DYSFERLIN双载体的基因疗法的制作方法

etal.,plosone7:e39233,2012；bansaletal.,nature423,168-172,2003；moore,s.a.,etal.,j.neuropathol.exp.neurol65:995-1003,2006；rosalesetal.,musclenerv42:14-21,2010；sondergaardetal.,annsofclin.trans.neurol.2:256-270,2015；evessonetal.,j.biol.chem.285:28529-28539,2010和klingeetal.,soc.exp.biol.21:1768-1776,2007，其中的每篇文献都通过引用整体并入本文）。不太常见的dysferlin缺陷的表型表现为脊柱强直综合征（rigidspinesyndrome）（klingeetal.,musclenerve41:166-173,2010，该文献通过引用整体并入本文）。一般来说，患者在20岁早期时出现缓慢进行性的无力和高血清肌酸激酶（ck）。约三分之一的患者在发病后15年内成为依赖轮椅的人。临床上，心脏是不受影响的且认知功能不受影响。肌无力的分布相对受限的表型变异为潜在的区域基因置换治疗奠定了基础，可能极大地影响该疾病的生活质量（groseetal.,plosone7:e39233,2012，bartonetal.,musclenerve42:22-29,2010）。单核苷酸变化是典型的dysf基因突变，这也有利于基因转移的成功，以保护转基因产物免受免疫排斥（rodine-klapacetal.,mol.ther.18:109-117,2010；mendelletal.,n.eng.j.med.363:1429-1437,2010；mendelletal.,ann.neurol.66:290-297,2009；其中每篇文献都通过引用整体并入本文）。7.目前还没有治愈或治疗dysferlin肌病的方法。总体而言，评估基因置换或替代基因置换的临床前研究表明多种策略在恢复膜修复方面表现出一定的功效。dysferlin基因包括55个外显子，含有150kb的基因组dna及其6.5kb的相关cdna。然而，对于基因置换，aav的包装极限是4.7kb，其小于为6.5kb的dysferlin的cdna序列。因此，需要对lgmd2b进行处理就需要能够将功能性全长的dysferlin蛋白递送给有需要的对象的新机制。技术实现要素：8.本文公开了一种编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列由以下序列组成：（a）seqidno:1、6或18的核苷酸序列；（b）与seqidno:1、seqidno:6或seqidno:18的核苷酸序列在seqidno:1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（c）seqidno:13或15的核苷酸序列；（d）与seqidno:13或15的核苷酸序列在seqidno:13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（e）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中所述片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（f）与（e）的核苷酸序列在（e）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。9.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含一个或多个选自末端反向重复序列（itr）、启动子、内含子、选择标志物或复制原点（ori）的另外的核苷酸序列。10.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括itr的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr是aav2itr或aav3itr。在一些实施方案中，重组多核苷酸包含两个itr。在一些实施方案中，itr包含seqidno:3或seqidno:17的核苷酸序列。11.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括启动子的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子选自人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌间线蛋白（desmin）启动子、骨骼α-肌动蛋白（aska）启动子、肌钙蛋白i（tnni2）启动子、心肌特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶（mck）启动子、截短的mck（tmck）启动子、肌球蛋白重链（mhc）启动子、混合肌球蛋白重链增强子/mck增强子-启动子（mhck7）启动子、c5-12启动子、小鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导性核因子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子是mhck7启动子。在一些实施方案中，启动子是重组启动子。在一些实施方案中，重组启动子是重组肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，重组肌肉特异性启动子是重组肌球蛋白重链-肌酸激酶肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，启动子包含seqidno:4的核苷酸序列。12.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括内含子的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，内含子包括5'供体位点、分支点和/或3'剪接位点。在一些实施方案中，内含子是嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子包含来自人类β-球蛋白基因的5'供体位点。在一些实施方案中，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的分支点。在一些实施方案中，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的3′剪接受体位点。在一些实施方案中，内含子包含seqidno:5的核苷酸序列。13.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括选择标志物的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，选择标志物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因或卡那霉素（kanamycin）抗性基因。在一些实施方案中，重组多核苷酸包含seqidno:6或seqidno:18的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。14.在一些实施方案中，重组核苷酸不包含除一个或多个itr以外的aav序列。15.在一些实施方案中，重组核苷酸不包含除一个或多个itr以外的病毒序列。16.本文公开了编码人dysferlin蛋白的片段的重组多核苷酸序列，其中所述重组多核苷酸包含第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列由以下序列组成：（a）seqidno:2、8或19的核苷酸序列；（b）与seqidno:2、8或19的核苷酸序列在seqidno:2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（c）seqidno:14或16的核苷酸序列；（d）与seqidno:14或16的核苷酸序列在seqidno:14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（e）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（f）与（e）的多核苷酸序列在（d）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。17.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含一个或多个包含末端反向重复序列（itr）、选择标志物、复制原点（ori）、非翻译区（utr）或多腺苷酸化（polya）信号的另外的核苷酸序列。18.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括itr的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr是aav2itr或aav3itr。在一些实施方案中，重组核苷酸包含两个itr。在一些实施方案中，itr包含seqidno:3或17的核苷酸序列。19.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括polya信号的核苷酸序列。在一些实施方案中，polya信号是人工polya信号。在一些实施方案中，polya信号包含seqidno:7的核苷酸序列。20.在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含包括选择标志物的另外的核苷酸序列。在一些实施方案中，选择标志物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因或卡那霉素抗性基因。在一些实施方案中，重组多核苷酸包含seqidno:8或seqidno:19的核苷酸序列。21.在一些实施方案中，重组核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第一片段的第一多核苷酸序列。22.在一些实施方案中，重组核苷酸不包含除一个或多个itr以外的aav序列。23.在一些实施方案中，重组核苷酸不包含除一个或多个itr以外的病毒序列。24.本文进一步公开了一种双腺相关病毒（aav）载体系统，其包含：（a）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端片段的第一重组多核苷酸，其中所述第一重组多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno:1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno:6或seqidno:18的核苷酸序列在seqidno:1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno:13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno:13或15的核苷酸序列在seqidno:13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中所述片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二重组多核苷酸，其中所述第二重组多核苷酸包含第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno:2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno:2、8或19的核苷酸序列在seqidno:2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno:14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno:14或16的核苷酸序列在seqidno:14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。25.本文进一步公开了包含任何本文公开的重组多核苷酸的腺相关病毒（aav）载体。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码人dysferlin蛋白的n端片段。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码人dysferlin蛋白的c端片段。在一些实施方案中，aav载体是aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12、aav-13、aavrh.10、aavrh.20或aavrh.74。在一些实施方案中，aav载体是aavrh.74。26.本文进一步公开了包含任何本文所公开的aav载体的组合物。27.本文进一步公开了包含以下的组合物：（a）第一重组腺相关病毒（raav）载体，其中第一raav载体包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端片段的第一重组多核苷酸，其中所述第一重组多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中所述片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）第二raav载体，其中所述第二raav载体包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二重组多核苷酸，其中所述第二重组多核苷酸包含第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中所述hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。28.在一些实施方案中，第一和第二raav载体的摩尔比值在约100:1-1:100、约10:1-1:10、约2:1-1:2或约1:1之间。29.本文进一步公开了一种腺相关病毒（aav）载体，其包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中所述片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中所述多核苷酸的侧翼是第一和第二itr。30.在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr是aav2itr或aav3itr。在一些实施方案中，第一和/或第二itr包含seqidno:3或17的核苷酸序列。31.在一些实施方案中，aav载体进一步包含一个或多个包含启动子、内含子、选择标志物或复制原点（ori）的另外的多核苷酸序列。32.在一些实施方案中，aav载体进一步包含包括启动子的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子是肌球蛋白重链复合物-e盒（box）肌肉肌酸激酶融合增强子/启动子。在一些实施方案中，启动子是重组启动子。在一些实施方案中，重组启动子是重组肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，重组肌肉特异性启动子是mhck7启动子。在一些实施方案中，启动子包含seqidno:4的核苷酸序列。33.在一些实施方案中，aav载体进一步包含包括内含子的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，内含子包含5'供体位点、分支点和/或3'剪接位点。在一些实施方案中，内含子是嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子包含来自人类β-球蛋白基因的5′供体位点。在一些实施方案中，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的分支点。在一些实施方案中，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的3'剪接受体位点。在一些实施方案中，内含子包含seqidno:5的核苷酸序列。34.在一些实施方案中，aav载体进一步包含包括选择标志物的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，选择标志物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因或卡那霉素抗性基因。在一些实施方案中，aav载体包含seqidno:6或seqidno:15的核苷酸序列。35.在一些实施方案中，aav载体进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。36.在一些实施方案中，aav载体不包含除一个或多个itr以外的aav序列。37.在一些实施方案中，aav载体不包含除一个或多个itr以外的病毒序列。38.本文进一步公开了一种腺相关病毒（aav）载体，其包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr。39.在一些实施方案中，aav载体进一步包含一个或多个包括选择标志物、复制原点（ori）、非翻译区（utr）或多腺苷酸化（polya）信号的多核苷酸序列。40.在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr是aav2itr或aav3itr。在一些实施方案中，itr包含seqidno:3或17的核苷酸序列。41.在一些实施方案中，aav载体进一步包含包括polya信号的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，polya信号是人工polya信号。在一些实施方案中，polya信号包含seqidno:7的核苷酸序列。42.在一些实施方案中，aav载体进一步包含包括选择标志物的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，选择标志物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因或卡那霉素抗性基因。43.在一些实施方案中，aav载体包含seqidno:8或seqidno:16的核苷酸序列。44.在一些实施方案中，aav载体进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。45.在一些实施方案中，aav载体不包含除一个或多个itr以外的aav序列。46.在一些实施方案中，aav载体不包含除一个或多个itr以外的病毒序列。47.本文公开了一种双腺相关病毒（aav）载体系统，其包含：（i）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中所述多核苷酸的侧翼是第一和第二itr；以及（ii）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含（a）第三末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列；以及（c）第四itr，其中多核苷酸的两侧是第三和第四itr。48.本文进一步公开了一种腺相关病毒（aav）包装系统，其包含：（a）包含本文公开的重组多核苷酸的质粒、（b）腺病毒辅助质粒、以及（c）rep-cap质粒。在一些情况下，腺病毒辅助质粒包含phelp质粒。49.本文进一步公开了一种腺相关病毒包装系统，其包含：（a）包含本文公开的重组多核苷酸的质粒和（b）腺病毒辅助质粒。在一些情况下，腺病毒辅助质粒包含phelp质粒。50.本文进一步公开了一种产生腺相关病毒（aav）载体的方法，其包含使细胞与aav包装系统接触，其中所述aav包装系统包含：（a）包含本文公开的重组多核苷酸的质粒、（b）腺病毒辅助质粒和（c）rep-cap质粒。在一些情况下，细胞是宿主细胞，任选地哺乳动物宿主细胞，进一步任选地hek293。51.本文进一步公开了一种产生腺相关病毒（aav）载体的方法，其包含用aav包装系统转导包装细胞系，其中所述aav包装系统包含：（a）包括包含任何本文公开的重组多核苷酸的aav表达盒（expressioncassette）的质粒和（b）腺病毒辅助质粒，其中所述包装细胞系表达腺相关病毒的rep和cap基因。在一些情况下，aav的rep基因是rep78。在一些情况下，aavcap基因是rh74cap基因。52.本文进一步公开了包含任何本文公开中的重组多核苷酸的细胞。53.本文进一步公开了包含aav表达盒的细胞，其中aav表达盒包含任何本文公开的重组多核苷酸。在一些情况下，所述质粒包含与seqidno：18或19有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸。在一些情况下，质粒包含seqidno：18或19的多核苷酸。54.本文进一步公开了一种治疗dysferlin肌病的方法，其包含向有此需要的对象施用：（a）有效量的第一重组多核苷酸，其包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）有效量的第二重组多核苷酸，其包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。55.在一些实施方案中，第一多核苷酸被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第二多核苷酸被肌肉内地或静脉内地施用。56.在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸被同时地或按顺序地施用。57.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。58.本文进一步公开了一种治疗dysferlin肌病的方法，其包含向有此需要的对象施用：（a）有效量的第一腺相关病毒（aav）载体，其中所述第一aav载体包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1、或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）有效量的第二aav载体，其中所述第二aav载体包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。