提取,减压浓缩，以二氯甲烷/甲醇＝10:1为洗脱剂柱层析分离纯化，得到化合物1，产率38％。
[0038]
化合物1的nmr(核磁)数据：
[0039]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.53(s,1h),8.44(s,1h),8.20(d,j＝8.0hz,1h),7.94(d,j＝7.5hz,1h),7.84(d,j＝7.1hz,1h),7.74(q,j＝11.2,8.5hz,11h),7.64(d,j＝8.0hz,8h),7.30(s,1h),5.25(s,2h),4.70(s,2h),3.90(s,2h),2.33(s,2h),1.54(s,2h).
13
c nmr(100mhz,chloroform-d)δ187.14,153.55,151.08,150.96,148.71,141.91,141.56,136.66,135.17,135.14,134.39,133.81,133.71,131.12,131.07,130.65,130.53,130.21,126.25,126.22,125.86,124.75,124.02,122.65,118.49,117.64,116.49,116.30,114.36,62.71,48.71,30.07,29.90,29.76,22.13,21.62,19.08.
[0040]
实施例2
[0041]
化合物1在肿瘤细胞线粒体中的含量测定：
[0042]
实验采用hela细胞，以化合物为对照，hela细胞(1
×
106)接种于10cm
细胞培养皿中，37℃孵育18h后用50μm药物(对照化合物或化合物1)处理6h。细胞用1.0ml pbs冲洗三次，用胰蛋白酶裂解，收集，在pbs中重悬，平分。第一部分用ripa裂解液在冰上裂解30分钟，第二部分用线粒体提取试剂盒提取，获得高纯度的线粒体，加入ripa裂解液后冰上裂解30分钟。添加蒸馏水，将两种裂解液调整到相同的体积。采用高效液相色谱法测定细胞裂解液(第一部分)和线粒体裂解液(第二部分)中药物(对照化合物或化合物1)含量。峰面积之比为药物(对照化合物或化合物1)在线粒体中的比例。如图1所示，相比对照组化合物，化合物1在线粒体中的比例提升了约3倍，表明化合物1具有线粒体靶向功能。
[0043]
实施例3
[0044]
化合物1破坏线粒体形态的测定实验：
[0045]
hela细胞(1
×
106)接种于10cm细胞培养皿中，在37℃下培养12小时。细胞与指定浓度(2.0μm或10.0μm)的化合物1孵育48小时，收集细胞，以无药物处理的hela细胞作为对照组。用2.5％戊二醛4℃固定过夜，pbs洗涤3次，再用1％oso4固定。样品依次用丙酮(50％、75％、90％和100％)溶液脱水，时间为24小时。然后用超微切片将它们切成小段，安装在铜网格上，然后用2％醋酸铀酰和柠檬酸铅水溶液进行染色。切片用蒸馏水冲洗，干燥后用透射电镜观察线粒体的形态。如图2所示，化合物1可以破坏线粒体的结构，且具有浓度依赖性。
[0046]
实施例4
[0047]
化合物1诱导hela细胞自噬的测定实验：
[0048]
通过蛋白质印迹法检测化合物1诱导hela细胞自噬。hela细胞经过不同浓度的化合物1处理后，进行裂解，从细胞裂解液中提取的总蛋白(10μg)经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到pvdf膜上。用5％脱脂乳阻断膜，然后在4℃与一抗孵育过夜，随后在室温下与适当的二抗体孵育1h。用tbst冲洗膜3次，每次5min。最后，使用化学发光方法检测信号，并对信号密度进行定量。如图3所示，化合物1可以降低p62的表达，同时降低lc3
‑ⅱ
/lc
‑ⅰ
的比例，证明化合物1诱导细胞发生了自噬。图3中，gapdh作为内参蛋白。
[0049]
实施例5
[0050]
细胞增殖实验研究：
[0051]
以化合物和化合物为对照，评价化合物1对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性。
[0052]
将不同细胞置于添加10％胎牛血清和1％抗生素的dmem中，37℃，含5％co2的环境中培养。所有细胞活性测定均按mtt法进行。将细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，在37℃、含5％co2的dmem(含10％胎牛血清)培养箱中培养1天。细胞经处理48h后，调整每个细胞系每次实验使用的细胞数，使其在490nm处的吸光度为0.5-1.2。化合物重复测试3次，根据剂量依赖曲线得到ic
50
值。如图4所示，化合物1对人宫颈癌细胞hela，人肝癌细胞hepg2，人肺癌细胞a549，人结肠癌细胞hct116和人乳腺癌细胞mcf-7有较强的抑制活性。其中，化合物1对人宫颈癌细胞hela，人肝癌细胞hepg2的抑制活性远高于对照组。
[0053]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且
还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0054]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0055]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。