纳米抗体S43的构建体及其应用

纳米抗体s43的构建体及其应用
1.本技术是申请日为2022年3月21日，申请号为202210278937.x，发明名称为“纳米抗体s43的构建体及其应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医药领域，具体涉及纳米抗体s43的构建体及其应用，更具体地，涉及基于特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体s43的多价纳米抗体、纳米抗体融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、包含上述多核苷酸、核酸构建体或表达载体的转化的细胞以及包含上述任一项产品的药物组合物及其在制备用于预防或治疗新型冠状病毒的药物中的应用、在制备用于检测新型冠状病毒或诊断新型冠状病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

3.新型冠状病毒(sars-cov-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)等同属冠状病毒科(family coronaviridae)，是针对人类呼吸系统的主要病原体，主要通过飞沫、气溶胶和接触等方式传播，其传染性强，因此这类引起呼吸系统疾病的病毒严重危害公共卫生安全，尤其近年来呼吸性传染病频发、病毒不断变异。
4.当前的新冠肺炎疫情暴发推动了各种疫苗和抗病毒药物的开发，其中接种疫苗可有效预防严重传染疾病的发生，但是疫苗的适用对象为未感染人群，且研发周期长，临床研究过程复杂。而对于确诊患者而言，只能通过抗病毒药物进行治疗，其中一种抗病毒药物是治疗性抗体药物，主要指中和抗体；中和抗体药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。sars-cov-2病毒表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,s)，该s蛋白能与宿主细胞受体蛋白ace2相互作用并触发膜融合，因此阻断s蛋白与ace2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。
5.常规单克隆抗体，一般通过静脉注射给药，然而，通过静脉注射途径给药的单克隆抗体从全身循环进入肺部的药物浓度非常低，大大降低了中和抗体本身的抗病毒效果，导致不能有效降低肺部的病毒载量。新型冠状病毒最初感染上呼吸道，它与免疫系统的第一次相互作用主要发生在呼吸道黏膜表面，鉴于此，对于通过呼吸道感染的新冠病毒而言，在关注血清抗体的同时，还有必要从黏膜免疫的角度去思考、设计和开发合适的抗体类药物。例如，雾化给药可使抗体药物在呼吸道内达到更高的局部浓度，能在病毒入侵时更有效地阻断病毒感染。
6.纳米抗体作为治疗性药物已备受关注，例如，由ablynx公司研发的纳米抗体药物 caplacizumab(cablivi
tm
)用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜，是首个获批上市的纳米抗体药物；再如，纳米抗体候选药物alx-0171是一种用于治疗小儿呼吸道合胞病毒(rsv)感染的三价形式的纳米抗体，采用雾化给药，已进入临床ⅱ期阶段 (https://clinicaltrials.gov)，这些都提示：纳米抗体药物具有安全性、可行性。
7.因此，开发针对新型冠状病毒的、适于呼吸道黏膜免疫的纳米抗体药物具有潜在的临床应用价值与前景。


技术实现要素：

8.发明目的
9.本发明的目的在于提供基于特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体s43的构建体 (包括多价纳米抗体和纳米抗体融合蛋白)、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、包含上述多核苷酸、核酸构建体或表达载体的转化的细胞以及包含上述任一项产品的药物组合物及其在制备用于预防或治疗新型冠状病毒的药物中的应用、在制备用于检测新型冠状病毒或诊断新型冠状病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。
10.本发明的基于特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体s43的构建体(包括多价纳米抗体和纳米抗体融合蛋白)，能有效抑制sars-cov-2感染及其变异毒株感染，可以雾化给药，能直达肺部，起效较快且半衰期长，为新冠病毒及其变异株感染提供了更有效的治疗策略。
11.解决方案
12.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
13.第一方面，本发明提供了一种多价纳米抗体，其包括两条以上、特异性结合 sars-cov-2rbd的纳米抗体，其中，所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体包括以下cdr：
14.氨基酸序列如seq id no:1(即，gftldyyaig)所示的cdr1，
15.氨基酸序列如seq id no:2(即，cissnnstyyadsvkg)所示的cdr2，以及
16.氨基酸序列如seq id no:3(即，epdysgvyyytcgwtdfgs)所示的cdr3。
17.在具体实施方案中，所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列；
18.优选地，所述fr1-4的氨基酸序列分别如seq id no:4(即， qvqlqesggglvqpggslrltcaps)、seq id no:5(即，wfrqapgkeregvs)、 seq id no:6(即，rftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa)和seq id no:7 (即，wgqgtqvtvss)所示。
19.在优选的具体实施方案中，所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体具有如 seq id no:8所示的氨基酸序列，或与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少95％， 96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如以下seq id no:8所示：
[0020][0021]
为重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
[0022]
