多特异性结合蛋白及其开发方法与流程

多特异性结合蛋白及其开发方法
1.本发明处于医学领域、特别是治疗疾病中使用的多特异性结合蛋白、诸如双特异性抗体和三特异性结合蛋白及其开发方法的领域中。
2.多特异性结合蛋白是包含多个不同抗原结合结构域的多肽。已经公开了多种形式的多特异性结合蛋白，诸如wo2001077342、wo2007110205、wo2008024188、wo2009089004、wo2012135345和wo2016118742中阐述的那些并且甚至其被测试用于治疗各种自身免疫性疾病、癌症、感染性疾病和心血管疾病。尽管多特异性结合蛋白提供了（例如通过靶向多种抗原）增强的治疗益处的可能性、节省成本的潜力和改善的对患者的便利性，但它们作为治疗候选物的开发受到限制。
3.限制多特异性结合蛋白的进展的一个因素是组装、制造和纯化这些分子的复杂性。例如，双特异性分子的制造不仅需要正确组装不同的抗原结合结构域，而且还需要将不同的抗原结合结构域组装成单个分子。经常，在多特异性结合蛋白的重组表达期间，表达包含不期望的分子(例如，单特异性蛋白、单链对等)的混合物。期望的多特异性结合蛋白不仅必须从表达培养基中纯化，而且还必须从不期望的分子的混合物中纯化。不期望的分子的形成和对额外纯化步骤的需要导致期望的多特异性结合蛋白的产量降低和总制造成本增加。
4.已经公开了增强多特异性结合蛋白的开发和纯化的尝试，例如，如wo20100151792、wo2013088259和wo2013136186中所述。然而，已证明这些公开内容在解决多特异性结合蛋白的开发问题方面受到限制。例如，在一些情况下，这些公开内容表明效应子功能受损、免疫原性问题增强、组装改变、亲和力改变和/或药代动力学特性诸如半衰期降低中的一种或多种。在一些情况下，公开内容的适用性限于特定的分子和/或形式。因此，仍然需要改进的多特异性结合蛋白及其开发方法，其增强多特异性结合蛋白的开发而不改变稳定性或亲和力并且不伴随不可接受的免疫原性。
5.因此，本公开通过提供改进的多特异性结合蛋白及其开发方法解决了上述需求中的一个或多个。本公开的多特异性结合蛋白和方法的实施方案提供了期望的多特异性结合蛋白的增强纯化、保存和/或增强分子的组装、减少蛋白聚集、改善物理稳定性并且不伴随增加的免疫原性风险、改变效应子功能和/或改变的药代动力学特性。此外，本公开的实施方案保持多特异性结合蛋白的亲和力并减少或消除κ轻链与纯化试剂的不期望的结合。此外，本公开的实施方案整体上不增加纯化过程或开发过程的时间和/或成本。
6.因此，在具体实施方案中，本公开提供了结合第一抗原和第二抗原的多特异性结合蛋白。根据一些实施方案，提供了结合第一抗原和第二抗原的多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含：氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基110(eu编号)的天冬氨酸；氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨
酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸；氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；或氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。根据一些此类实施方案，如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基199处(eu编号)处的赖氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基110(eu编号)的天冬氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基110(eu编号)的天冬氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸、氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸、氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；且如果所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu
编号)处的天冬氨酸，则所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸。
7.根据一些实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区进一步包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区进一步包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。
8.根据本文提供的多特异性结合蛋白的进一步实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区进一步包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。