59.在一些实施方案中，第一aav载体被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第二aav载体被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第一和第二aav载体被同时地施用。60.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。61.在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含向有此需要的对象施用有效量的任何本文公开的aav双载体系统。62.在一些实施方案中，aav双载体系统被肌肉内地或静脉内地施用。63.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。64.在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含向有此需要的对象施用有效量的任何本文公开的组合物。65.在一些实施方案中，组合物被肌肉内地或静脉内地施用。66.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。67.本文进一步公开了组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用，其中所述组合物包含：（a）第一重组多核苷酸，其包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）第二重组多核苷酸，其包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。68.在一些实施方案中，第一多核苷酸被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第二多核苷酸被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸被同时地施用。69.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。70.本发明公开了组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用，其中所述组合物包含：（a）有效量的第一腺相关病毒（aav）载体，其中所述第一aav载体包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1、或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）有效量的第二腺相关病毒（aav）载体，其中所述第二aav载体包含编码人dysferlin蛋白的c端片段的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。71.在一些实施方案中，第一aav载体被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第二aav载体被肌肉内地或静脉内地施用。在一些实施方案中，第一和第二aav载体被同时地施用。72.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。73.本文公开了组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用，其中所述组合物包含任何本文公开的aav双载体系统。74.在一些实施方案中，组合物被肌肉内地或静脉内地施用。75.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。76.本文公开了任何所公开的组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用。77.在一些实施方案中，组合物被肌肉内地或静脉内地施用。78.在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。79.在一些实施方案中，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品，第一aav载体的有效量在约1x106-1x1016vg/kg、约1x108-1x1015vg/kg或约1x1010-1x1014vg/kg之间。80.在一些实施方案中，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品，第二aav载体的有效量在约1x106-1x1016vg/kg、约1x108-1x1015vg/kg或约1x1010-1x1014vg/kg之间。81.在一些实施方案中，第一aav载体被施用至少1、2、3、4或5次。82.在一些实施方案中，第二aav载体被施用至少1、2、3、4或5次。83.在一些实施方案中，aav双载体系统的有效量在约1x1010-1x1013载体基因组（vg）、约1x1011-1x1013vg、1x1012-1x1013vg之间。84.在一些实施方案中，aav双载体系统被施用至少1、2、3、4或5次。85.在一些实施方案中，组合物的有效量在约1x1010-1x1013载体基因组（vg）、约1x1011-1x1013vg、1x1012-1x1013vg之间。86.在一些实施方案中，组合物被施用至少1、2、3、4或5次。87.本文公开了一种编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸，其中重组多核苷酸序列包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列包含seqidno:20的核苷酸序列。88.本文公开了一种制备编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸的方法，其中重组多核苷酸序列包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno.20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，其中所述方法包含使细胞与含有编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列的重组多核苷酸接触，其中所述第一多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的c端片段的第二多核苷酸序列的第二重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的多核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。89.本文公开了一种制备编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸的方法，其中所述重组多核苷酸包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，其中所述方法包含使细胞与双aav载体系统接触，所述系统包含：（i）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr；以及（ii）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含（a）第三末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列；以及（c）第四itr，其中多核苷酸的侧翼是第三和第四itr。90.在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞、心脏细胞、干细胞、卫星细胞和/或肝脏细胞。91.本文公开了一种制备编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸的方法，其中重组多核苷酸序列包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，其中所述方法包含向对象施用包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列的重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的c端片段的第二多核苷酸序列的第二重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。92.本文公开了一种制备编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸的方法，其中所述重组多核苷酸包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，其中所述方法包含向对象施用双aav载体系统，所述系统包含：（i）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr；以及（ii）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含（a）第三末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列；以及（c）第四itr，其中多核苷酸的侧翼是第三和第四itr。93.本文公开了一种治疗对象的肌营养不良症的方法，其包含在对象中表达编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸序列包含seqidno:20的核苷酸序列或与seqidno:20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。94.在一些实施方案中，所述方法包含向对象施用包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的n端的第一多核苷酸序列的重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（b）包含编码人dysferlin（hdysf）蛋白的c端片段的第二多核苷酸序列的第二重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸序列。95.在一些实施方案中，所述方法包含向对象施用双aav载体系统，所述系统包含：（i）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr；以及（ii）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含（a）第三末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的片段的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白的片段由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；以及（c）第四itr，其中多核苷酸的侧翼是第三和第四itr。96.在一些实施方案中，对象是哺乳动物，选自人类、非人类灵长类动物、犬、羊、马、猪、鼠、大鼠、兔、牛或猫。97.在一些实施方案中，对象患有dysferlin肌病。在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。附图说明98.图1提供了用于治疗dysferlin肌病的双aav载体系统的示意图。5’载体（例如5’hdysfaav载体），paav.mhck7.dysf5'.ptg（ptg=启动子/转基因）含有肌肉特异性mhck7启动子、嵌合内含子、共有kozak序列和对应于seqidno:12的氨基酸1-1113的dysfcdna的5'部分。3’载体（例如3’hdysfaav载体），paav.dysf3'.polya，含有对应于seqidno:12的氨基酸794-2080的dysfcdna的3'部分和含有多腺苷酸化信号的dysf3'utr。99.图2提供了paav.mhck7.dysf5'.ptgdna载体质粒图谱。100.图3提供了paav.dysf3'.polya载体dna质粒图谱。101.图4a-4d示出了双载体系统递送后dysferlin的表达。通过免疫染色（图4a）和蛋白质印迹可以看到两种载体的递送后完整（robust）全长dysferlin表达（图4c）。单独的任何一个载体的递送都没有异常的dysferlin表达（图4b：免疫染色，图4d：蛋白质印迹）。3222是全长对照。102.图5a-5c示出了raavrh74.mhck7.dysf.dv递送后dysferlin表达的时间过程的结果。图5a展示了双载体递送至左胫骨前肌（lta）后通过dysferrin免疫标记（上图部分）观察到的全长dysferrlin表达。治疗后1个月、3个月和6个月，dysferlin的表达一直持续，病理上没有异常反应（h&e，下图部分）。比例尺，100μm。每个时间点n=4。图5b示出了1、3、6个月样品的蛋白质印迹，显示了在注射的lta（每组2个）中全长的dysferlin的表达。γ-微管蛋白作为加样对照。图5c示出了不同组织在注射后3个月和6个月，每ug基因组dna的载体基因组的生物分布图。注：lta是经处理的；对数轴。103.图6示出了通过肌肉内注射raavrh.74.mhck7.dysf.dv治疗的4只动物在3个月或12个月的终点时的目标肌肉（lta）和非目标组织的蛋白质印迹分析。104.图7a-7c示出了aavrh.74.mhck7.dysf.dv的全身性递送后dysferlin的表达。图7a示出了在全身性递送6x1012vg（2.4e13vg/kg，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品）aavrh.74.mhck7.dysf.dv后组织的dysferlin免疫标记（每个剂量n=6）。所示肌肉为心脏、腓肠肌、横膈膜和四头肌用于dysf-/-、经处理（aav.dv）和野生型（wt）组织。图7b示出了胫骨前肌（lta）、腓肠肌（rgas）、四头肌（lqd）、三头肌（rtri）和横膈膜中中心化核的量化情况。*p《0.05样品与野生型之间显著差异，#样品与野生型之间无显著差异。图7c示出了组织裂解物（h：心脏，g：腓肠肌，q：四头肌，d：横膈膜）的蛋白质印迹，展示了在237kd的全长dysferlin条带，γ-微管蛋白作为加样对照。105.图8示出了aavrh.74.dysf.dv递送后剂量依赖性的膜再密封活性。106.图9示出了aavrh.74.mhck7.dysf.dv全身性递送后纤维化和炎症的逆转。基于超螺旋的dna或质粒作为定量标准品，用6x1012vg（2.4e13vg/kg）处理blaj小鼠。aavrh.74.mhck7.dysf.dv（n=6）。取出腰肌，并分析纤维化（中间一栏）和cd8单核细胞的存在。基因递送后，这两个参数都显著减少。107.图10a-10b展示了raavrh.74.mhck7.dysf.dv的全身性递送恢复dysf-/-小鼠的功能性缺陷。图10a：收获横膈膜肌肉条，并根据实验方案来评估具体的力量。经处理的横膈膜显示出力量的显著改善（**p》0.01，anova），这与两种剂量[2e12vg总aav.dysfdv（8e13vg/kg，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品），或6e12vg总aav.dysf.dv（2.4e13vg/kg，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品）]下的野生型的力量没有区别。图10b示出了在膜再密封方面存在着剂量依赖性反应。低剂量时没有显著改善。[0108]图11a-11d示出了来自监测aav衣壳和dysferlin的t细胞反应的结果。外周血单核细胞被分离并暴露于包含aav5和aavrh.74衣壳（蓝色条状）的肽以及人dysferlin（绿色）。在3个月（图11a）和6个月（图11b）时监测aav5衣壳和dysferlin的t细胞反应。在3个月（图11c）和6个月（图11d）时监测aavrh.74衣壳和dysferlin的t细胞反应。al.,annsofclin.trans.neurol.2:256-270,2015中找到。[0124]多核苷酸（在本文中称为参考物）的等效物与参考物有至少50%（或至少60%、或至少70%、或至少80%或至少90%）的同一性，并且编码与参考物编码的相同多肽，或者编码由参考物编码的多肽的等效物。[0125]为了得出与参考序列的氨基酸/核苷酸残基或连续片段等效的（或对应的）测试序列的位置或连续片段，在测试序列和参考序列之间进行序列比对。相互对齐的位置或片段被确定为等效物。[0126]术语“亲和标签”是指可被包含在融合蛋白中的多肽，以便使用能够结合至（即，有亲和力）亲和标签的配体检测融合蛋白和/或从细胞环境中纯化融合蛋白。配体可以是，但不限于抗体、树脂或互补多肽。亲和标签可以包含小的肽（通常是长度约为4至16个氨基酸的肽），或者它可以包含较大的多肽。常用的亲和标签包括聚精氨酸、flag、v5、聚组氨酸、c-myc、strepii、麦芽糖结合蛋白（mbp）、n-利用物质蛋白a（nusa）、硫氧还蛋白（trx）和谷胱甘肽s-转移酶（gst）等等（例如，参见gst基因融合系统手册-sigma-aldrich）。在实施方案中，亲和标签是多组氨酸标签（例如his6标签（seqidno:21））。在融合蛋白中加入亲和标签可以通过亲和纯化使用能够紧密和特异性结合亲和标签的亲和介质将融合蛋白从细胞环境中纯化出来。亲和介质可以包括，例如，与固定相（基质）（例如琼脂糖或金属珠）共价连接的金属带电树脂或配体。例如，多组氨酸标记的融合蛋白（也称为his标记的融合蛋白）可以通过使用ni2 或co2 负载树脂的固定化金属离子色谱法回收，抗flag亲和凝胶可以被用于捕获flag标记的融合蛋白，而谷胱甘肽交联到固体支持物（例如琼脂糖）可以被用于捕获gst标记的融合蛋白。在一个方面，亲和标签是纯化标签或标志物。[0127]如本文所使用的，术语“纯化”、“净化”或“分离”是指从复杂的混合物（例如细胞裂解液或多肽混合物）中分离出一种或多种生物材料（例如多核苷酸、多肽或病毒载体）的过程。纯化、分离或隔离不需要是完全的，即在纯化过程后，复杂混合物的一些成分可能与一种或多种生物材料（例如多核苷酸、多肽或病毒载体）一起保留。然而，相对于纯化前的复合混合物，纯化的产物应该富含一种或多种生物材料（例如多核苷酸、多肽或病毒载体），而最初存在于复杂混合物中的其他成分的很大一部分应该通过纯化过程被去除。[0128]如本文所使用的，术语“细胞”可指原核细胞或真核细胞，任选地是从对象或市售来源获得。在某些情况下，细胞是宿主细胞，例如哺乳动物细胞或哺乳动物宿主细胞。在某些情况下，宿主细胞在本文中被称为生产细胞或包装细胞。在某些情况下，细胞系是包装细胞系。[0129]“真核细胞”包含除无核界以外的所有生命界。它们可以通过膜结合的细胞核很容易区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或有机体，它们的细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂的结构。最典型的膜结合结构是细胞核。除非特别说明，术语“宿主”包括真核宿主，例如包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿猴、牛、猪、鼠、大鼠、禽、爬行动物和人，例如，hek293细胞、中国仓鼠卵巢（cho）细胞、cho-s细胞、cho-k1细胞、293t细胞、hela细胞、小仓鼠肾脏（bhk）细胞、sf9细胞、干细胞、卫星细胞和肌肉细胞。肌肉细胞的示例包括但不限于，骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞。[0130]“原核细胞”通常缺乏细胞核或任何其他膜结合的细胞器，分为两个域，细菌和古细菌。除了染色体dna外，这些细胞还可以在一个称为附加体的环中包含遗传信息。细菌细胞非常小，大致相当于动物线粒体的大小（直径约1-2μm，长10μm）。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋状。细菌细胞不像真核生物那样经历复杂的复制过程，而是通过二元分裂进行分裂。示例包括但不限于芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌。[0131]应用于核酸序列的术语“编码”是指被叙述来“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态下或通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mrna。反义链是这种核酸的互补序列，编码序列可以从中推导出来。[0132]术语“等效物”或“生物等效物”在提及特定的分子、生物或细胞材料时可互换使用，并意指在保持所需结构或功能的同时具有最小同源性的材料（例如，具有类似的功能或活性）。应该理解，在没有明确说明的情况下，当提到与参考多肽、蛋白质或多核苷酸的等效物或生物等效物时，等效物或生物等效物与参考多肽、蛋白质或多核苷酸具有所描述的结构关系和等效或基本等效的生物活性。例如，等效多肽、蛋白质或多核苷酸的非限制性示例包括对其或对于在参考多肽、多核苷酸或蛋白质全长上的多肽、蛋白质或多核苷酸具有至少60%、或者至少65%、或者至少70%、或者至少75%、或者至少80%、或者至少85%、或者至少90%、或者至少95%同一性的多肽、蛋白质或多核苷酸。另外，等效物多肽是由在高度严格的条件下与编码这种参考多肽序列的多核苷酸杂交，并且具有实质上等效或等效的生物活性的多核苷酸或其补体编码的多肽。本文描述了高度严格的条件，并通过引用将其并入本文。或者，其等效物是由多核苷酸或其互补序列（其与参考多核苷酸（例如野生型多核苷酸）在参考多核苷酸的长度上具有至少70%、或者至少75%、或者至少80%、或者至少85%、或者至少90%、或者至少95%、或者至少97%同一性）编码的多肽。这种等效多肽具有与参考多核苷酸编码的多肽相同的生物活性。