在优选的具体实施方案i中，所述多价纳米抗体由两条以上、优选地三条所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体通过linker连接构成；
[0023]
其中，所述linker为(ggggs)n，其中，n＝1,2,3,或4，优选地，n＝2或3。
[0024]
作为具体实施方案i的进一步优选，所述多价纳米抗体为三价纳米抗体，具有如
seq id no:9所示的氨基酸序列：
[0025]
qvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnn styyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgw tdfgswgqgtqvtvssggggsggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqp ggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnnstyyadsvkgrftisrd nakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgwtdfgswgqgtqvtvss ggggsggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldy yaigwfrqapgkeregvscissnnstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpe dtavyycaaepdysgvyyytcgwtdfgswgqgtqvtvss(seq id no:9)。
[0026]
在优选的具体实施方案ii中，所述多价纳米抗体为由以下融合蛋白形成的igm五聚体，所述融合蛋白从n端到c端的结构如式(i)所示：
[0027]
a-l-b
ꢀꢀꢀ(i)[0028]
其中，
[0029]
a为单条、所述特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体，或者为如上述优选的具体实施方案i中所述的多价纳米抗体；
[0030]
b为人源igm的fc片段；优选地，所述人源igm的fc片段具有如seq id no:10(即， viaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttd qvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvpdqd tairvfaippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpna tfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkgvalhrpdvyllppare qlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsi ltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy) 所示的氨基酸序列，或与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％， 98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
[0031]
l为(ggggs)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。
[0032]
作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如seq id no:11所示的氨基酸序列：
[0033]
qvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnn styyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgw tdfgswgqgtqvtvssviaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvs wlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrg ltfqqnassmcvpdqdtairvfaippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqn geavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpk gvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvts apmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptl ynvslvmsdtagtcy(seq id no:11)。
[0034]
第二方面，本发明提供了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从n端到 c端的结构如式(i)所示：
[0035]
a-l-b
ꢀꢀꢀ(i)[0036]
其中，
[0037]
a为单条、特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体，所述特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体如上述第一方面中所定义；或者，a为根据上述第一方面的优选的具体实施方案i中所述的多价纳米抗体，即，由两条以上、优选地三条所述特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体通过linker连接构成的多价纳米抗体，其中，所述linker 为(ggggs)n，其
中，n＝1,2,3,或4，优选地，n＝2或3；
[0038]
b为人源igm的fc片段；优选地，所述人源igm的fc片段具有如seq id no:10所示的氨基酸序列，或与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
[0039]
l为(ggggs)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。
[0040]
作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如seq id no:11所示的氨基酸序列。
[0041]