9.根据本文提供的多特异性结合蛋白的实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区进一步包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。
10.根据本文提供的多特异性结合蛋白的实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。
11.根据本文提供的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。
12.根据本文提供的多特异性结合蛋白的甚至进一步实施方案，所述多特异性结合蛋白包含：第一抗原结合结构域，其包含第一轻链fab区和第一重链fab区，其中所述第一轻链fab区是κ轻链且包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸；和第二抗原结合结构域，其包含第二轻链fab区和第二重链fab区，其中所述第一抗原结合结构域结合所述第一抗原且所述第二抗原结合结构域结合所述第二抗原。
13.根据本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述多特异性结合蛋白的第一抗原结合结构域进一步包含第一重链fc区。在本公开的多特异性结合蛋白的甚至进一步实施方案中，所述第一重链fc区包含人igg1、人igg2或人igg4恒定区。在本公开的多特异性结
合蛋白的一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域进一步包含第二重链fc区。在本公开的多特异性结合蛋白的甚至进一步实施方案中，所述第二重链fc区包含人igg1、人igg2或人igg4恒定区。在本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案中，所述第一重链fc区包含氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。根据本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述第二重链fc区包含氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。在本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案中，所述第一和第二重链fc区两者均包含人igg1恒定区；两者均包含人igg2恒定区；或两者均包含人igg4恒定区。在本公开的多特异性结合蛋白的甚至进一步实施方案中，所述第一和第二重链fc区两者均包含氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。根据本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109处的丙氨酸；不包含氨基酸残基110处的天冬氨酸；不包含氨基酸残基143处的赖氨酸；或不包含氨基酸残基199处的赖氨酸。在本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案中，所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109处的丙氨酸；不包含氨基酸残基110处的天冬氨酸；不包含氨基酸残基143处的赖氨酸；且不包含氨基酸残基199处的赖氨酸。根据本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述第二轻链fab区是κ轻链。进一步，根据本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案，所述第二轻链fab区是λ轻链。
14.根据一些实施方案，所述多特异性结合蛋白包含双特异性结合蛋白。根据一些此类实施方案，所述双特异性结合蛋白是免疫球蛋白异源单抗(heteromab)。在一些更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白异源单抗是igg异源单抗。根据甚至进一步的实施方案，所述多特异性结合蛋白包含多特异性结合蛋白。
15.此外，本公开的实施方案还提供了药物组合物，其包含本公开的多特异性结合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
16.根据本公开的额外实施方案，提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法。根据一些此类实施方案，所述方法包括：向所述第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。根据一些此类实施方案，引入的步骤进一步包括向所述第一抗原结合结构域中引入氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。在一些实施方案中，引入的步骤进一步包括向所述第一抗原结合结构域中引入氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸。