[0133]等效多核苷酸的非限制性示例包括与参考多核苷酸具有至少60%、或者至少65%、或者至少70%、或者至少75%、或者至少80%、或者至少85%、或者至少90%、或者至少95%、或者至少97%的同一性的多核苷酸。等效物还包括在高度严格的条件下与参考多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列。这种等效多核苷酸具有与参考多核苷酸相同的生物活性。[0134]多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”意味着，当对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在参考多核苷酸长度上比较两个序列时是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如currentprotocolsinmolecularbiology（ausubeletal.,eds.1987）supplement30，section7.7.18,table7.7.1中描述的软件，确定比对和同源性百分比或序列同一性。在某些实施方案中，默认参数被用于对齐。使用默认参数，可以使用blast执行非限制性示例性对齐程序。具体而言，示例性程序包括使用以下默认参数的blastn和blastp：遗传代码=标准；过滤器=无；链=双链；截止值=60；期望值=10；矩阵=blosum62；描述=50个序列；排序方式=高分；数据库=非冗余，genbank embl ddbj pdb genbankcdstranslations swissprotein spupdate pir。有关这些程序的详细信息，请访问以下互联网地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。序列同一性和同一性百分比可以通过将它们并入clustalw（可在网址：genome.jp/tools/clustalw/上获得，最后一次访问日期为2017年1月13日）或clustalomega（可在ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/上获得）中来确定。[0135]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的一个位置来确定，该位置可能是为了比较而对齐的。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源度是序列共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列是与本公开的其中一个序列具有小于40%的同一性，或者小于25%的同一性。[0136]如本文所使用的，术语“至少90%同一性”是指两个比较的序列（多核苷酸或多肽）的同一性为约90%至约100%。它还包括至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、约91%至约100%、约92%至约100%、约93%至约100%、约94%至约100%、约95%至约100%、约96%至约100%、约97%至约100%、约98%至约100%、或约99%至约100%的同一性。[0137]如本文所使用的，术语“保留”“类似”和“相同”在描述多核苷酸、蛋白和/或多肽的功能、活性或功能活性时可互换地使用，其指的是参考蛋白、多核苷酸和/或肽的活性为至少约20%（包括但不限于：至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、或约100%）的功能活性。[0138]“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基碱基之间的氢键来稳定。氢键可以通过watson-crick碱基配对、hoogstein结合或任何其他序列特异性方式发生。该复合物可以包含形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如pcr反应的启动，或者核酶对多核苷酸的酶切。[0139]严格杂交条件的示例包括：培养温度为约25℃至约37℃；杂交缓冲液浓度为约6×ssc至约10×ssc；甲酰胺浓度为约0%至约25%；以及洗涤液为约4×ssc至约8×ssc。中等杂交条件的示例包括：培养温度为约40℃至约50℃；缓冲液浓度为约为9×ssc至约2×ssc；甲酰胺浓度为约30%至约50%；以及洗涤液为约5×ssc至约2×ssc。高严格条件的示例包括：培养温度为约55℃至约68℃；缓冲液浓度为约1×ssc至约0.1×ssc；甲酰胺浓度为约55%至约75%；以及洗涤液为约1×ssc至0.1×ssc或去离子水。通常，杂交培养时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多洗涤步骤，以及洗涤培养时间约为1、2或15分钟。ssc为0.15mnacl和15mm柠檬酸盐缓冲液。可以理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的ssc等效物。在一个方面，等效物多核苷酸是指在严格的条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。在另一个方面，等效多肽是指由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。[0140]如本文所使用的，“表达”是指多核苷酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源于基因组dna，则表达可以包括真核细胞中mrna的剪接。[0141]如本文所使用的，术语“功能性”可用于修改任何分子、生物或细胞材料，以使其实现特定的指定作用。[0142]如本文所使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸（核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、互补dna（cdna）、dna-rna杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。在某些实施方案中，多核苷酸包含和/或编码信使rna（mrna）、短发夹rna和/或小发夹rna。在一个实施方案中，多核苷酸是mrna或编码mrna。在某些实施方案中，多核苷酸是双链（ds）dna，例如工程化的dsdna或由单链rna合成的dscdna。[0143]术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单位可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单位可以通过其他键（例如酯键、醚键等）被连接。蛋白质或多肽必须含有至少两个氨基酸，而且对于可以组成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d和l光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。[0144]如本文所使用的，连续的氨基酸序列指具有至少两个氨基酸的序列。然而，需要注意的是，第一部分和第二部分的连续氨基酸序列不限制该氨基酸序列使第一部分直接地结合至第二部分。也可以是第一部分通过第三部分（例如连接）与第二部分相连从而形成一个连续的氨基酸序列。[0145]如本文所使用的，术语“结合”、“共轭”、“偶联”和“缀合”是指分子之间，特别是两个氨基酸序列和/或两个多肽之间键的形成。结合可以是直接的（即键）或间接的（即通过其他分子）。结合可以是共价的或非共价的。[0146]如本文所使用的，连续的氨基酸序列可以包含彼此直接地或间接地（例如通过连接子）连接的两个或更多个的多肽。[0147]如本文所使用的，术语“重组表达系统”是指用于通过重组形成的某些遗传物质的表达的一种或多种遗传构建体。[0148]“基因递送载体”被定义为能够将插入的多核苷酸携带到宿主细胞中的任何分子。基因递送载体的实施例是脂质体、胶束生物相容的聚合物（包括天然聚合物和合成聚合物）；脂蛋白；脂质纳米颗粒；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及细菌、或者病毒（例如狂犬病毒、黄病毒、慢病毒、杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒）、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和已经被描述用于在多种真核和原核宿主中表达的本领域通常使用的并且可以用于基因治疗以及简单的蛋白质表达的其他重组载体。[0149]可以使用基因递送载体将本文公开的多核苷酸递送至细胞或组织。如本文所使用的“基因递送”、“基因转移”、“基于mrna的递送”、“转导”等是指将外源多核苷酸（有时称为“转基因”）引入宿主细胞的术语，而不论采用哪种方法引入。这样的方法包括多种众所周知的技术，例如载体介导的基因转移（通过，例如病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物（包括例如原胺复合物、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、脂质-聚合物混合纳米颗粒和无机纳米颗粒，或其组合））以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔、“基因枪（genegun）”递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术）。引入的多核苷酸可以是未经修饰的，或者可以包括一种或多种修饰；例如，经修饰的mrna可以包含arcacapping；酶促多腺苷酸化添加100-250个腺苷残基的尾巴（seqidno:22）；以及用5-甲基胞苷替换胞苷和/或用伪尿苷替换尿苷中的一种或两种。引入的多核苷酸可以在宿主细胞中稳定地或瞬时地维持。稳定的维持通常需要所引入的多核苷酸含有与宿主细胞相容的复制原点或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子（例如质粒）或核或线粒体染色体。如本领域已知和本文所述的，已知有许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞的转移。[0150]“质粒”是与染色体dna分离的染色体外dna分子，其能够独立于染色体dna而进行复制。在许多情况下，它是环状的和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择优势。质粒可以携带在竞争性环境中对天然存在的抗生素具有抗性的基因，或者替代地产生的蛋白质可以在类似情况下充当毒素。[0151]基因工程中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。许多从商业上获得的质粒可用于此类用途。待复制的基因被插入含有使细胞对特定抗生素具有抗性的基因和多个克隆位点（mcs，或多连接子）的质粒的拷贝中，所述克隆位点是含有几个常用的限制性酶切位点的段区域，其允许在该位置轻松插入dna片段。质粒的另一个主要用途是制备大量的蛋白质。在这种情况下，研究人员使含有带有目的基因的质粒的细菌生长。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，其也可以被诱导以从插入的基因产生大量蛋白质。[0152]“酵母人工染色体“或“yac”是指用于克隆大dna片段（大于100kb，最大可达3000kb）的载体。它是人工构建的染色体，并且包含在酵母细胞中复制和保存所需的端粒、着丝粒和复制起始序列。构建使用最初的环状质粒，使用限制酶将环状质粒线性化，然后dna连接酶可以通过使用粘性末端在线性分子内添加感兴趣的序列或基因。酵母表达载体（例如yac、yip（酵母整合质粒）和yep（酵母游离质粒））非常有用，因为酵母本身就是真核细胞，因次可以得到具有翻译后修饰的真核蛋白质产物，但是已发现yac比bac更加不稳定，产生嵌合效应。[0153]如本文所使用的，术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质壳或外壳。衣壳的功能是衣壳化（encapsidate）、保护、运输病毒基因组并将其释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质（“衣壳蛋白”）的寡聚结构亚基组成。如本文所使用的，术语“衣壳化”是指封闭在病毒衣壳内。[0154]如本文所使用的，关于病毒或质粒的术语“辅助（子）”是指用于提供复制和包装病毒颗粒或重组病毒颗粒（例如本文公开的经修饰的aav）所必需的另外的组分的病毒或质粒。辅助病毒编码的组分可以包括病毒粒子组装、衣壳化、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒可以编码用于病毒基因组的复制的必需的酶。辅助病毒和适用于aav构建体的质粒的非限制性示例包括phelp（质粒）、腺病毒（病毒）或疱疹病毒（病毒）。[0155]如本文所用，可以从对象、细胞系或培养的细胞或组织获得生物样品或样品。示例性样品包括但不限于细胞样品、组织样品、液体样品，例如血液和其他生物来源的液体样品（包括但不限于眼液（房水和玻璃体液）、外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液（csf）、痰、唾液、骨髓、滑液（synovialfluid）、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺灌洗液（broncheoalveolarlavagefluid）、精液、前列腺液、考珀氏液或射精前液体、女性射精、汗液、眼泪、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、腹水、淋巴液、食糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物/冲洗物、滑液、黏膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺吸液、胚泡腔液或脐带血。[0156]如本文所使用的，术语“可检测标志物”是指至少一种能够直接地或间接地产生可检测信号的标志物。这种标志物的非详尽清单包括产生可检测信号的酶，例如通过比色法、荧光法、发光法（例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6磷酸脱氢酶，发色团（chromophore）（例如荧光、发光染料））、通过电子显微镜检测电子密度或通过其电特性（例如电导率、安培法、伏安法）检测的基团、可检测的基团（例如其分子大小足以引起其物理和/或化学性质的可检测的变化，这种检测可通过光学方法（例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化）或物理方法（例如原子力光谱、隧道效应或放射性分子（例如32p、35s、89zr或125i））完成）。[0157]如本文所使用的，术语“纯化标志物”是指至少一种对纯化或鉴定有用的标志物。这种标志物的非详尽清单包括his、lacz、gst、麦芽糖结合蛋白、nusa、bccp、c-myc、cam、flag、gfp、yfp、cherry、硫氧还蛋白、poly（nanp）、v5、snap、ha、几丁质结合蛋白、softag1、softag3、strep或s-蛋白。合适的直接或间接荧光标志物包括flag、gfp、yfp、rfp、dtomato、cherry、cy3、cy5、cy5.5、cy7、dnp、amca、biotin、digoxigenin、tamra、texasred、rhodamine、alexafluors、fitc、tritc或任何其他荧光染料或半抗原。[0158]如本文所使用的，表位标签是生物结构或序列（例如蛋白质或碳水化合物），其作为抗原被抗体识别。在某些实施方案中，表位标签与纯化标志物和/或亲和标签可互换地使用。[0159]“组合物”意指两种或更多种化合物（例如，活性多肽、多核苷酸、病毒载体或抗体的组合）与另一种惰性（例如，可检测的标签）或活性（例如，基因传递载体）化合物或组合物的组合。[0160]“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性或活性载体（例如固体支持物）的组合，从而使该组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。[0161]如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液（例如油/水或水/油乳液）以及各种类型的润湿剂。该组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的示例参见martin(1975)remington’spharm.sci.,15thed.(mackpubl.co.,easton)。[0162]“对象/受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换地使用，并且指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于非人类灵长类动物、鼠、大鼠、兔、猿猴、牛、羊、猪、犬、猫、农场动物、运动动物、宠物、马和灵长类动物，特别是人类。除了对人的治疗有用外，本发明还对伴侣哺乳动物、外来动物和驯养动物，包括哺乳动物、啮齿动物等的兽医治疗有用。在一个实施方案中，哺乳动物包括马、狗和猫。在本发明的另一个实施方案中，人是十八岁以下的青少年或婴儿。[0163]疾病的“治疗”或“疗法”包括：（1）预防疾病，即，使易患该疾病但尚未出现或显示疾病症状的患者不出现疾病的临床症状；（2）抑制疾病，即，阻止或减少疾病或其临床症状的发展；或者（3）缓解疾病，即，导致疾病或其临床症状的消退。在一个方面，术语“治疗”不包括防止或预防。[0164]与术语“治疗”有关的术语“患有”指患者或个人被诊断出患有疾病或易患疾病。[0165]“有效量”是指足以产生有益或预期效果的量。有效量可以通过一次或多次施用、应用或剂量施用。这种递送取决于许多变量，包括单个剂量单位使用的时间段、治疗剂的生物利用率、施用途径等。然而，可以理解的是，本发明的治疗剂用于任何特定对象的具体剂量水平取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性；对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；排泄率；药物组合；以及所治疗的特定疾病的严重程度和施用形式。治疗剂量通常可以进行滴定以优化安全性和疗效。在一个方面，有效量是治疗上的有效量。通常情况下，体外和/或体内试验的剂量-效果关系最初可以为患者施用的适当剂量提供有用的指导。一般来说，人们希望施用一定量的化合物以达到与在体外发现的有效浓度相称的血清水平。这些参数的确定完全属于本领域的技术范畴。这些考虑因素以及有效的配方和施用程序在本领域是众所周知的并被描述于标准教科书中。与此定义一致，如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指足以抑制离体、体外或体内rna病毒复制的量。[0166]术语施用应包括但不限于通过口服、肠胃外（例如肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用，并且可以单独或一起被配制成合适的剂量单位制剂，其含有适合每种施用途径的常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂和载体。本发明不受施用途径、试剂或施用时间的限制。[0167]如本文所使用的，术语“aav”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链dna细小病毒，仅在通过共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。目前有十三种血清型的aav已被表征。aav的一般信息和评论可以在例如carter,handbookofparvoviruses1:169-228,1989,andberns,virology1743-1764,1999中找到。然而，完全可以预期，这些相同原理将适用于其他aav血清型，因为众所周知，各种血清型在结构上和功能上、甚至在遗传水平上都有十分紧密相关。（例如，参见blacklowe,parvovirusesandhumandisease165-174,1988,j.r.pattison,ed.；以及rose,comprehensivevirology3:1-61,1974）。例如，所有aav血清型显然都表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且都携带有三种相关的衣壳蛋白，例如在aav2中表达的那些。异源双链分析进一步表明了相关程度，该分析揭示了沿基因组长度的血清型之间广泛的交叉杂交；以及在末端与“末端反向重复序列”（itr）相对应的类似自退火片段的存在。类似的传染性模式也表明，每种血清型中的复制功能都处于类似的调节控制之下。[0168]如本文所使用的，“aav表达盒”是指包含侧接于aav末端重复序列（itr）的一个或多个感兴趣的多核苷酸（或转基因）的核苷酸序列。当存在于已被编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，这种aav表达盒可以被复制并包装成感染性病毒颗粒（例如aav载体）。[0169]“aav病毒粒子”或“aav载体”或“aav病毒颗粒”或“aav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸aav表达盒组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸（即，野生型aav基因组以外的多核苷酸，例如待递送给哺乳动物细胞的转基因），则通常被称为“aav载体颗粒”或简称为“aav载体”。因此，aav载体颗粒的产生必然包括aav表达盒的产生，因为这样的质粒被包含在aav载体颗粒中。[0170]腺相关病毒（aav）是一种复制缺陷型细小病毒，其单链dna基因组的长度约为4.7kb，包括两个145个核苷酸的末端反向重复序列（itr）。aav有多种血清型。aav血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，aav血清型2（aav2）基因组的核苷酸序列在srivastavaetal.,jvirol,45:555-564(1983)中提出，并由ruffingetal.,jgenvirol,75:3385-3392(1994)进行修正。作为其他实施例，genbank登录号nc_002077中提供了aav-1的完整基因组；genbank登录号nc_1829中提供了aav-3的完整基因组；genbank登录号nc_001829中提供了aav-4的完整基因组；genbank登录号af085716中提供了aav-5的基因组；genbank登录号nc_001862中提供了aav-6的完整基因组；genbank登录号ax753246和ax753249中分别提供了aav-7和aav-8基因组的至少一部分（也参见与aav-8有关的美国专利第7,282,199和7,790,449号）；gaoetal,j.virol.,78:6381-6388(2004)中提供了aav-9基因组；mol.ther.,13(1):67-76(2006)中提供了aav-10基因组；以及virology,330(2):375-383(2004)中提供了aav-11基因组。rodino-klapac.,etal.journaloftranslationalmedicine5,45(2007)中描述了aavrh.74血清型的克隆。指导病毒dna复制（rep）、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列被包含在itr中。三个aav启动子（因其相对图谱位置而命名为p5、p19和p40）驱动编码rep和cap基因的两个aav内部开放阅读框的表达。两个rep启动子（p5和p19），加上单个aav内含子的差异剪接（例如在aav2核苷酸2107和2227处），导致从rep基因产生四个rep蛋白（rep78、rep68、rep52和rep40）。rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶学性质。cap基因是从p40启动子表达的，并且它编码三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。替代的剪接和非共有的翻译起始位点负责三种相关的衣壳蛋白的产生。单个共有多腺苷酸化位点位于aav基因组的图谱位置95。muzyczka,currenttopicsinmicrobiologyandimmunology,158:97-129(1992)中综述了aav的生命周期和遗传学。[0171]本公开的重组aav基因组包含本发明的核酸分子和在该核酸分子侧翼的一个或多个aavitr。raav基因组中的aavdna可以来自用于可以衍生包括但不限于以下aav血清型的重组病毒的任何aav血清型：aavrh.74、aavrh.10、aavrh.20、aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12和aav-13。假型raav的产生公开于例如wo01/83692。也可以预期其他类型的raav变体，例如具有衣壳突变的raav。参见，例如，marsicetal.,moleculartherapy,22(11):1900-1909(2014)。如上述