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的多价纳米抗体，或者编码如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白。
[0042]
在具体实施方案中，所述多核苷酸为dna或mrna；
[0043]
优选地，所述多核苷酸编码根据上述第一方面的优选的具体实施方案i的多价纳米抗体，进一步优选地，所述多核苷酸包括如seq id no:12(即， caggtccaactccaagagagcggcggcggcctcgtccaacccggaggatcactc agactcacatgcgccccaagcggcttcacactcgactactacgccatcggctggtt cagacaagcccccggcaaagagagagaaggagtgtcttgcattagcagcaacaa cagcacctactacgccgacagtgtcaaaggaagattcaccatcagcagggacaac gctaagaacaccgtgtatctccagatgaactcactgaagcccgaggacaccgccg tgtactactgcgccgccgagcccgactacagcggcgtttactactacacctgcgga tggaccgacttcggcagctggggccaaggaacccaagtcaccgtgagcagcgga ggcggaggaagcggcggtggaggaagtggcggaggcggatctggggggggagg atcaggcggaggaggaagccaggtgcagctgcaggagagcggaggaggactgg tgcagccaggaggaagcctgagactgacatgcgcaccaagcggattcacactgg actattatgctatcggatggttcagacaggcccctggaaaagagagagagggggt gagctgcatcagcagcaataactccacatactacgccgatagcgtcaaggggagg ttcactattagcagggacaatgcaaagaacacagtgtacctgcagatgaacagcc tgaagcccgaagacaccgccgtctactactgcgcagccgagcccgattacagcgg cgtgtactactacacatgcggatggacagacttcggctcctggggccaaggcacc caagtgaccgtgtcaagcggaggcggggggagcggaggaggtggaagtggagg ggggggatctggcgggggaggaagtggaggaggaggatcacaggtgcagctcca ggagagcgggggaggactggtccagccaggagggagcctgagactcacatgtgc acccagcggatttacactggattattacgccatcggatggtttaggcaggcacccg ggaaagagagagagggcgtgagctgcattagcagtaataacagcacctattacgc cgactcagtgaaggggcggttcaccataagcagggataacgccaagaacaccgtc tacctgcagatgaatagcctgaaacccgaagacacagccgtgtactattgcgccgc cgaacccgactactctggagtgtactactatacctgcggctggaccgactttggca gctgggggcaaggcacccaggtgaccgtgagcagt)所示的核苷酸序列；
[0044]
优选地，所述多核苷酸编码如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白，进一步优选地，所述多核苷酸包括如seq id no:13(即， caggtgcagctgcaggagagcggaggagggctggtgcagcccggaggaagcctg agactgacctgcgcccccagcggattcaccctggattattatgctattggctggttt aggcaggctcccggcaaagagagagagggggtgtcatgcattagcagcaataact caacctactacgccgacagcgtcaagggacgcttcaccatttccagggacaacgc taagaacaccgtgtatctccagatgaatagcctgaagcccgaggacaccgcagtg tactactgcgccgccgagcccgactacagcggtgtgtattactacacctgcggatg gaccgacttcggcagctggggccagggaacccaggtgacagtgagcagcgtgat cgccgagctgccccccaaggtgagcgtgttcgtgccccctagagacggcttcttc ggcaaccctagaaagagcaagctgatctgccaagccaccggcttctcccctagac agatccaagtgagctggctgagagagggcaagcaagtgggcagcggcgtcacaa cagaccaagtgcaagccgaggccaaggagagcggccccaccacctacaaggtga caagcaccctgaccatcaaggagagcgact
ggctggggcagagcatgttcacctg cagagtggaccacagaggcctgacctttcagcagaacgctagcagcatgtgcgtg cccgaccaagacaccgccatcagagtgttcgccatcccccctagcttcgctagcat cttcctgaccaagagcaccaagctgacctgcctcgtgaccgatctgaccacctac gacagcgtgaccatcagctggacaagacagaacggcgaggccgtgaagacccac accaacatcagcgagagccaccccaacgccaccttcagcgccgtgggcgaggcta gcatctgcgaggacgactggaacagcggcgagagattcacctgcaccgtgaccca caccgacctgcctagccccctgaagcagaccatcagcagacccaagggcgtggcc ctgcacagacccgacgtgtacctgctgccccccgctagagagcagctgaacctga gagagagcgccaccatcacctgcctggtgaccggctttagccccgctgacgtgtt cgtgcagtggatgcagagagggcagcccctgagccccgagaagtacgtgacaag cgcccccatgcccgagccccaagcccccggcagatacttcgcccacagcatcctg accgtgagcgaggaagagtggaacaccggcgagacctacacctgcgtggtggcc cacgaggccctgcccaacagagtgaccgagagaaccgtggacaagagcaccggc aagcccaccctgtacaacgtgagcctggtgatgagcgacaccgccggcacctgct ac)所示的核苷酸序列。