17.提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法的额外实施方案，其包括：向所述第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。根据一些实施方案，引入的步骤进一步包括向所述第一抗原结合结构域中引入氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。
18.提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法的额外实施方案，其包括：向所述
第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。根据一些实施方案，引入的步骤进一步包括向所述第一抗原结合结构域中引入氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸。
19.根据额外实施方案，提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法，其包括：向所述第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基143(eu编号)处的赖氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。
20.提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法的额外实施方案，其包括：向所述第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基199(eu编号)处的赖氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。
21.提供了纯化本公开的多特异性结合蛋白的方法的甚至进一步实施方案，其包括：向所述第一抗原结合结构域中引入第一轻链fab区，所述第一轻链fab区包含氨基酸残基109(eu编号)处的丙氨酸和氨基酸残基110(eu编号)处的天冬氨酸，其中所述第一轻链fab区是κ轻链；表达所述多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域组装；使所述多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱；和回收纯化的多特异性结合蛋白。
22.根据本公开的纯化多特异性结合蛋白的方法的一些实施方案，引入的步骤进一步包括向所述第一抗原结合结构域中引入第一重链fc区。在本公开的方法的甚至进一步实施方案中，所述第一重链fc区包含人igg1、人igg2或人igg4恒定区。在本公开的方法的一些实施方案中，引入的步骤进一步包括向所述第二抗原结合结构域中引入第二重链fc区。在本公开的方法的甚至进一步实施方案中，所述第二重链fc区包含人igg1、人igg2或人igg4恒定区。根据本公开的方法的一些实施方案，引入的步骤进一步包括向所述第一重链fc区中引入氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。在本公开的方法的一些实施方案中，引入的步骤进一步包括向所述第二重链fc区中引入氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。根据本公开的方法的一些实施方案，所述第一重链fc区和所述第二重链fc区两者均包含人igg1恒定区；两者均包含人igg2恒定区；或两者均包含人igg4恒定区。在本公开的方法的一些实施方案中，引入的步骤进一步包括向所述第一重链fc区和所述第二重链fc区两者中引入氨基酸残基311(eu编号)处的精氨酸和氨基酸残基317(eu编号)处的谷氨酸。在本公开的方法的一些实施方案中，所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109处的丙氨酸；不包含氨基酸残基110处的天冬氨酸；不包含氨基酸残基143处的赖氨酸；或不包含氨基酸残基199处的赖氨酸。在本公开的方法的一些实施方案中，所述第二轻链fab区不包含氨基酸残基109处的丙氨酸；不包含氨基酸残基110处的天冬氨酸；不包含氨基酸残基143处的赖氨酸；且不包含氨基酸残基199处
的赖氨酸。在本公开的方法的一些实施方案中，所述第二轻链fab区是κ轻链。在本公开的方法的进一步实施方案中，所述第二轻链fab区是λ轻链。
23.根据本公开的方法的进一步实施方案，所述亲和色谱柱包含κ亲和配体。在本公开的方法的一些实施方案中，所述亲和色谱柱包含λ亲和配体。根据本公开的方法的一些实施方案，所述亲和色谱柱包含蛋白a。在本公开的方法的一些实施方案中，所述第二轻链fab区以比所述第一轻链fab区更大的亲和力结合亲和色谱柱。在本公开的方法的甚至进一步实施方案中，所述第一轻链fab区不结合亲和色谱柱。
24.根据本公开的纯化多特异性结合蛋白的方法的甚至进一步实施方案，所述方法进一步包括：在回收纯化的多特异性结合蛋白的步骤之后使纯化的多特异性结合蛋白经受第二亲和色谱柱；和在使纯化的多特异性结合蛋白经受第二亲和色谱柱的步骤之后回收纯化的多特异性结合蛋白。根据一些实施方案，所述第二亲和色谱柱包含κ亲和配体。在一些实施方案中，所述第二亲和色谱柱包含λ亲和配体。根据一些实施方案，所述第二亲和色谱柱包含蛋白a。在甚至一些进一步实施方案中，所述第二轻链fab区以比所述第一轻链fab区更大的亲和力结合第二亲和色谱柱。甚至进一步，在一些实施方案中，所述第一轻链fab区不结合第二亲和色谱柱。