背景技术：
：：部分所提及的，各种aav血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。在一些实施方案中，使用aav1、aav6、aav8或aavrh.74以促进骨骼肌特异性表达。[0172]如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个或一种”和“该或所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。[0173]如本文所使用的，术语“包含”或“包括”旨在表示包括所列举的要素但不排除其他元素的组合物和方法。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应表示排除对于所述目的而言对组合具有任何实质意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物将不会从分离和纯化方法以及药学上可接受的载体（例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等）中排除痕量污染物。“由……组成”是指排除其他成分和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤的或用于生产组合物或实现预期结果的工艺步骤的痕量元素。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方案在本发明的范围内。[0174]如本文关于核酸（例如dna或rna）所用，术语“分离的”是指分别与存在于大分子天然来源中的其他dna或rna分离的分子。术语“分离的核酸”是指包括非天然存在为片段的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白分离的多肽、蛋白和/或宿主细胞，并且意在涵盖纯化的和重组的多肽。在其他实施方案中，术语“分离的”是指与成分、细胞和其他分离，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在自然界中是相关联的。例如，分离的细胞是与具有不同表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。对本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”即可将其与天然存在的对应物区分开。[0175]本文中关于多肽或多核苷酸（例如dna或rna）的术语“重组”是指通过实验室的重组方法（例如分子克隆）形成的分子。分子克隆技术是本领域已知的，可以包括但不限于多核苷酸的pcr扩增、多核苷酸的酶解、多核苷酸与表达盒（例如哺乳动物表达盒）的连接（ligation）、用多核苷酸转化、转染或转导细胞，以及多核苷酸的表达来产生多肽。参见，例如greenandsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual,2012。术语“重组多核苷酸”是指包括编码蛋白质的多核苷酸的片段。例如，重组多核苷酸可以包括编码人dysferlin蛋白的多核苷酸的片段。重组多核苷酸可以通过编码蛋白质的多核苷酸的片段的pcr扩增产生。重组多肽可以通过一个或多个重组多核苷酸的表达产生。[0176]本文公开了编码人dysferlin（hdsysf）蛋白的片段的多核苷酸。本文进一步公开了包含编码人dysferlin（hdsysf）蛋白的片段的多核苷酸的质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物。本文还公开了制备和使用这种多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物的方法。[0177]本文公开了一种编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列由以下序列组成：（a）seqidno：1、6或18的核苷酸序列；（b）与seqidno：1、seqidno：6或seqidno：18的核苷酸序列在seqidno：1、6或18各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（c）seqidno：13或15的核苷酸序列；（d）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（e）编码hdysf蛋白的核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（f）与（e）的核苷酸序列在（e）的核苷酸序列全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。[0178]本文进一步公开了编码人dysferlin蛋白的片段的重组多核苷酸序列，其中所述重组多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列由以下序列组成：（a）seqidno：2、8或19的核苷酸序列；（b）与seqidno：2、8或19的核苷酸序列在seqidno：2、8或19各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（c）seqidno：14或16的核苷酸序列；（d）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16各自的全长上有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列；（e）编码hdysf蛋白的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（f）与（e）的多核苷酸序列在（e）的核苷酸序列全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。[0179]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）载体。在一些实施方案中，腺相关病毒（aav）载体包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中该多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：1或6的核苷酸序列；（ii）与seqidno：1或6的核苷酸序列在seqidno：1或6的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：13或15的核苷酸序列；（iv）与seqidno：13或15的核苷酸序列在seqidno：13或15全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr。[0180]在一些实施方案中，腺相关病毒（aav）载体包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下序列组成：（i）seqidno：2或8的核苷酸序列；（ii）与seqidno：2或8的核苷酸序列在seqidno：2或8的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno：14或16的核苷酸序列；（iv）与seqidno：14或16的核苷酸序列在seqidno：14或16的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸的侧翼是第一和第二itr。[0181]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）表达盒。在一些实施方案中，aav表达盒包含（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的5'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中所述第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的5'hydsyf多核苷酸的侧翼是（a）和（c）的第一和第二itr。[0182]在一些实施方案中，aav表达盒包含：（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的3'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中所述第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的3'hydsyf多核苷酸的侧翼是（a）和（c）的第一和第二itr。[0183]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）载体。在一些实施方案中，aav载体包含：（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的5'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的5'hydsyf多核苷酸的侧翼为（a）和（c）的第一和第二itr。[0184]在一些实施方案中，aav载体包含：（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的3'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的3'hydsyf多核苷酸的侧翼为（a）和（c）的第一和第二itr。[0185]本文进一步公开了双腺相关病毒（aav）载体系统。在一些实施方案中，双aav载体系统包含：（a）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸；以及（b）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸。[0186]本文进一步公开了双腺相关病毒（aav）载体系统。在一些实施方案中，所述双aav载体系统包含以下组分，由以下组分组成或基本上由以下组分组成：（a）第一aav载体，其中所述第一aav载体包含任何本文公开的5'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成；以及（b）第二aav载体，其中所述第二aav载体包含任何本文公开的3'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成。[0187]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）载体。在一些实施方案中，aav载体包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸。[0188]在一些实施方案中，aav载体包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸。[0189]在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体（例如病毒或病毒颗粒）、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含一个或多个核苷酸序列，该序列包含末端反向重复序列（itr）、启动子、内含子、选择标志物或复制原点（ori），由其组成或基本上由其组成。[0190]在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含一个或多个另外的核苷酸序列，该序列包含末端反向重复序列（itr）、选择标志物、复制原点（ori）、非翻译区（utr）或多腺苷酸化（polya）信号。[0191]本文进一步公开了治疗dysferlin肌病的方法。在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含向有此需要的对象施用本文公开的任何多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物。[0192]本文进一步公开了任何本文所公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物在制备用于治疗dysferlin肌病的药物中的用途。[0193]同源的重组和hdysf片段aav介导的基因疗法为多种疾病提供了理想的治疗策略；然而，其受到aav病毒粒子4.7kb包装限制的阻碍。特别值得关注的是目前没有治愈或有效疗法的疾病（例如dysferlin肌病）。本文公开了一种通过两部分的基因组的同源重组制备或产生全长的dysferlin基因的方法。在一个实施例中，两个部分包装的基因组如图1所示，为paav.mhck7.dysf5'.ptg和paav.dysf3'.polya。无论是通过被包装成aav载体的病毒递送还是非病毒方法（例如lnp），一旦这两个基因组被递送到细胞（例如肌细胞），它们就会产生包含全长dysferlin编码区的转录本，导致功能性dysferlin蛋白的表达。两个多核苷酸之间的重叠区域促进了同源重组，导致含有全长dysferlin基因的转录本。通过将全长的dysferlin基因分离成两个部分包装的基因组，该方法成功地绕过了aav包装的限制并且产生了功能性的全长dysferlin基因。在一个实施方案中，转录本是包含与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列的表达盒。在一个实施方案中，转录本是包含seqidno：20的序列的表达盒。[0194]在一些实施方案中，本文公开了一种编码人dysferlin（hdysf）蛋白的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸序列包含seqidno：20的核苷酸序列或与seqidno：20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在某些情况下，重组多核苷酸包含seqidno:20的核苷酸序列。在某些情况下，本文公开了一种制备重组多肽的方法。在一些情况下，所述方法包含使细胞与编码hdysf蛋白的5'片段的重组多核苷酸和编码hdysf蛋白的3'片段的第二重组多核苷酸接触。在某些情况下，所述方法包含使细胞与本文所述的双aav载体系统接触。在一些情况下，所述细胞是真核细胞，任选地肌肉细胞、心脏细胞和/或肝脏细胞。在一些情况下，所述方法包含向对象施用编码hdysf蛋白的5'片段的重组多核苷酸和编码hdysf蛋白的3'片段的第二重组多核苷酸。在某些情况下，所述方法包含向对象施用本文所述的双aav载体系统。在一些情况下，所述方法包含通过表达包含seqidno:20或与seqidno:20的核苷酸序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的重组多核苷酸来治疗对象的肌营养不良症。在一些情况下，对象患有dysferlin肌病，任选地选自lgmd2b或三好氏肌肉病变。4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本由其组成，其中5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的全长上是seqidno：11的核苷酸序列的至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的全长上是seqidno：11的核苷酸序列的至少85%。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的全长上是seqidno：11的核苷酸序列的至少90%。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750、或377-3716之间区域的全长上是seqidno：11的核苷酸序列的至少95%。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0198]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355个之间的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含15个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含10个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含5个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含1个核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之间区域中包含至少1个核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno:11的核苷酸377-3716之间区域中包含至少1个的核苷酸错配。在一些实施方案中，该5'hdysf多核苷酸不进一步包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0199]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno：11的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355连续核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdsyf多核苷酸包含包括seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno：11的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdsyf多核苷酸包含包括seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与含有seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列有至少85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与含有seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列在该区域的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与含有seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列在该区域的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与含有seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列在该区域的全长上有至少99%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包括编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0200]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的与包含seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含5个或更少的与包含seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含2个或更少的与包含seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含1个或更少的与包含seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的核苷酸序列的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0201]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中该5'hdsyf多核苷酸包含包括seqidno:11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域，其中5'hdysf多核苷酸在包含seqidno：11的核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0202]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含seqidno：11的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355个之间连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno:11的核苷酸位置1-100、1-200、1-300、1-350、1-375、1-376、100-200、100-300、100-350、100-375、100-376、200-300、200-350、200-375或200-376组成的区域。