一种用于提取RNA的CTAB裂解缓冲液及提取植物RNA的方法

一种用于提取rna的ctab裂解缓冲液及提取植物rna的方法
技术领域
1.本发明涉及rna提取技术领域，尤其涉及一种用于提取rna的ctab裂解缓冲液及利用该ctab裂解缓冲液提取植物rna的方法。


背景技术：

2.从植物组织中提取rna是进行植物分子生物学方面研讨的必要条件。要进行northern杂交剖析，纯化mrna以用于体外翻译或树立cdna文库，qrt-pcr及差示剖析等分子生物学研究，都须要高质量的rna。
3.目前关于植物rna提取纯化的专利文献也有很多报道，例如专利202010616103.6是一种果树中高糖多酚类果实组织rna的提取方法，步骤是(1)取100-150mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的离心管内，立即加入1000ul 2
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ctab提取缓冲液和30ul 2％β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min；(2)向步骤(1)离心管中加入与提取缓冲液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，充分颠倒混匀3-5次，于4℃低温离心；(3)收集上清800ul至新的离心管中，加入与该上清液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，混匀3-5次，于4℃低温离心。(4)、收集上清600ul至新的离心管中，加入该上清液0.25倍体积的licl溶液沉淀核酸，于4℃遮光沉淀6-8h，再经10000rpm离心20min收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，随后经10000rpm离心3min后放置2min，加入40ul的depc水溶解沉淀，得到总rna；
4.(5)在总rna中加入10
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rnase-free dnase buffer(rri)5ul、rnase inhibitor 0.5l、rnase-free dnase 2ul；(6)补充depc水至500ul，加入与补depc水后混合液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，然后于4℃低温离心；(7)收集上清400ul至新的离心管中，加入该上清液2倍体积的冰无水乙醇，于-20℃沉淀核酸30min，然后在4℃低温离心；(8)收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，弃上清，重复洗涤一次，于4℃低温离心；(9)弃残留乙醇后，风干沉淀，加入30ul depc-ddh2o溶解沉淀10min，得到果实组织rna。这个方法用于果树中高糖多酚类果实组织rna，存在以下问题：实验步骤过多和实验时间过长，可能会导致rna活性丧失或者rna降解。