25.根据甚至进一步实施方案，本公开提供了制备本公开的多特异性结合蛋白的方法。在一些此类实施方案中，此类方法包括根据以下方法制备的本发明的多特异性结合蛋白，其中所述方法包括在使得表达所述多特异性结合蛋白的条件下培养包含多核苷酸序列的宿主细胞，所述多核苷酸序列编码本公开的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，和从所述宿主细胞回收本发明的多特异性结合蛋白。根据一些实施方案，所述多核苷酸序列包含编码第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的单一载体。根据进一步实施方案，所述多核苷酸序列包含编码第一抗原结合结构域的第一载体和包含第二抗原结合结构域的第二载体。在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括以下步骤：使回收的多特异性结合蛋白经受亲和色谱柱，和回收纯化的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，所述亲和色谱柱包含蛋白a。在一些实施方案中，所述亲和色谱柱包含κ亲和配体。在一些实施方案中，所述亲和色谱柱包含λ亲和配体。根据一些实施方案，所述第一抗原结合结构域包含第一轻链fab区且所述第二抗原结合结构域包含第二轻链fab区，所述第二轻链fab区以比所述第一轻链fab区更大的亲和力结合亲和色谱柱。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区不结合亲和色谱柱。根据甚至进一步实施方案，本公开的方法进一步包括以下步骤：在回收纯化的多特异性结合蛋白的步骤之后使纯化的多特异性结合蛋白经受第二亲和色谱柱，和在使纯化的多特异性结合蛋白经受第二亲和色谱柱的步骤之后回收纯化的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，所述第二亲和色谱柱包含蛋白a。在一些实施方案中，所述第二亲和色谱柱包含κ亲和配体。在一些实施方案中，所述第二亲和色谱柱包含λ亲和配体。根据一些实施方案，所述第一抗原结合结构域包含第一轻链fab区且所述第二抗原结合结构域包含第二轻链fab区，所述第二轻链fab区以比所述第一轻链fab区更大的亲和力结合第二亲和色谱柱。在一些实施方案中，所述第一轻链fab区不结合第二亲和色谱柱。
26.在甚至进一步实施方案中，本公开提供了多特异性结合蛋白，其用于疗法中。在一些实施方案中，本公开提供了多特异性结合蛋白，其用于治疗医学病况。在一些此类实施方案中，所述医学病况是癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病或神经退行性疾病之一。
27.在进一步实施方案中，本公开提供了多特异性结合蛋白，其用于制备药物。在一些实施方案中，本公开提供了多特异性结合蛋白，其用于制备用于疗法的药物。在进一步实施方案中，本公开提供了多特异性结合蛋白，其用于制备用于治疗医学病况的药物。在一些此类实施方案中，所述医学病况是癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病或神经退行性疾病之一。
28.如本文所用的术语“多特异性结合蛋白”是指具有两个或更多个不同抗原结合结构域的分子。本公开的多特异性结合蛋白结合两种或更多种不同抗原或相同抗原的两种或更多种不同表位。本公开的多特异性结合蛋白的实施方案包括双特异性抗体，以及如本领域中已知的三特异性或四特异性结合分子以及包括双抗体在内的单链多特异性结合分子。本公开的多特异性结合蛋白在大小和几何形状上可以不同，并且可以包含如本领域中已知的多种形式。
29.如本文所提及，“抗原结合结构域”是指多特异性结合蛋白的一部分，其包含与相应抗原相互作用并赋予其特异性的氨基酸残基。本公开的多特异性结合蛋白的抗原结合结构域包括轻链fab区和重链fab区。重链和轻链fab区两者均包括在氨基末端的可变部分，其包含散布有更保守的称为框架区的区域的cdr。重链和轻链fab区两者也包括保守区(例如，如本领域中已知的，对于轻链的c
l
和对于重链fab区的ch1)。如本领域中已知，轻链fab区被分类为κ或λ。
30.本公开的多特异性结合蛋白的一些实施方案包括在重链fab区的羧基末端连接的重链fc区(例如，形成如本领域中已知的重链)。本公开的重链fc区被分类为γ并且将重链的同种型定义为igg和亚类igg1、igg2、igg3或igg4之一。重链fc区可以进一步对多特异性结合蛋白提供效应子功能(如本领域中已知)。
31.根据一些具体实施方案，本公开的多特异性结合蛋白包含igg异源单抗分子或其片段。如本领域中已知，igg异源单抗分子包含典型fab架构和igg结构(其中一个fab“臂”或抗原结合结构域结合第一抗原，且另一个fab“臂”或抗原结合结构域结合第二抗原)。