在一些实施方案中，5'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno：11的核苷酸位置1-376组成的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0203]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno:11的核苷酸位置1-100、1-200、1-300、1-350、1-375、100-200、100-300、100-350、100-375、200-300、200-350、200-375组成的区域。在一些实施方案中，5'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno：11的核苷酸位置1-376组成的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0204]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:1的核苷酸序列在seqidno:1的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:1的核苷酸序列在seqidno:1的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:1的核苷酸序列在seqidno:1的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:1的核苷酸序列在seqidno:1的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列，或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0205]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含seqidno:13的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:13的核苷酸序列在seqidno:13的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:13的核苷酸序列在seqidno:13的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:13的核苷酸序列在seqidno:13的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:13的核苷酸序列在seqidno:13的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0206]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含编码包含野生型hdsyf蛋白的n端区域的hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，包含野生型hdsyf蛋白的n端区域的hdysf蛋白的片段被称为n端hdysf蛋白。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白包含：包括seqidno：12的氨基酸残基1-1113、200-1113、400-1113、500-1113、600-1113、650-113、650-1100、700-1100、700-1113、700-1050、700-1000、800-1113、800-1100、800-1050、900-1113、900-1100、1000-1113或1000-1100、由其组成或基本上由其组成的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含：与编码n端hdysf蛋白质的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白包含：包括seqidno：12的氨基酸残基1-1113、200-1113、400-1113、500-1113、600-1113、650-113、650-1100、700-1100、700-1113、700-1050、700-1000、800-1113、800-1100、800-1050、900-1113、900-1100、1000-1113、或1000-1100、由其组成或基本上由其组成的区域。在一些实施方案中，n端hdysf蛋白包含：包括氨基酸残基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100、由其组成或基本上由其组成的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0207]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白的长度为至少1000个氨基酸，并且其中n端hdysf蛋白包含包括seqidno:12的氨基酸残基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100的区域，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白的长度为至少1000个氨基酸，并且其中n端hdysf蛋白包含包括seqidno：12的氨基酸残基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100的区域。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0208]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白包含seqidno:9的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白第二片段的第二多核苷酸序列。[0209]在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中该n端hdysf蛋白包含seqidno:9的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白包含seqidno:9的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中n端hdysf蛋白包含seqidno:9的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸包含与编码n端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码n端hdysf蛋白的核苷3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900个之间的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的4100、4000、3900、3880或3870个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0213]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900个之间的连续的核苷酸，由其组成或基本由其组成，其中3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的4100、4000、3900、3880或3870个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本由其组成，其中3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少85%。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少90%。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的全长上是seqidno:11的核苷酸序列的至少95%。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0214]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900个之间的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno:11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域的4100、4000、3900、3880、或3870个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含15个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620、或2754-6619之间的区域包含10个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含5个或更少的核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含1个核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之间区域中包含至少1个核苷酸错配。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸在seqidno：11的核苷酸2754-6619之间区域中包含至少1个核苷酸错配。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0215]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno：11的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000、or3800-3900之间连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成，其中5'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno：11的核苷酸位置6620-6914、6620-6900、6620-6800、6620-6700、6700-6914、6700-6800、6800-6914或6800-6900组成的区域。在一些实施方案中，3'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno：11的核苷酸位置6620-6914组成的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0216]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：seqidno：11的4100、4000、3900、3880或3870个或更少的连续的核苷酸，由其组成或基本上由其组成其中3'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno:11的核苷酸位置6620-6914、6620-6900、6620-6800、6620-6700、6700-6914、6700-6800、6800-6914、或6800-6900组成的区域。在一些实施方案中，3'hdsyf多核苷酸不包含由seqidno：11的核苷酸位置6620-6914组成的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0217]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含seqidno:2的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:2的核苷酸序列在seqidno:2的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:2的核苷酸序列在seqidno:2的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:2的核苷酸序列在seqidno:2的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:2的核苷酸序列在seqidno:2的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0218]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含seqidno:14的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:14的核苷酸序列在seqidno:14的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:14的核苷酸序列在seqidno:14的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:14的核苷酸序列在seqidno:14的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与seqidno:14的核苷酸序列在seqidno:14的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0219]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含编码包括野生型hdsyf蛋白的c端区域的hdysf蛋白的片段的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，包含野生型hdsyf蛋白的c端区域的hdysf蛋白的片段被称为c端hdysf蛋白。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含：包括seqidno：12的氨基酸残基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900、由其组成或基本上由其组成的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含：包括seqidno：12的氨基酸残基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900、由其组成或基本上由其组成的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0220]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含长度为1400、1350、1325、1300、1290或1287个或更少的氨基酸，并且其中c端hdysf蛋白包含包括seqidno：12的氨基酸残基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白的长度为1400、1350、1325、1300、1290或1287个或更少的氨基酸，并且其中c端hdysf蛋白包含包括seqidno:12的氨基酸残基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0221]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含：长度为1400、1350、1325、1300、1290或1287或更少的氨基酸，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白不包含：包括seqidno：12的氨基酸残基678-793、678-750、678-725或678-700的区域。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0222]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中该c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0223]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中该c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中该c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少92%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含：与编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列在编码c端hdysf蛋白的核苷酸序列的全长上有至少97%同一性的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，其中c端hdysf蛋白包含seqidno:10的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，c端hdysf蛋白包含与seqidno:10的氨基酸序列在seqidno:10的全长上有至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c端hdysf蛋白包含与seqidno:10的氨基酸序列在seqidno:10的全长上有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c端hdysf蛋白包含与seqidno:10的氨基酸序列在seqidno:10的全长上有至少92%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c端hdysf蛋白包含与seqidno:10的氨基酸序列在seqidno:10的全长上有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c端hdysf蛋白包含与seqidno:10的氨基酸序列在seqidno:10的全长上有至少97%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0224]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含seqidno:8的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:8的核苷酸序列在seqidno:8的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:8的核苷酸序列在seqidno:8的全长上有至少85%的同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:8的核苷酸序列在seqidno:8的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0225]在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含seqidno:16的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:16的核苷酸序列在seqidno:16的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:16的核苷酸序列在seqidno:16的全长上有至少85%的同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸包含与seqidno:16的核苷酸序列在seqidno:16的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。