[0045]
第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。
[0046]
第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。
[0047]
第六方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。
[0048]
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0049]
在具体实施方案中，所述药物组合物可以为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
[0050]
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
[0051]
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
[0052]
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
[0053]
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
[0054]
第八方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的转化的细胞或如上述第七方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
[0055]
在具体实施方案中，所述新型冠状病毒可以为sars-cov-2原始毒株和/或 sars-cov-2变异毒株；
[0056]
优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、 kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron (b.1.1.529)亚型ba.2毒株；进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为delta(b.1.617.2) 毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron(b.1.1.529)亚型ba.2毒株。
[0057]
第九方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的转化的细胞在制备用于检测新型冠状病毒或用于诊断新型冠状病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。
[0058]
在具体实施方案中，所述新型冠状病毒可以为sars-cov-2原始毒株和/或 sars-cov-2变异毒株；
[0059]
优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、 kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron (b.1.1.529)亚型ba.2毒株；进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为delta(b.1.617.2) 毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron(b.1.1.529)亚型ba.2毒株。
[0060]
第十方面，本发明提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，其包括如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的转化的细胞。
[0061]
有益效果
[0062]
本发明针对新冠病毒进行纳米抗体构建体的药物开发，本发明的基于纳米抗体s43 的构建体均能以高亲和力与sars-cov-2 rbd结合，能以高中和活性中和sars-cov-2 原型毒株和一系列变异毒株的假病毒和活病毒，这些均表明：基于纳米抗体s43的构建体是能够以高亲和力与sars-cov-2 rbd结合的、并具有高中和活性的新型冠状病毒 (sars-cov-2)纳米抗体。
[0063]
特别是，发明人通过一系列实验证明，本发明的基于纳米抗体s43的三价纳米抗体 (ts43)和igm五聚体形式(ms43)相对于其单体(即，纳米抗体s43)具有明显提高的中和活性和显著延长的半衰期，其实现了黏膜免疫，可以限制病毒的繁殖和进一步跨越黏膜屏障，控制了病毒的黏膜传播，为新型冠状病毒的临床预防、治疗提供了潜在的可雾化给药的抗体新药，并可实现新型冠状病毒的灵敏、可靠检测。
附图说明
[0064]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0065]
图1是本发明实施例1中所构建的纳米抗体构建体ts43和ms43的结构示意图；
[0066]
图2是本发明实施例1中所记载的s43蛋白分子筛层析和sds-page鉴定结果图；
[0067]
图3是本发明实施例1中所记载的ts43蛋白分子筛层析和sds-page鉴定结果图；
[0068]
图4是本发明实施例1中所记载的ms43蛋白分子筛层析和sds-page鉴定结果图；
[0069]
图5是本发明实施例2中所记载的sars-cov-2 rbd-his蛋白(a)、变异毒株omicron (b.1.1.529)亚型ba.1的rbd-his蛋白(b)和omicron(b.1.1.529)亚型ba.2的rbd-his蛋白(c)的sds-page鉴定结果图。
[0070]
图6是本发明实施例5中所测定的三种抗体中和sars-cov-2原型毒株假病毒感染的效果示意图。
[0071]
图7是本发明实施例5中所测定的三种抗体中和sars-cov-2变异毒株delta (b.1.617.2)假病毒感染的效果示意图。
[0072]
图8是本发明实施例5中所测定的三种抗体中和sars-cov-2变异毒株omicron (b.1.1.529)亚型ba.1假病毒感染的效果示意图。
[0073]
图9是本发明实施例5中所测定的三种抗体中和sars-cov-2变异毒株omicron (b.1.1.529)亚型ba.2假病毒感染的效果示意图。
[0074]