32.本领域中公认的术语“eu编号”是指对免疫球蛋白分子的氨基酸残基进行编号的系统。例如，eu编号描述于kabat等人, sequences of proteins of immunological interest, 第5版. public health service, national institutes of health, bethesda, md. (1991); edelman, g.m, 等人, proc. natl. acad. usa, 63, 78-85 (1969); 和http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgnber.html#refs。术语“kabat编号”在本领域中被认为是指对比重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基变异更高(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(参见例如kabat, 等人, ann. ny acad. sci. 190:382-93 (1971); kabat等人, sequences of proteins of immunological interest, 第五版, u.s. department of health and human services, nih出版号91-3242 (1991))。术语“north编号”是指对比重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基变异更高(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统并且至少部分基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类，如(north等人, a new clustering of antibody cdr loop conformations, journal of molecular biology, 406:228-256 (2011)中所述。
33.如本文所用，术语“亲和色谱法”是指基于生物分子之间特异性的、可逆的相互作用分离生物化学混合物(例如，多特异性结合蛋白和不期望的生物分子种类)的色谱法。亲
和色谱法的示例性实施方案包括蛋白a亲和柱、κ亲和配体色谱法(诸如captureselect
™
、kappa xl
™
、kappaselect
™
、kappaxp
™
)或λ亲和配体色谱法。
34.如本文所提及的“亲本(parent)”或“亲本(parental)”分子是由氨基酸序列编码的分子，所述氨基酸序列用于制备本文所述的示例性实施方案之一，例如通过氨基酸取代和结构改变。亲本分子可以包括例如通过噬菌体展示或转基因非人类动物(例如)衍生的鼠抗体或其片段或结合蛋白。
35.本公开的多特异性结合蛋白可以并入药物组合物中，所述药物组合物可以通过本领域中众所周知的方法制备并且包含本公开的多特异性结合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂(例如，remington, the science and practice of pharmacy, 第22版, loyd v., 编, pharmaceutical press, 2012，其提供了从业人员通常已知的配制技术纲要)。药物组合物的合适载体包括当与多特异性结合蛋白组合时保留分子活性并且与患者免疫系统不反应的任何材料。
36.能够指导与其可操作连接的基因表达的表达载体是本领域中众所周知的。表达载体可以编码促进多肽从宿主细胞分泌的信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。每种表达的多肽可以从它们在一个载体中可操作地连接的不同启动子独立地表达，或者可替代地，可以从它们在多个载体中可操作连接的不同启动子独立地表达。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体dna的组成部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体将含有选择标记，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测那些用期望的dna序列转化的细胞。
37.宿主细胞是指用一种或多种表达本公开的多特异性结合蛋白的一条或多条多肽链的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。可以使用本领域中已知的标准技术来完成产生本公开的结合蛋白的宿主细胞系的产生和分离。哺乳动物细胞是用于表达本公开的多特异性结合蛋白的优选宿主细胞。特定的哺乳动物细胞包括hek 293、nso、dg-44和cho。优选地，结合蛋白被分泌至培养宿主细胞的培养基中，可以通过例如使用常规技术从该培养基中回收或纯化结合蛋白。例如，可以将培养基施加至蛋白a亲和色谱柱和/或κ亲和配体或λ亲和配体色谱柱上并从其洗脱。包括可溶性聚集体和多聚体的不期望的生物分子种类可以通过常用技术有效地去除，所述技术包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱法。产物可以立即冷冻，例如在-70℃，冷藏，或可以冻干。可以采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中已知的并且描述于例如deutscher, methods in enzymology 182: 83-89 (1990)和scopes, protein purification: principles and practice, 第3版, springer, ny (1994)。