[0226]在一些实施方案中，5'hdsyf多核苷酸和3'hdysf多核苷酸的序列包含至少500、600、700、800、900、950、960或963个核苷酸的重叠。在一些实施方案中，n端hdsyf蛋白和c端hdsyf蛋白的序列包含至少50、100、150、200、250、300或320个氨基酸的重叠。[0227]末端反向重复序列在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含：包括一个或多个末端反向重复序列（itr）、由其组成或基本上由其组成的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含两个、三个、四个、五个或六个或更多个包含两个、三个、四个、五个或六个或更多个itr的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，两个或更多个itr是相同的。在一些实施方案中，两个或更多个itr是不同的。[0228]在一些实施方案中，重组多核苷酸的侧翼是两个或更多个itr。在一些实施方案中，5'hdysf多核苷酸的侧翼是第一对itr。在一些实施方案中，3'hdysf多核苷酸的侧翼是第二对itr。在一些实施方案中，第一对itr中的itr是相同的。在一些实施方案中，第一对itr中的itr是不同的。在一些实施方案中，第二对itr中的itr是相同的。在一些实施方案中，第二对itr中的itr是不同的。在一些实施方案中，第一对itr中的itr与第二对itr中的itr相同。在一些实施方案中，第一对itr中的至少一个itr与第二对itr中的至少一个itr相同。在一些实施方案中，第一对itr中的itr与第二对itr中的itr不同。在一些实施方案中，第一对itr中的至少一个itr与第二对itr中的至少一个itr不同。[0229]在一些实施方案中，itr是病毒性itr。在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr选自aav血清型aavrh.20、aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aavrh.74、aav-8、aav-9、aav-10、aavrh.10、aav-11、aav-12和aav-13中的至少一种的itr。在一些实施方案中，aavitr是aav2itr。在一些实施方案中，aavitr是aav5itr。aav1-6的itr序列可以在例如grimmetal.,j.virol.80(1):426-39,2006中找到，其通过引用整体并入本文。[0230]在一些实施方案中，重组多核苷酸不包含除末端反向重复序列（itr）以外的aav序列。[0231]在一些实施方案中，重组多核苷酸不包含除末端反向重复序列（itr）以外的病毒序列。[0232]在一些实施方案中，itr包含seqidno:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含与seqidno:3的核苷酸序列在seqidno:3的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含seqidno:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含与seqidno:3的核苷酸序列在seqidno:3的全长上有至少90%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含与seqidno:3的核苷酸序列在seqidno:3的全长上有至少95%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含包括与seqidno:3的核苷酸序列有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个或更少的核苷酸错配的核苷酸序列。在一些实施方案中，itr包含包括与seqidno:3的核苷酸序列有5个或更少的核苷酸错配的核苷酸序列。[0233]启动子在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括一个或多个启动子，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，启动子是真核生物启动子。真核生物启动子的示例包括但不限于巨细胞病毒（cmv）启动子、延伸因子1α（ef1a）启动子、cag启动子、磷酸甘油酸激酶基因（pgk）启动子、四环素反应元件（tre）启动子、人u6核（u6）启动子和uas启动子。在一些实施方案中，启动子是哺乳动物的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是可诱导的启动子。[0234]在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。组织的示例包括但不限于肌肉组织、上皮组织、结缔组织和神经组织。组织特异性启动子的示例包括但不限于：b29启动子、cd14启动子、cd43启动子、cd45启动子、cd68启动子、肌间线蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白（endoglin）启动子、纤连蛋白启动子、flt-1启动子、gfap启动子、icam-2启动子、inf-β启动子、mb启动子、nphsi启动子、og-2启动子、sp-b启动子、syn1启动子、wasp启动子、sv40/balb启动子、sv40/halb启动子、sv40/cd43启动子、sv40/cd45启动子和nse/ru5'启动子。[0235]在一些实施方案中，启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子是肌球蛋白重链复合物-e盒肌肉肌酸激酶融合增强子/启动子。[0236]在一些实施方案中，启动子是重组启动子。在一些实施方案中，重组启动子是重组肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，重组肌肉特异性启动子是重组肌球蛋白重链-肌酸激酶肌肉特异性启动子。在另一个实施方案中，肌肉特异性启动子包含人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌间线蛋白启动子、骨骼α-肌动蛋白（aska）启动子、肌钙蛋白i（tnni2）启动子、心肌特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶（mck）启动子、截短的mck（tmck）启动子、肌球蛋白重链（mhc）启动子、混合肌球蛋白重链增强子/mck增强子-启动子（mhck7）启动子、c5-12启动子、小鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导性核因子。[0237]在一些实施方案中，启动子包含seqidno:4的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包含与seqidno:4的核苷酸序列在seqidno:4的全长上有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。[0238]内含子在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括含一个或多个内含子，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，内含子是真核生物内含子。在一些实施方案中，内含子是哺乳动物的内含子。在一些实施方案中，内含子是合成的内含子。在一些实施方案中，内含子是嵌合的内含子。在一些实施方案中，内含子来自非编码外显子。在一些实施方案中，内含子在5'或至5'hdysf多核苷酸的上游。[0239]在一些实施方案中，内含子包含5'供体位点、分支点或3'剪接位点中的至少一个。在一些实施方案中，内含子包含两个或更多个5'供体位点、分支点或3'剪接位点。在一些实施方案中，内含子包含5'供体位点、分支点和3'剪接位点。[0240]在一些实施方案中，内含子包含来自人类β-球蛋白基因的5'供体位点。[0241]在一些实施方案中，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的分支点。[0242]在一些实施方案下，内含子包含来自免疫球蛋白g（igg）重链的3'剪接受体位点。[0243]在一些实施方案中，内含子包含seqidno:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，内含子包含与seqidno:5的核苷酸序列在seqidno:5的全长上有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。[0244]选择标志物在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个选择标志物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，选择标志物是细菌可选择标志物。在一些实施方案中，选择标志物是抗生素抗性基因。抗生素抗性基因的示例包括但不限于β-内酰胺酶、卡那霉素抗性基因、来自tn5的neo基因、来自大肠杆菌基因组的突变体fabi基因和ura3（来自酵母的乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶）。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。[0245]多腺苷酸化信号在一些实施方案中，多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统、病毒包装系统、细胞和组合物进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个多腺苷酸化（polya）信号，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，polya信号是人工polya信号。[0246]在一些实施方案中，polya信号包含seqidno:7的核苷酸序列。在一些实施方案中，polya信号包含与seqidno:7的核苷酸序列在seqidno:7的全长上有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。[0247]表达盒和包装系统本文进一步公开了腺相关病毒（aav）表达盒。在一些实施方案中，aav表达盒包含：（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的5'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的5'hydsyf多核苷酸的侧翼为（a）和（c）的第一和第二itr。在一些实施方案中，包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸的aav表达盒被称为5'hdysfaav表达盒。[0248]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）质粒。在一些实施方案中，aav表达盒包含（a）第一末端反向重复序列（itr），其中第一itr包含任何本文公开的itr；（b）任何本文公开的3'hdysf多核苷酸；以及（c）第二itr，其中第二itr包含任何本文公开的itr，其中（b）的3'hydsyf多核苷酸的侧翼为（a）和（c）的第一和第二itr。在一些实施方案中，包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸的aav表达盒被称为3'hdysfaav表达盒。[0249]在一些实施方案中，腺相关病毒（aav）表达盒包含：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin（hdysf）蛋白的片段的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno:1的核苷酸序列；（ii）与seqidno:1的核苷酸序列在seqidno：1的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno:13的核苷酸序列；（iv）与seqidno:13的核苷酸序列在seqidno:13的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:9的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸序列的侧翼为第一和第二itr。在一些实施方案中，任何本文公开的aav表达盒进一步包含一个或多个另外的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含启动子、内含子、选择标志物或复制原点（ori）。在一些实施方案中，aav表达盒包含seqidno：6的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含与seqidno:6的核苷酸序列在seqidno:6的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含seqidno:15的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含与seqidno:15的核苷酸序列在seqidno:15的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒进一步不包含编码hdysf蛋白的第二片段的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒不包含除末端反向重复序列（itr）以外的aav序列。在一些实施方案中，aav表达盒不包含除末端反向重复序列（itr）以外的病毒序列。[0250]在一些实施方案中，腺相关病毒（aav）表达盒包括：（a）第一末端反向重复序列（itr）；（b）编码人dysferlin蛋白的片段的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列由以下序列组成：（i）seqidno:2的核苷酸序列；（ii）与seqidno:2的核苷酸序列在seqidno：2的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（iii）seqidno:14的核苷酸序列；（ii）与seqidno:14的核苷酸序列在seqidno:14的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；（v）编码hdysf蛋白的多核苷酸序列，其中hdysf蛋白由seqidno:10的氨基酸序列组成；或者（vi）与（v）的多核苷酸序列在（v）的核苷酸序列的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列；以及（c）第二itr，其中多核苷酸序列的侧翼是第一和第二itr。在一些实施方案中，aav表达盒包含seqidno：8的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含与seqidno:8的核苷酸序列在seqidno:8的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含seqidno:16的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒包含与seqidno:16的核苷酸序列在seqidno:16的全长上有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，aav表达盒进一步包含一个或多个多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含选择标志物、复制原点（ori）、非翻译区（utr）或多腺苷酸化（polya）信号。[0251]本文进一步公开了腺相关病毒（aav）包装系统。在一些实施方案中，aav包装系统包含：（a）任何本文公开的5'hdysfaav表达盒；（b）腺病毒辅助质粒；以及（c）rep-cap质粒。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含来自腺病毒的一个或多个基因。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因介导aav的复制。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因选自e4、e2a和va。在一些实施方案中，rep-cap质粒包含一个或多个编码腺相关病毒rep和cap基因的多核苷酸。在一些实施方案中，rep基因编码选自rep78、rep68、rep62和rep40的生命周期蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，cap基因编码选自vp1、vp2和vp3的衣壳蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，5'hdysfaav表达盒包含一个或多个itr。在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr的血清型与aav衣壳蛋白的血清型相同。在一些实施方案中，aavitr的血清型与aav衣壳蛋白的血清型不同。在一些实施方案中，aavrep基因的血清型与aav衣壳蛋白的血清型相同。在一些实施方案中，aavrep基因的血清型与aav衣壳蛋白的血清型不同。在一些实施方案中，包含任何本文公开的5'hdysfaav表达盒的aav包装系统被称为5'hdysfaav包装系统。[0252]在一些实施方案中，aav包装系统包含：（a）任何本文公开的3'hdysfaav表达盒；（b）腺病毒辅助质粒；以及（c）rep-cap质粒。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包括来自腺病毒的一个或多个基因。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因介导aav的复制。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因选自e4、e2a和va。在一些实施方案中，rep-cap质粒包含一个或多个编码腺相关病毒rep和cap基因的多核苷酸。在一些实施方案中，rep基因编码选自rep78、rep68、rep62和rep40的生命周期蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，cap基因编码选自vp1、vp2和vp3的衣壳蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，3'hdysfaav表达盒包含一个或多个itr。在一些实施方案中，itr是aavitr。在一些实施方案中，aavitr的血清型与aav衣壳蛋白的血清型相同。在一些实施方案中，aavitr的血清型与aav衣壳蛋白的血清型不同。在一些实施方案中，aavrep基因的血清型与aav衣壳蛋白的血清型相同。在一些实施方案中，aavrep基因的血清型与aav衣壳蛋白的血清型不同。在一些实施方案中，包含任何本文公开的3'hdysfaav表达盒的aav包装系统被称为3'hdysfaav包装系统。[0253]在一些实施方案中，腺相关病毒包装系统包含：（a）任何本文公开的5'hdysfaav表达盒；以及（b）腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含来自腺病毒的一个或多个基因。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因介导aav的复制。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因选自e4、e2a和va。[0254]在一些实施方案中，腺相关病毒包装系统包括：（a）任何本文公开的3'hdysfaav表达盒；以及（b）腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含来自腺病毒的一个或多个基因。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因介导aav的复制。在一些实施方案中，来自腺病毒的一个或多个基因选自e4、e2a和va。[0255]病毒载体本文进一步公开了腺相关病毒（aav）载体（例如aav病毒或aav颗粒）。在一些实施方案中，aav载体包括任何本文公开的5'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸的aav载体被称为5'hdysfaav载体。[0256]在一些实施方案中，5'hdysfaav载体包含本文公开的任何5'hdysfaav表达盒。[0257]在一些实施方案中，aav载体包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸的aav载体被称为3'hdysfaav载体。[0258]在一些实施方案中，3'hdysfaav载体包含任何本文公开的3'hdysfaav表达盒。[0259]在一些实施方案中，aav载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh.10、rh.20或rh.74的aav。在一些实施方案中，aav载体是血清型rh.74的aav。在一些实施方案中，aav载体不是血清型5的aav。[0260]本文进一步公开了双腺相关病毒（aav）载体系统，其包含两个或更多个本文公开的aav载体。在一些实施方案中，双aav载体系统包含：（a）第一aav载体，其中第一aav载体包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸；以及（b）第二aav载体，其中第二aav载体包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸。[0261]在一些实施方案中，双aav载体系统包含：（a）第一aav载体，其中第一aav载体包含任何本文公开的5'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成；以及（b）第二aav载体，其中第二aav载体包含任何本文公开的3'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成；由其组成或基本上由其组成。[0262]组合物本文进一步公开了包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸、由其组成或基本上由其组成的组合物。本文进一步公开了包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸、由其组成或基本上由其组成的组合物。本文进一步公开了包含任何本文公开的5'hdysf质粒、由其组成或基本上由其组成的组合物。本文进一步公开了包含任何本文公开的3'hdysf质粒、由其组成或基本上由其组成的组合物。本文进一步公开了包含任何本文公开的双aav载体系统、由其组成或基本上由其组成的组合物。本文进一步公开了包含任何本文公开的aav载体、由其组成或基本上由其组成的组合物。[0263]本文进一步公开了包含以下的组合物：（a）重组腺相关病毒（raav）载体，其中raav载体包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成；以及（b）药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂；由其组成或基本上由其组成。[0264]本文进一步公开了包含以下的组合物：（a）重组腺相关病毒（raav）载体，其中raav包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成；以及（b）药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂；由其组成或基本上由其组成。[0265]本文进一步公开了包含以下的组合物：（a）第一重组腺相关病毒（raav），其中第一raav包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成；以及（b）第二重组腺相关病毒（raav），其中第二raav包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成；由其组成或基本上由其组成。[0266]本文进一步公开了包含以下组合物：（a）第一腺相关病毒（aav）颗粒，其中第一aav颗粒包括任何本文公开的5'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成；以及（b）第二腺相关病毒（aav）颗粒，其中第二aav颗粒包含任何本文公开的3'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成；由其组成或基本上由其组成。[0267]在一些实施方案中，任何本文公开的组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者无毒且优选地在所使用的剂量和浓度下是惰性的，并包括缓冲剂和表面活性剂（例如普兰尼克（pluronic））。可接受的载体的示例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。[0268]药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂适合注射使用。适合注射使用的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的示例包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下的制剂必须是无菌的，而且必须是流动的以便易于注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物（例如细菌和真菌）的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）、其适当的混合物和植物油。例如，可以通过使用涂层（例如卵磷脂）在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小以及使用表面活性剂来保持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂（例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等）来实现。在许多情况下，其优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。通过使用延迟吸收剂（例如单硬脂酸铝和明胶）可以延长可注射的组合物的吸收时间。[0269]无菌注射液通过将本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体或双载体系统按所需要的量加入适当的溶剂中，并按需要加入上述各种其他成分，然后进行过滤消毒来制备。一般来说，分散体通过将灭菌的活性成分加入无菌载体中来制备，该载体含有基本的分散介质和上面列举的所需的其他成分。在制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末和任何另外的所需成分。[0270]产生aav载体的方法本文公开了产生腺相关病毒（aav）载体（例如，病毒或病毒颗粒）的方法。产生aav载体的方法在本领域是已知的。例如，这种方法在例如wo01/83692中被公开，其内容并通过引用整体并入本文中。aav产生的一般原则在例如carter,currentopinionsinbiotechnology1533-1539,1992；和muzyczka,curr.topicsinmicrobial.andimmunol.158:97-129,1992中总结，其中每篇文章都通过引用整体并入本文。产生aav的各种方法描述于ratschinetal.,mol.cell.biol.4:2072,1984；hermonatetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:6466,1984；tratschinetal.,mo1.cell.biol.5:3251,1985;mclaughlinetal.,j.virol.,62:1963,1988；以及lebkowskietal.,mol.cell.biol.,7:349,1988；samulskietal.,j.virol.,63:3822-3828,1989；美国专利申请第5,173,414号；wo95/13365以及对应的美国专利申请第5,658.776号；wo95/13392；wo96/17947；pct/us98/18600；wo97/09441(pct/us96/14423)；wo97/08298(pct/us96/13872)；wo97/21825(pct/us96/20777)；wo97/06243(pct/fr96/01064)；wo99/11764；perrinetal.,vaccine13:1244-1250,1995；pauletal.,humangenetherapy4:609-615,1993；clarketal.,genetherapy3:1124-1132,1996；美国专利申请第5,786,211号；美国专利申请第5,871,982号；以及美国专利申请第6,258,595号，其中每一项通过引用整体并入本文。[0271]在一些实施方案中，产生腺相关病毒（aav）载体的方法包含用任何本文公开的aav包装系统转导细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是稳定地表达腺相关病毒rep和cap基因的重组细胞。在一些实施方案中，方法进一步包含培养该细胞以产生转导的细胞的群体。在一些实施方案中，方法进一步包含收集来自转导的细胞的群体的上清液。在一些实施方案中，方法进一步包含将上清液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。替代地或另外地，方法进一步包含裂解转导的细胞的群体以产生细胞裂解液。在一些实施方案中，方法进一步包含将细胞裂解液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。在一些实施方案中，纯化的aav载体样品的纯度为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%纯。[0272]在一些实施方案中，生产腺相关病毒（aav）载体的方法包含用任何本文公开的5'hdysfaav包装系统转导细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是稳定地表达腺相关病毒rep和cap基因的重组细胞。在一些实施方案中，方法进一步包含培养细胞以产生转导的细胞的群体。在一些实施方案中，方法进一步包含收集来自转导的细胞的群体的上清液。在一些实施方案中，方法进一步包括将上清液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。替代地或另外地，方法进一步包含裂解转导的细胞的群体以产生细胞裂解液。在一些实施方案中，方法进一步包含将细胞裂解液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。在一些实施方案中，纯化的aav载体样品的纯度为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%纯。[0273]在一些实施方案中，产生腺相关病毒（aav）载体的方法包括用任何本文公开的3'hdysfaav包装系统转导细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是稳定地表达腺相关病毒rep和cap基因的重组细胞。在一些实施方案中，方法进一步包含培养细胞以产生转导的细胞的群体。在一些实施方案中，方法进一步包含收集来自转导的细胞的群体的上清液。在一些实施方案中，方法进一步包含将上清液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。替代地或另外地，方法进一步包括裂解转导的细胞的群体以产生细胞裂解液。在一些实施方案中，方法进一步包括将细胞裂解液进行一个或多个纯化步骤以产生纯化的aav载体样品，其中aav载体样品基本上不含细胞碎片和蛋白质。在一些实施方案中，纯化的aav载体样品的纯度为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%纯。[0274]细胞本文进一步公开了包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。真核细胞的非限制性示例包括哺乳动物，例如仓鼠、小鼠、大鼠、犬、卵巢或人类细胞。在一些实施方案中，用包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸的质粒转染细胞。在一些实施方案中，用任何本文公开的5'hdysfaav表达盒转导细胞。在一些实施方案中，用任何本文公开的5'hdysfaav载体感染细胞。[0275]本文进一步公开了包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，用包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸的质粒转染细胞。在一些实施方案中，用任何本文公开的3'hdysfaav表达盒转导细胞。在一些实施方案中，用任何本文公开的3'hdysfaav载体感染细胞。[0276]本文公开的任何细胞可以是产生传染性raav的包装细胞。在一些实施方案中，包装细胞是稳定转化的癌细胞，例如hela细胞、293细胞和perc.6细胞（同源的293系）。在另一个实施方案中，包装细胞是未转化的癌细胞的细胞，例如低传代293细胞（用腺病毒e1转化的人类胎儿肾细胞）、mrc-5细胞（人类胎儿成纤维细胞）、wi-38细胞（人类胎儿成纤维细胞）、vero细胞（猴肾细胞）和frhl-2细胞（恒河猴肺部细胞）。原核细胞的非限制性示例包括细菌细胞（例如，大肠杆菌）和古细菌细胞。本公开的细胞可以被用于产生细胞库，例如，用于非gmp目的登记细胞库（accessioncellbanks，acb）或gmp主细胞库（gmpmastercellbank，mcb）。在一个实施方案中，在生物反应器中培养用于生产之前，等份（aliquote）细胞从原始接种物扩增到更大体积。[0277]治疗的方法本文进一步公开了治疗dysferlin肌病的方法。在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含：向有此需要的对象施用（a）有效量的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸包含任何本文公开的5'hdysf多核苷酸，以及（b）有效量的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含任何本文公开的3'hdysf多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，第一多核苷酸通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第一多核苷酸通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第二多核苷酸通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第二多核苷酸通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸同时施用。在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸按顺序施用。在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。[0278]在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含：向有此需要的对象施用（a）有效量的第一腺相关病毒（aav）载体，其中第一aav载体包含任何本文公开的5'hdysfaav载体，以及（b）有效量的第二腺相关病毒（aav）载体，其中第二aav载体包含任何本文公开的3'hdysfaav载体，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，第一aav载体通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第一aav载体通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第二aav载体通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第二aav载体通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第一和第二aav载体同时施用。在一些实施方案中，第一和第二aav载体按顺序施用。在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。[0279]在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含：向有此需要的对象施用（a）有效量的第一aav表达盒，其中第一aav表达盒包含任何本文公开的5'hdysfaav表达盒；以及（b）有效量的第二aav表达盒，其中第二aav表达盒包含任何本文公开的3'hdsyfaav表达盒，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，第一aav表达盒通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第一aav表达盒通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第二aav表达盒通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，第二aav表达盒通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，第一和第二aav表达盒同时施用。在一些实施方案中，第一和第二aav表达盒按顺序施用。在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。[0280]在一些实施方案中，治疗dysferlin肌病的方法包含向有此需要的对象施用有效量的组合物，由其组成或基本上由其组成，所述组合物包含：（a）任何本文公开的5'hdysf多核苷酸和任何本文公开的3'hdysf多核苷酸；（b）任何本文公开的5'hdysfaav载体和任何本文公开的3'hdysfaav载体；（c）任何本文公开的5'hdysfaav表达盒和任何本文公开的3'hdysfaav表达盒；以及（d）任何本文公开的双aav载体系统。在一些实施方案中，组合物通过口服、肠胃外（例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如，凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，组合物通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，dysferlin肌病是肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。[0281]本文进一步公开了任何重组多核苷酸、质粒、病毒载体、载体系统和组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用。本文公开了包含：（a）任何本文公开的5'hdysf多核苷酸和任何本文公开的3'hdysf多核苷酸；（b）任何本文公开的5'hdysfaav载体和任何本文公开的3'hdysfaav载体；（c）任何本文公开的5'hdysfaav表达盒和任何本文公开的3'hdysfaav表达盒；以及（d）（e）任何本文公开的双aav载体系统的组合物在制备用于治疗有此需要的对象中的dysferlin肌病的药物中的应用。在一些实施方案中，组合物通过口服、肠胃外（例如肌肉内、腹膜内、静脉内、icv、脑内注射或输液、皮下注射或植入）、经鼻的吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道（例如，尿道栓剂）或外用施用途径（例如凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等）施用。在一些实施方案中，组合物通过肌肉内或静脉内施用。在一些实施方案中，dysferlin肌病是指肢带型肌营养不良症2b型（lgmd2b）或三好氏肌肉病变。[0282]在本发明的方法中施用的aav载体的滴度将取决于例如，特定的aav、施用方式、治疗目标、个体和被靶向的细胞类型而不同并可以通过本领域的标准方法来确定。aav的滴度范围从至少约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约1x1013至约1x1014或更多dnase抗性颗粒（drp）每毫升（drp/ml）。剂量也可以用病毒基因组的单位（vg）表示。例如，aav的剂量可以从至少约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约2x1012、约3x1012、约4x1012、约5x1012、约6x1012、约7x1012、约8x1012、约9x1012、约1x1013至约1x1014病毒基因组。[0283]aav剂量可以通过多种方法确定，其中包括但不限于elisa、评估逆转录酶的活性、facs、northern印迹转导检测（例如半定量northern）、点印迹分析或pcr（例如qpcr）。众所周知，aav剂量可以通过定量实时pcr（qpcr）测量aav载体基因组来确定。这种qpcr方法克服了传统转导检测的不一致性或任意性结果。在pcr剂量测定的一个实施方案中，质粒dna被用来作为校准标准品。质粒的形式会影响qpcr方法的剂量结果。在一个实施方案中，环形或超螺旋的dna或质粒被用作定量标准品。[0284]在一些实施方案中，剂量可以以vg/kg为单位表示，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品。例如，aav的剂量为约1x106-1x1016vg/kg、约1x108-1x1015vg/kg或约1x1010-1x1014vg/kg，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品。在另一个实施方案中，剂量为至少约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约2x1012、约4x1012、约6x1012、约8x1012、约1x1013、约2x1013、约2.4x1013、约3x1013、约4x1013、约5x1013、约6x1013、约7x1013、约8x1013、约9x1013、约1x1014、约1x1015或至少约1x1016vg/kg。在一个实施方案中，剂量为至少2x1012、4x1012、6x1012、8x1012、1x1013、2x1013、2.4x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013或8x1013vg/kg，基于超螺旋dna或质粒作为定量标准品。[0285]在一些实施方案中，本文公开的方法包含每次注射施用1.5毫升的总体积中至少约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约2x1012、约3x1012、约4x1012、约5x1012、约6x1012、约7x1012、约8x1012、约9x1012、约1x1013vg。在一些实施方案中，本文公开的方法包含施用至少约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约2x1012、约3x1012、约4x1012、约5x1012、约6x1012、约7x1012、约8x1012、约9x1012、约1x1013、约2x1013、约5x1013、约7x1013、约1x1014vg的总每日剂量。