技术实现要素：

5.有鉴于此，为解决现有技术中植物rna的提取存在实验步骤过多和实验时间过长，导致的rna活性丧失或者rna降解的技术问题，一方面，本发明提供了一种用于提取rna的ctab裂解缓冲液，其中，tris提供了一个更加合适的裂解环境，edta抑制了样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，nacl维持了核酸结构的稳定，对提高rna的产率有很大的帮助。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
7.一种用于提取rna的ctab裂解缓冲液，毎百毫升含有如下组分：
8.浓度为1mol/l的tris 10ml、浓度为2.8mol/l的nacl 50ml、浓度为0.25mol/l的
edta8ml、ctab 2g、pvp 2g和β-巯基乙醇2ml。
9.优选地，所述tris的ph值为8.0，所述edta的ph值为8.0。
10.另一方面，本发明还提拱了一种提取植物rna的方法，包括如下步骤：
11.步骤1、取植物新鲜叶片或茎于研钵中，迅速倒入液氮研磨成细粉末，装至离心管中，立即加入预热的权利要求1或2所述的ctab裂解缓冲液混匀进行水浴；
12.步骤2、加入三氯甲烷和异戊醇的混合液，冰上静置后进行离心，取上清液；
13.步骤3、步骤2得到的上清液转入新管中，加入naac和无水乙醇，混匀后静置，离心，取上清；
14.步骤4、步骤3中得到的上清液转入新管中，加入licl溶液混合，沉淀，离心，取上清液；
15.步骤5、加入乙醇洗涤，离心，取上清液晾干；
16.步骤6、加入rnase-free ddh2o，溶解rna，直至完全溶解，保存待用；
17.步骤7、取rna进行检测。
18.优选地，步骤1中，毎克植物新鲜叶片或茎中，加入ctab裂解缓冲液10ml，预热温度为65℃，水浴温度为65℃。
19.优选地，步骤2中，加入与所述ctab裂解缓冲液等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液，所述三氯甲烷与所述异戊醇的体积比为24:1。
20.优选地，步骤2-5中的离心条件为4℃、12000r/min离心10分钟。
21.优选地，步骤3中，naac的浓度为3mol/l，ph为5.5，naac加入步骤2中上清液体积的1/30，无水乙醇加入步骤2中上清液体积的1/10。
22.优选地，步骤4中，licl溶液的浓度为10mol/l，licl溶液加入步骤3中上清液1/3体积。
23.优选地，步骤5中，乙醇为75％的乙醇。
24.优选地，步骤7具体为：
25.取2ul的rna稀释之后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压150v，25分钟。
26.本发明相对于现有技术，具有如下的有益效果：
27.(1)本发明提供的裂解缓冲液及其植物rna的提取方法中，tris提供了一个更加合适的裂解环境，edta抑制了样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，nacl维持了核酸结构的稳定，同时增加了水浴时间，提高了核酸的释放，对提高rna的产率有很大的帮助。
28.(2)使用三氯甲烷与异戊醇的混合溶液(三氯甲烷:异戊醇＝24:1)进行抽提以去除蛋白质，能更好地分离蛋白质和核酸，减少核酸的杂质。
29.(3)多糖会形成难溶的胶状物，与rna共沉淀下来，用naac和无水乙醇去除多糖和dna等杂质，从而提高基因组rna的纯度。
附图说明
30.图1为本发明的提取rna的原液配方；
31.图2为本发明的提取rna裂解缓冲液配方；
32.图3为实施例1的rna凝胶电泳图，m为marker dl5000；
33.图4为实施例1提取rna的产率和纯度。
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明进一步阐述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
35.三叶青，学名三叶崖爬藤tetrastigma hemsleyanum diels et gilg，为葡萄科崖爬藤属藤本植物，别名有角乌蔹莓、金线吊葫芦、蛇附子、石抱子、雷胆子、三叶扁藤等，是我国特有的珍稀药用植物。三叶青产量稀少，生长于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，具有极强的地域选择性。三叶青分布于我国浙江、福建、广西、云南等地。三叶青以块茎或全草入药，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰等功效，用于肝炎、肺炎、风湿、哮喘、咽痛等症的治疗。现代药理学和临床研究表明，三叶青具有抗肿瘤、抗病毒、消炎镇痛等功效，对提高免疫力效果显著，且毒副作用小，被誉为“植物抗生素”。
36.本发明中以三叶青为实验对象，下述实施例中提取rna的浓度为220.4-344.6ng/ul，od260/od280为1.83-1.96。本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效的提高植物rna提取效率。
37.实施例1
38.本实施例提取三叶青基因组rna按以下步骤进行：
39.一、提取rna的前期准备工作及注意事项
40.1、按照提取rna的原液配方(如图1所示)配好原液，应该灭菌的药品要灭菌，全部用rnase-free的器具和蒸馏水。根据要提取的材料数量大致确定细胞裂解缓冲液的体积，然后配成提取rna的ctab裂解缓冲液(如图2所示)。
41.2、水浴锅提前预热到65℃，离心机提前遇冷到4℃。
42.3、准备氯仿：异戊醇(24：1)，75％乙醇，无水乙醇，licl溶液，naac溶液，2ml和1.5ml离心管若干(无酶)；1000、200、10枪头若干(无酶)。
43.4、颠倒混匀时一定要缓慢，以避免rna断裂，影响rna的完整性。
44.5.整个实验，在超净台中进行实验，用75％的乙醇擦拭实验操作台，全程戴好手套和口罩，避免受到环境和唾液中rna酶污染。
45.二、具体步骤：
46.(1)取0.1g新鲜叶片或茎于研钵中，迅速倒入液氮研磨成细粉末，装至2ml的离心管中，立即加入1ml的65℃预热的ctab裂解缓冲液(如图2所示)混匀，65℃水浴10分钟，隔2分钟轻轻摇晃一次。
47.(2)加入与ctab裂解缓冲液等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液，(三氯甲烷:异戊醇＝24:1)，轻轻摇晃，冰上静置10分钟，轻轻混匀，4℃、12000r/min离心10分钟，取上清液。
48.(3)上清液转入另一只1.5ml的新管中，加入步骤2获得的上清液的1/30体积，naac(3mol/l，ph＝5.5)和步骤2获得的上清液的1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5-10分钟，4℃、12000r/min离心10分钟，取上清。
49.(4)上清液转入另一只1.5ml的新管中，然后加入步骤3获得的上清液的1/3体积10mol/l licl溶液，轻轻混合，-20℃沉淀8小时左右，4℃、12000r/min离心10分钟，去上清液。
50.(5)加入1ml的75％乙醇洗涤1次，4℃、12000r/min离心5分钟，去上请液，冰上倒扣
晾干。
51.(6)加入30ul的rnase-free ddh2o，溶解rna，直至完全溶解，-80℃保存待用。
52.(7)电泳条件：取2ul的rna稀释之后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压150v，25分钟(如图3所示)。
53.三叶青富含多糖多酚等次生代谢物，三叶青的rna提取方法可适用于多糖多酚类植物中rna的提取。本发明操作简单，稳定性好，选择性沉淀dna和多糖多酚等杂质，能得到质量很好的rna。
54.检测结果如图4所示，本发明中的rna的产率为220.4ng/μl-257.4ng/μl，rna纯度(a260/280)为1.83-1.96，其产率和纯度要优于现有技术。