实施例
38.示例性多特异性结合蛋白的表达和纯化本公开的示例性多特异性结合蛋白(其包含具有结合cmet的第一抗原结合结构域和结合bha10的第二抗原结合结构域的igg异源单抗形式)可以基本上如下表达和纯化。简而言之，将第一轻链和重链fab区克隆入表达载体、诸如pehg1和pehk表达载体，其分别含有人g1同种异型恒定区和人κ轻链恒定区。两种载体都含有鼠κ前导序列以驱动分泌(wo2014/150973 a1; lewis s.m., 等人, 2014 nat. biotechnol. 32, 191-8)。
39.可以经由本领域已知的方法将氨基酸残基变化引入结合结构域中，所述方法包括：轻链、quickchange定点诱变试剂盒(stratagene, la jolla, ca)、从头合成的密码子优化的编码区(进入单个或不同的载体中)等。eu-编号惯例可用于确定突变位置。
40.本公开的示例性修饰的κ轻链fab区和重链fc区形式分别提供于表1a和1b中(氨基酸修饰基于eu编号法编号)。
41.表1a. 示例性修饰的κ轻链fab区形式
42.表1b. 示例性修饰的重链fc区形式
43.包含表1a和1b的重链和轻链形式的igg异源单抗的各种组合的实施方案提供于表2中。示例性igg异源单抗包括结合cmet的第一抗原结合结构域和结合bha10的第二抗原结合结构域；或结合pd-1的第一抗原结合结构域和结合tigit的第二抗原结合结构域。表2的示例性igg异源单抗包括分别包含第一和第二抗原结合结构域的修饰的重链和轻链形式(表1a和1b的)的不同组合，以基于形式的取向评价对表达、组装和纯化的影响(如果有的话)。亲本单克隆抗体)和igg1异源单抗分子(例如，不包括如表1a和1b中所列的修饰的轻链或重链形式的分子)也作为对照进行评价。
44.用表达系统瞬时转染适当的宿主细胞，诸如cho，用于分泌表2的示例性igg异源单抗。通过280 nm处的吸光度在示例性igg异源单抗分泌至其中的澄清的培养基中检测所述示例性igg异源单抗。如表2中所表明，表1的修饰的κ轻链fab抗体形式和修饰的重链fc抗体形式的表达水平与各自的亲本抗体相当。因此，根据表1a和1b的形式的修饰不会负面影响表达水平，并且在一些情况下提高表达滴度。
45.表2. 包含修饰的κ轻链fab和重链fc区形式的多特异性结合分子的表达水平的定量
46.比较示例性修饰的κ轻链fab区形式在kappa xl柱中的%流通和%洗脱澄清的培养基中或从蛋白a纯化回收的本公开的多特异性结合蛋白可以使用captureselect
tm kappa xl (thermo fisher目录号494321001)预装亲和柱进行第二纯化步骤。简而言之，使从蛋白a纯化回收的本公开的多特异性结合蛋白经受kappa xl亲和柱，该柱已用相容缓冲液、诸如ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)平衡。然后洗涤柱以除去非特异性结合组分。结合的多特异性结合蛋白例如通过ph梯度(诸如20 mm tris缓冲液ph 7.0至10 mm柠檬酸钠缓冲液ph 3.0)洗脱。检测结合蛋白级分，诸如通过uv吸光度或sds-page，且然后合并。
47.在基本上如本文所述的kappa xl柱纯化后，评价本公开的示例性异源单抗的流通百分比(%ft)和洗脱百分比。简而言之，各种抗体形式(如表3中所示)经受kappa xl柱。流通物质被认为包含杂质，诸如同源二聚体或错误组装的抗体，而kappa xl配体结合物质(洗脱物质)被认为是正确组装的双特异性抗体。
48.表3表明具有两个轻链fab区的dkk形式的cmet亲本mab消除了与kappa xl柱的结合，因此100%的抗体被收集在流通物中，并阻止期望和不期望的抗体种类的区分。同样，cmet亲本mab和cmet-bah10 igg1异源单抗的流通%分别为2.8%和5.5%，其中大部分抗体与kappa xl柱结合，且因此不允许区分期望和不期望的抗体种类。相反，表3中的结果表明具有cmet轻链fab区的dkk形式的cmet-bah10 igg1异源单抗仅导致29.3%流通种类和70.7%洗
脱的多特异性结合蛋白种类，表明κ轻链fab区的dkk形式允许选择性区分并能够实现期望的多特异性结合蛋白种类与不期望的种类分离。
49.此外，表3表明(pd-1-tigit igg1异源单抗的)pd-1轻链fab区上的dkk和adk κ轻链fab区形式，分别产生80.72%和78.24%洗脱种类，因此表明两种形式选择性地区分多特异性结合蛋白的期望洗脱种类与不期望的(流通)种类。
50.表3. kappa xl%流通和%洗脱比较
51.总之，结果表明表1a的κ轻链fab区形式，当仅在igg异源单抗的一个轻链fab区上表达时，有效地区分期望的多特异性结合蛋白与不期望的种类，且因此能够实现有效地分离和纯化期望的结合蛋白。