确定包膜载体基因组滴度的一个示例性方法是使用定量pcr，例如描述于pozsgaietal.,mol.ther.25(4):855-869,2017中的方法，其内容通过引用整体并入本文。[0286]在一些实施方案中，一天向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次。在一些实施方案中，一周向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在一些实施方案中，一个月向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31次。在一些实施方案中，至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物。在一些实施方案中，至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物。在一些实施方案中，向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时间。在一些实施方案中，向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周的时间。在一些实施方案中，向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20个月的时间。[0287]在一些实施方案中，本文公开的方法包括全身性地施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物。例如，全身性地施用是进入循环系统使得整个身体受到影响的施用。全身性施用包括肠道施用（例如通过胃肠道吸收），以及通过注射、输液或植入的肠胃外施用。[0288]在一些实施方案中，本文公开的方法包含局部施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包含将任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物施用于一个或多个组织。在一些实施方案中，组织选自肌肉、上皮组织、结缔组织和神经组织。在一些实施方案中，该组织是肌肉组织。[0289]在一些实施方案中，本文公开的方法包含将任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物施用于对象的脚。在一些实施方案中，本文公开的方法包含将任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物施用于对象的趾短伸肌（edb）肌肉。[0290]联合疗法也在本发明的考虑范围内。本文所用的联合疗法包括同时治疗和按顺序治疗。特别地考虑本发明的方法与标准医学治疗（例如皮质类固醇）的组合，以及与新型疗法的组合。[0291]在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包含在向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物之前或之后，检测对象中dysferlin基因的突变的是否存在。在一些实施方案中，检测dysferlin基因的突变的存在时，将任何本文所公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物施用于对象。示例性的dysferlin突变包括但不限于c.1392dupa、c.3035g》a(p.w1012x)、c.2858dupt、c.2779delg、c.5594delg、c.4201dupa、c.1795_1799duptact、c.3832c》t(p.q1278x)、c.757c》t(p.r253w)、c.855 1delg、c.3126g》a(p.w1042x)、c.1663c》t(p.r555w)、c.610c》t(p.r204x)、c.3112c》t(p.r1038x)、c.1368c》g(p.c456w)、c.5713c》t(p.r1905x)、c.3826c》g(p.i1276v)、c.3843 1g》a、c.4167 1g》c、c.2643 1g》a、c.797t》c(p.i266p)、c4876delg、c.3477c》a(p.y1159x)、c.3137g》a(p.r1046h)、c.509c》a(p.a170e)、c.3967c》t(p.q1323x)、3191_3196dupgaggcg、c.3992g》t(p.r1331l)、c.3516_3517deltt、c.247delg、c.1180 11c》t、c896g》a(p.g299e)、c.5078g》a(p.r1693q)、c.5979dupa、c.3348 1_3348 4delgtat、c.5314_5318delagccc、以及c565c》g(p.l189v)。在某些情况下，dysferlin基因包含一个或多个突变，包括但不限于c.1392dupa、c.3035g》a(p.w1012x)、c.2858dupt、c.2779delg、c.5594delg、c.4201dupa、c.1795_1799duptact、c.3832c》t(p.q1278x)、c.757c》t(p.r253w)、c.855 1delg、c.3126g》a(p.w1042x)、c.1663c》t(p.r555w)、c.610c》t(p.r204x)、c.3112c》t(p.r1038x)、c.1368c》g(p.c456w)、c.5713c》t(p.r1905x)、c.3826c》g(p.i1276v)、c.3843 1g》a、c.4167 1g》c、c.2643 1g》a、c.797t》c(p.i266p)、c4876delg、c.3477c》a(p.y1159x)、c.3137g》a(p.r1046h)、c.509c》a(p.a170e)、c.3967c》t(p.q1323x)、3191_3196dupgaggcg、c.3992g》t(p.r1331l),c.3516_3517deltt,c.247delg、c.1180 11c》t、c896g》a(p.g299e)、c.5078g》a(p.r1693q)、c.5979dupa、c.3348 1_3348 4delgtat、c.5314_5318delagccc、以及c565c》g(p.l189v)。[0292]在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包含在向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物之前或之后，检测对象中dysferlin蛋白的水平。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包含在向对象施用任何本文公开的多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物后，检测对象中dysferlin蛋白的水平。在一些实施方案中，检测dysferlin的水平包括检测dysferlin基因的表达。检测dysferlin基因的表达可以包含定量dysferlindna或rna水平。替代地或另外地，检测dysferlin蛋白的水平包含定量检测dysferlin蛋白的水平。在一些实施方案中，在对象的样品中检测dysferlin蛋白的水平。在一些实施方案中，样品是体液样品。体液样品的示例包括但不限于血液、尿液、汗液、唾液、粪便和滑液。在一些实施方案中，血液样品是血浆或血清样品。在某些情况下，方法进一步包含dysferlindna测序测试，例如来自athenadiagnostics（cpt：81408（1））。[0293]在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包含修改施用于对象的任何多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物的剂量或给药频率。在一些实施方案中，修改剂量或给药频率是基于dysferlin蛋白水平的检测。在一些实施方案中，当对象中的dysferlin蛋白水平与来自较早时间点（例如，在施用多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物之前，或者在施用多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物的初始剂量后但在施用多核苷酸、质粒、病毒载体、双载体系统或组合物的后续剂量之前）的对象中的dysferlin蛋白水平相比增加时，减少剂量或给药频率。[0294]试剂盒在又一个方面，提供了一种试剂盒，其包含：多核苷酸、多肽、载体、细胞和系统或组合物中的任何一种或多种以及使用说明，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一个方面，多核苷酸、多肽、载体、细胞和系统或组合物中的任何一种或多种是可检测标记的标志物，或者进一步包含纯化的或可检测的标志物。在某些情况下，试剂盒包含a）第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸是本文所述的重组多核苷酸，以及第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是本文所述的重组多核苷酸；或者b）第一腺相关病毒（aav）载体，其中所述第一aav载体是本文所述的aav载体，以及第二腺相关病毒（aav）载体，其中所述第二aav载体是本文所述的aav载体；或者c）本文所述的aav双载体系统；或者d）本文所述的组合物；或者e）本文所述的细胞（例如，宿主细胞，任选地哺乳动物细胞）；以及任选地使用说明。实施例[0295]实施例1：双aav载体系统的产生本实施例提供了产生本文公开的双aav载体系统的示例性方法。在本实施例中，产生了双aav载体，raavrh.74.mhck7.dysf.dv。raavrh.74.mhck7.dysf.dv是非复制的重组aav，血清型rh74（aavrh74）在肌肉特异性mhck7启动子的控制下从双载体（dv）表达人dysferlin。双载体含有dysferlincdna序列的5'部分或3'部分，这些部分重叠了约1kb以促进重组来产生全长的人dysferlin基因。含有人dysferlincdna的一部分的表达盒的侧翼是aav2末端反向重复序列（itr）（图1）。[0296]为了构建raavrh.74.mhck7.dysf.dv，人dysferlincdna被分割成两个连接aav的包装容量（《4.7kb）的构建体。5'载体（例如5'hdysfaav载体），paav.mhck7.dysf5'.ptg（ptg=启动子/转基因）含有肌肉特异性mhck7启动子、嵌合内含子、共有kozak序列和对应于dysferlin氨基酸序列的氨基酸1-1113的dysfcdna的5'部分。3'载体（例如3'hdysfaav载体），paav.dysf3'.polya，含有对应于dysferlin氨基酸序列的氨基酸794-2080的dysfcdna的3'部分和携带多腺苷酸化信号的dysf3'utr。5'hdysfaav载体和3'hdysfaav载体的表达盒的序列分别公开为seqidno:6和8。[0297]先前的研究已经验证了使用mhck7启动子的心脏表达（salvaetal.molther15,320-329(2007)，其通过引用整体并入本文）和实现了骨骼肌、横膈肌和心肌的表达的aavrh74（sondergaardetal.annalsofclinicalandtranslneurology2,256-270(2015)，其通过引用整体并入本文）。5'hdysfaav载体和3'hdsyfaav载体被衣壳化为单独的aavrh.74病毒。aavrh.74血清型的分子克隆来自恒河猴的淋巴结并已在rodino-klapacetal.journaloftranslationalmedicine5,45(2007)中讨论，其通过引用整体并入本文。[0298]5'hdysfaav载体（aav载体质粒paav.mhck7.dysf5'.ptg）使用aav载体dna质粒paav.mhck7.dysf5'.ptg产生第一重组单链aav载体。通过将驱动人dysferlin部分cdna序列（人cdna，genbank登录号#nm_003494.3）的5'部分的mhck7表达盒插入到载体骨架paav-cmv（clontech）中构建质粒（质粒图见图2，具体序列信息见表1）。存在嵌合内含子且由人β-球蛋白基因的第一内含子的5'供体位点和内含子的分支点和3'剪接受体位点组成，该内含子位于免疫球蛋白基因重链可变区的前导区（leader）和主体之间。该载体中包括的唯一病毒序列是aav2的末端反向重复序列，其是病毒dna复制和包装raav载体基因组所需要的。两个itr之间的序列是被衣壳化进aavrh74病毒粒子中的dna部分。[0299]3'hdysfaav载体（aav载体质粒paav.dysf3'.poly）使用aav载体dna质粒paav.dysf3'.polya产生第二重组单链aav载体。通过将人dysferlin部分cdna序列（人cdna，genbank登录号#nm_003494.3）插入到载体骨架paav-cmv（clontech）中构建质粒（质粒图见图3，具体序列信息见表2）。内源性的dysferlin3'非翻译区和polya信号序列被用于有效的转录终止。该载体中包括的唯一病毒序列是aav2的末端反向重复序列，其是病毒dna复制和包装raav载体基因组所需要的。两个itr之间的序列被衣壳化进aavrh74病毒粒子中的dna部分。[0300]aav辅助质粒（pnlrep2-caprh74）由p5e18和pclr3k构建亲本质粒pnlrep。（参见bansal,d.,etal.defectivemembranerepairindysferlin-deficientmusculardystrophy.nature423,168-172(2003)，其通过引用整体并入本文）。p5e18基于paav/ad。其含有aav2rep和cap基因，p5启动子从rep的5'端去除并放置在cap的3'端，导致p5和rep之间存在3kb的间隔序列（具体序列信息见表3）。为了产生pclr3k，人类胶原蛋白内含子通过pcr扩增，然后在1,052位克隆进pad/av。为了构建pnlrep，p5e18的bamhi/xbai片段被替换为含有pclr3k的3kb胶原蛋白内含子的bamhi/xbai片段。pcr扩增rh74cap基因，并使用swai/noti限制性位点将其克隆进pnlrep中aav2cap基因的位置而得到pnlrep2-caprh74。aavrh74衣壳基因的鉴定通过dna质粒测序确定。[0301]腺病毒辅助质粒（phelp）从appliedviromics（fremont,ca94538）获得质粒phelp，其大小为11,635bp（具体序列信息见表4）。质粒含有对aav复制很重要的腺病毒基因组的区域，即e2a、e4和varna（腺病毒e1功能由293细胞提供）。质粒基于pbluescript骨架并且还含有编码赋予对氨苄西林（10182-11042bp）、细菌cole1复制原点（9315-10167bp）和f1单链dna复制原点（11172-11627bp）抗性的tem-1ß‑内酰胺酶基因的bla基因。质粒中的腺病毒序列仅占腺病毒基因组的~28%（9,280/35,938），且不含有对复制重要的顺式元件，例如末端反向重复序列。通过进行dna质粒测序确认这3个腺病毒基因的鉴定。dna分析显示与3个5型腺病毒基因区（genbank登录号af369965，其通过引用整体并入本文）有100%的同源性。[0302]实施例2：使用双aav载体系统制备病毒产品使用优化的磷酸钙共沉淀方法用3种生产质粒（（i）aav载体质粒，例如5'hdysfaav载体或3'hdysfaav载体；（ii）腺病毒（ad）辅助质粒；以及（iii）aav辅助质粒）转染hek293细胞。转染细胞包含制备含有aav载体质粒、ad辅助质粒、aav辅助质粒和cacl2的dna/钙溶液，并与等体积的2xhepes缓冲盐水混合以获得最佳沉淀物。然后将沉淀物加入到hek293细胞中并进行孵育。孵育后在加入核酸酶的时候交换培养基。[0303]实施例3：raavrh.74.mhck7.dysf.dv肌肉内递送的功效的确定产生两个aav表达盒，其包含mhck7.dysf盒的5'和3'部分，重叠序列~1kb（参见图1）。质粒被包装进aavrh.74载体。4周大的dysf-/-小鼠用每种载体1x1011vg处理，通过肌肉内注射入胫骨前肌，并在1个月时进行尸检。通过免疫染色（图4a）和蛋白质印迹（图4c）可以看到两种载体的递送后完整全长dysferlin表达。单独的任何一个载体的递送都没有异常的dysferlin表达（图4b，免疫染色，图4d，蛋白质印迹）。3222是全长对照。对表达dysferlin的肌肉纤维的数量进行定量，如表5所示。[0304]开始评估胫骨前肌肌肉内注射后安全性的时间过程研究（表6）。也评估了蛋白质表达和载体生物分布。在1、3、6、9和12个月的终点，对动物进行了全面的尸检，并评估了dysferlin表达（图5a-5c（示出了1、3和6个月）、载体生物分布（表7）和肌肉和非目标器官的组织病理学。胫骨肌肉（ta）被注射。对每个动物用于病理学分析的组织包括：性腺、肝脏、心脏、肺、脾脏、肾脏、横膈肌、左（经处理的）和右胫骨前肌肉。没有发现任何问题。[0305]肌肉内注射后，在注射的胫骨前肌中发现dysferlin的表达（图6）。静脉内递送后，骨骼肌和心肌中发现dysferlin的表达（图7a）。[0306]对另外几组小鼠进行处理以确定膜修复的最小有效剂量。在8周大的129dysf-/-小鼠的fdb中注射三种剂量的aav载体（每组6只）。对照dysf-/-组接受生理盐水，一组129wt小鼠作为品系特定的正常对照。如图8所示，aavrh.74.dysf.dv处理显示了剂量依赖性的膜再密封。平行表达研究表明，高剂量的结果是表达》50%的纤维转导。当对肌肉重量进行标准化处理时，该剂量相当于给胫骨前肌进行表达和安全研究的剂量（图4a-5c）。[0307]raavrh.74.mhck7.dysf.dv的全身性递送进行了一项剂量研究以测试双载体递送的全身性递送的可行性/有效性。基于该品系已确定的功能性mri/mrs结果，blaj小鼠（ajdysferlin缺陷小鼠与bl6小鼠回交）被用于研究。3组小鼠（n=每组6只）在6周龄时通过尾静脉注射生理盐水、2e12vg总aav.dysfdv（8e13vg/kg，基于超螺旋dna或质粒为定量标准品）或6e12vg总aav.dysf.dv（2.4e13vg/kg，基于超螺旋dna或质粒为定量标准品）进行处理。在3个月时进行终点分析，包括横膈肌生理学、fdb中的膜修复测定，以及全面的尸检以量化dysferlin表达和评估组织病理学4。[0308]在4个月的研究终点进行了全面的尸检。对横膈肌进行力量测量，对fdb肌肉进行膜修复的恢复测试，并收获肌肉和器官用于表达、载体生物分布和组织病理学。在高剂量下，dysferlin在所有肌肉中广泛表达（图7a和7b），而低剂量有低水平的可变的表达。在20周时，blaj在组织学上有非常轻微的表型。与对照组相比，作为再生标志物的中心核有显著增加。在高剂量时经处理的小鼠显示出中心核的显著减少（图7b）。受影响最严重的肌肉，腰肌在高剂量（6e12vg）处理后表现出纤维化和炎症的减少（图9）。横膈肌的力量缺陷在高和低剂量下都得到了恢复（图10a），并且在fdb肌肉的膜修复中存在剂量依赖性反应（图10b）。[0309]实施例4：通过nhp中aav5和aavrh.74.mhck7.dysf.dv递送全长dysferlin表达的安全性和功效方法：我们用aav.mhck7.dysf.flag通过肌肉内注射处理4个nhp。2个nhp用aav5.mhck7.dysf处理，2个用aavrh.74.mhck7.dysf.flag处理。与我们的临床试验设计相呼应，一只动物在3个月时被分析，两只在6个月时被分析。动物接受了基线化学和免疫学研究，包括elispot分析，以测量针对aav5和rh.74衣壳和dysferlin（图11a-11d）和抗aavab滴度（表9）的t细胞。[0310]用于刺激pbmc的肽池（pool）被设计成15个氨基酸长，重叠10个氨基酸以捕获所有可能的抗原表位。与肽发生反应的细胞释放干扰素-γ，通过elispot检测定量为斑点。以50个斑点/1x106个细胞为阳性反应阈值计算每百万个细胞中的斑点。没有观察到持续的免疫反应。所有动物在研究终点都有表达（图16a）。在整个研究过程中，每两周重复这些研究。在研究终点时对动物进行了全面的尸检，除了基因表达研究外，还包括重要器官组织的组织病理学和生物分布研究。[0311]结果：没有发现可观察到的毒性。申请人使用不区分恒河猴和人类dysferlin的抗dysferlin抗体来证明dysferlin的过表达（图12a-12c）。还做了抗flag免疫染色以确认载体衍生的dysferlin表达（图13）。与未注射的对照相比，对于aav5.dysf注射的ta，肌肉显示了dysferlin的104.9%（3个月）和122.6%（6个月）过表达，而aavrh.74.dysf.dv注射的ta有122.0%（3个月）和115.2%（6个月）过表达。在nhp的组织水平上没有观察到毒性，缺乏炎症或肌肉纤维坏死。通过elispot免疫学检测没有显示出对衣壳或转基因的任何异常反应（图11a-11d）。此外，任何猕猴的全血计数和化学检测均未显示异常值。正如预期的那样，基因转移后抗aav抗体滴度升高。终点抗aavrh.74的滴度比抗aav5的滴度低。[0312]等效物除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。[0313]可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应该认识到，在本发明技术所要求保护的范围内各种变化都是可能的。[0314]因此，应该理解的是，本文中提供的材料、方法和实施例是优选的方面的代表，其是示例性的，而且不旨在作为对本技术的范围的限制。[0315]本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。[0316]此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。[0317]在本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如有冲突，以本说明书（包括定义）为准。[0318]在以下权利要求中阐述其其他。当前第1页12当前第1页12