52.结合蛋白a和kappa xl配体的纯化的多特异性结合蛋白蛋白a结合分析可以经由elisa评价表1b的示例性igg异源单抗的重链fc区形式与蛋白a配体的结合。简而言之，96-孔平底elisa板用100 ul/孔的2ug/ml山羊抗人κ蛋白包被并在4℃下孵育过夜。第二天，用洗涤缓冲液0.05% pbs-tween 20 (pbs-t)洗涤板3次，并在室温(rt)下用封闭缓冲液(酪蛋白，200μl/孔)封闭1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并将结合蛋白(如表4中所示)以10 μg/ml添加至各个孔中，并在pbs-t中以100ul/孔的体积1:3连续稀释。将板在室温下孵育1小时，并用洗涤缓冲液洗涤3次。以100ul/孔添加0.5ug/ml的生物素-蛋白a，并将板在室温下孵育1小时，洗涤3次，并将100ul/孔的链霉抗生物素蛋白标记的碱性磷酸酶(sa-ap)添加至每个孔中。将板在室温下孵育30分钟。然后将板洗涤3次，并添加100ul/孔的对硝基苯磷酸二钠盐(pnap)(thermo fisher scientific)底物。停止反应并使用设置为405 nm的比色微孔板阅读器测量光密度。结果提供于表4中。
53.表4. 纯化的结合蛋白的蛋白a结合
54.结果表明，重链fc区re形式，当仅作为cmet-bah10 igg1异源单抗的cmet重链fc区的一部分表达时，表明与cmet-bah10 igg1异源单抗相比，与蛋白a的结合降低了近似1.2倍。当重链fc区re形式作为两个重链fc区的一部分表达时，与亲本相比，与蛋白a的结合亲和力降低近似2倍。该数据表明，重链fc区re形式能够实现在更高的ph值下洗脱期望的结合分子，并通过差异蛋白a洗脱与不期望的或污染的种类区分开。
55.kappa xl结合分析可以经由elisa评价表1a的示例性igg异源单抗的轻链fab区形式与kappa xl配体的结合。简而言之，96-孔平底elisa板用100ul/孔的2ug/ml山羊抗人igg蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(0.05% pbs-tween20)洗涤3次，并在室温(rt)下用封闭缓冲液(酪蛋白，200μl/孔)封闭1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并以10μg/ml添加结合蛋白(如表5中所示)，并在dpbs (dulbecco’s hyclone)中以100ul/孔1:3连续稀释。将板在室温下孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并以100ul/孔以1ug/ml添加生物素-kappaxl。然后将板在室温下孵育1小时，洗涤3次，并将100ul/孔的sa-ap添加至每个孔中并在室温下孵育30分钟。然后将板洗涤3次，并添加100ul/孔pnap底物。停止反应并使用设置为405 nm的比色微孔板阅读器测量光密度。结果提供于表5中。
56.表5. kappa xl配体与纯化的结合蛋白的结合
57.表5中的结果表明，当与表1a的没有轻链fab区形式的cmet-bah10 igg1异源单抗 (0.57nm)相比时，具有仅作为cmet轻链fab区的一部分的dkk形式的cmet-bah10 igg异源单抗 (2.50nm)和具有仅作为cmet轻链fab区的一部分的adk的cmet-bah10 igg异源单抗(1.27 nm)两者均展现较低的对kappa xl配体的结合亲和力。作为两条lc的一部分表达的具有dkk形式的cmet亲本mab与kappa xl配体没有可检测到的结合。这些结果表明，当并入多特异性结合蛋白的单个“臂”上时，dkk和adk轻链fab区域形式两者均降低对kappa xl配体的结合亲和力，允许除去不期望的或污染的种类(例如，在流通物中)。注意，对于其中设
计为仅包括表1a的轻链fab区形式与结合蛋白的较高表达“臂”的多特异性结合蛋白，这种益处可能进一步增强)。
58.纯化抗体的纯度、特性和异质性分析对包含表1的重链fc区和/或轻链fab区形式的多特异性结合蛋白进行蛋白a(步骤1)纯化，随后为kappa xl(步骤2)纯化。通过标准技术诸如大小排阻色谱(sec)、毛细管电泳(实验室芯片nr cesds)、高效液相色谱(hic-hplc)和完整质谱法分析流通物和洗脱物质的纯度、特性和异质性。sec用于分析样品的高分子量(hmw)百分比、前肩峰百分比、主峰百分比和低分子量百分比(lmw)。使用单体峰之前洗脱的峰的auc与总auc的比率经由色谱仪的empower分析计算百分比。nr cesds用于定量纯化物质中总ab (%)和
½ꢀ
ab(%)的水平。在每个步骤评价的结合蛋白形式提供于表6、7和8中。
59.表6. (步骤1) 蛋白a捕获物质概况
60.如表6中所示，步骤1(蛋白a纯化)显示，当与对照(pd-1-tigit igg1异源单抗)相比时，表1a的κ轻链fab区形式对hmw种类没有负面影响，证明表1a的轻链fab区形式不会负面影响多特异性结合蛋白的组装。此外，表1a的轻链fab区形式的主峰与对照(pd-1-tigit igg1异源单抗)相当，并且在表1a的轻链fab区双重和三重形式之间没有观察到显著差异。
61.表7. (步骤2)kappa xl洗脱概况
62.如表7中所示，步骤2(kappa xl纯化)洗脱概况显示，对于表1a的所有κ轻链fab区形式，主峰的纯度增加至超过95%，相比之下，本文公开的表1a的缺乏κ轻链fab区形式的相应结合蛋白为约83%。结果进一步显示，如lmw峰所表明，表1a的κ轻链fab区形式的杂质减少至小于1.0%，相比之下，缺乏表1a的κ轻链fab区形式的相应结合蛋白的杂质减少至7.7%。类似地，nr cesds概况显示包含表1a的κ轻链fab区形式的完全结合蛋白的量超过94%，而缺乏表1a的κ轻链fab区形式的结合蛋白仅为80.2%。此外，包含表1a的κ轻链fab区形式的结合蛋白的1/2 ab概况小于4%，而缺乏表1a的κ轻链fab区形式的结合蛋白为17.8%。未观察到包含表1a的各种κ轻链fab区形式的不同结合蛋白之间的洗脱概况的显著差异。
63.表8. (步骤2)kappa xl流通概况
64.表8表明在kappa xl流通物中有效分离出不期望的杂质(前和lmw%)，并且包含表1
的形式的期望的多特异性结合蛋白在洗脱物中富集。在流通概况中没有观察到未修饰的对照，表明所有未修饰的异源单抗都结合kappa xl柱。
65.表3-8中提供的结果表明，表1a的修饰的κ轻链fab区形式提供了稳健的纯化、选择性区分和能够实现将期望的多特异性结合蛋白与不期望的种类和/或杂质分离。
66.示例性多特异性结合蛋白的热稳定性评价在蛋白a和kappa xl纯化后，通过差示扫描量热法(dsc)评价本文提供的示例性多特异性结合蛋白的热稳定性。结果(作为tml报告的解折叠温度)提供于表9中。
67.表9. 示例性结合蛋白的热稳定性评价
68.表9表明重链fc区re形式(在cmet亲本抗体的两个臂上)影响热稳定性，然而，当重链fc区re形式表达为示例性igg1异源单抗的仅一个臂的一部分时，没有观察到影响。此外，所有修饰的κ轻链fab形式表现出相对于各自的未修饰的亲本分子相当的热稳定性。
69.示例性多特异性结合蛋白的结合亲和力分析通过elisa评价本文提供的示例性多特异性结合蛋白的结合亲和力。简而言之，384-孔平底elisa板用20ul/孔的1ug/ml抗人-fc蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(0.05% pbs-tween20)洗涤3次，并在室温(rt)下用封闭缓冲液(酪蛋白，60μl/孔)封闭1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并在dpbs (dulbecco's hyclone)中以20ul/孔以1μg/ml一式三份添加如表10中所示的结合蛋白。将板在室温下孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并以20ul/孔添加滴定抗原并在室温下孵育60分钟。将板洗涤3次，并添
加20ul/孔naap底物并孵育20 min。将板洗涤3次，并以20ul/孔添加pnpp底物，并停止反应，并使用设置为405 nm的比色微孔板阅读器测量光密度。结果列于表10中。
70.表10. 结合亲和力分析
71.表10中提供的这些结果表明包含表1a的修饰的κ轻链fab区形式的示例性多特异性结合蛋白维持相当的、并且在一些情况下提高的对靶抗原的结合亲和力(相比于未修饰的亲本多特异性结合蛋白)。
72.计算机芯片上(in silico)免疫原性分析经由免疫表位数据库分析(iedb)通过计算机芯片上免疫原性分析，分析示例性多特异性结合蛋白的修饰的重链fc区和轻链fab区形式的免疫原性。计算抗体序列的免疫原性(ig)评分和稀有性评分(在相应位置处针对人ig库的氨基酸使用频率)(更低的评分表明更低的免疫原性)。结果提供于表11a和11b中。
73.表11a. 轻链fab区免疫原性分析
74.表11b. 重链fc区免疫原性分析。
75.表11a和11b中所示的结果显示，表1a和1b的修饰的轻链fab区和重链fc区形式表
明与相应未修饰的亲本分子相当的ig和稀有性评分，表明修饰的形式不增加免疫原性风险。
76.序列seq id no:1 (示例性cmet hc，显示带下划线的fab区)seq id no:2 (示例性cmet lc)seq id no:3 (示例性bah10 hc，显示带下划线的fab区)seq id no:4 (示例性bah10 lc)seq id no:5 (示例性cmet hc，具有带下划线和斜体显示的re形式，显示带下划线的fab区)线的fab区)
seq id no:6 (示例性cmet hc，显示带下划线的fab区)seq id no:7 (示例性cmet lc，具有带下划线显示的dkk形式)seq id no:8 (示例性cmet hc，具有带下划线和斜体显示的re形式；fab区带下划线显示)seq id no:9 (示例性cmet lc，具有带下划线显示的adk形式)seq id no:10 (示例性pd1 hc，显示带下划线的fab区)seq id no:11 (示例性pd1 lc)
seq id no:12 (示例性tigit hc，显示带下划线的fab区)seq id no:13 (示例性tigit lc)seq id no:14 (示例性dkk lc，具有带下划线显示的dkk形式)seq id no:15 (示例性pd1 lc，具有带下划线显示的adk形式)seq id no:16 (示例性pd1 lc，具有带下划线显示的dk形式)seq id no:17 (示例性pd1 lc，具有带下划线显示的kk形式)