图10是本发明实施例7中所测定的三种抗体在雾化前、后对假病毒的中和活性；其中，a为纳米抗体s43在雾化前、后对sars-cov-2原型毒株假病毒的中和活性结果， b为纳米抗体构建体ts43对sars-cov-2原型毒株假病毒的中和活性结果，c为纳米抗体构建体ms43对sars-cov-2变异毒株delta(b.1.617.2)假病毒的中和活性结果。
具体实施方式
[0075]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0076]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0077]
以下，对本发明进行详述。
[0078]
定义
[0079]“纳米抗体”，即“重链单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(vhh，variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。
[0080]
由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。
[0081]
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与sars-cov-2 rbd蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
[0082]
本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市
售产品，例如，trizol购自invitrogen，superscript ii first-strand synthesis system forrt-pcr试剂盒购自invitrogen。
[0083]
一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pcaggs载体购自miaolingplasmid；293f细胞、hek293t细胞等购自 atcc；series sensor chip sa芯片购自ge healthcare；vero细胞购自atcc ccl81。
[0084]
一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成，例如，本发明中的ts43的编码序列由北京擎科生物科技有限公司合成。
[0085]
实施例1：基于纳米抗体s43的三价形式(ts43)和igm五聚体形式(ms43)抗体的构建、表达与纯化
[0086]
本实施例中的单价纳米抗体及其三价形式和igm五聚体形式的结构示意图如图1所示。
[0087]
所采用的基础纳米抗体s43为本实验室通过用sars-cov-2s蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术进行筛选而得；单价纳米抗体s43的氨基酸序列如seq idno:8所示，其能以高亲和力、特异性地结合sars-cov-2rbd(结合常数为1.2e-10
±ꢀ
1.4e-11m)，并且在假病毒中和实验中，能以高中和活性中和sars-cov-2假病毒，这些均表明：s43纳米抗体是能够以高亲和力与sars-cov-2rbd结合的、并具有高中和活性的新型冠状病毒(sars-cov-2)羊驼源纳米抗体。
[0088]
在上述单价纳米抗体s43的编码序列(如seq id no:14所示)的5’端连接信号肽 (atmhssallcclvlltgvra，seq id no:15)、3’端连上6个组氨酸标签(hexa-his-tag) 的编码序列及翻译终止密码子tga，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入 pcaggs载体(购自invitrogen)中，然后将所得重组载体转染至293f细胞(购自invitrogen) 中，进行s43-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(histrap tm excel((ge healthcare))和凝胶过滤层析(superdex
tm 75 increase 10/300 gl column(gehealthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。s43-his蛋白的sds-page鉴定大小为 15kd左右，结果如图2所示。
[0089]
通过两段(ggggs)3序列，将三个如seq id no:14所示的纳米抗体s43的编码序列通过头尾相连形式串联(由北京擎科生物科技有限公司直接合成)，在其5’端连接信号肽(atmhssallcclvlltgvra，seq id no:15)、3’端连上6个组氨酸标签 (hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子tga，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体(购自invitrogen)中，然后将所得重组载体转染至293f细胞(购自invitrogen)中，进行ts43-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(histrap tm excel((ge healthcare))和凝胶过滤层析(superdex
tm 200 increase 10/300glcolumn(ge healthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。ts43-his蛋白的sds-page 鉴定大小为50kd左右，结果如图3所示。
[0090]
通过同源重组的方式，将纳米抗体s43的编码序列(如seq id no:14所示)与人源 igm抗体的fc的编码序列(如seq id no:16所示)连接，在其5’端连接信号肽 (atmhssallcclvlltgvra，seq id no:15)、3’端连上翻译终止密码子tga，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体(购自invitrogen)，获得 pcaggs-s43-igm fc重组表达载体。将j链(joining chain)的编码序列(如seq id no:17 所示)的3’端连上翻
译终止密码子tga，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体(购自invitrogen)，获得pcaggs-j chain重组表达载体。将上述两种重组表达载体pcaggs-s43-igm fc与pcaggs-j chain共转染至293f细胞(购自invitrogen) 中，进行s43-igm fc融合蛋白和j链的表达，二者再进行自组装，形成igm形式的ms43 蛋白。所得ms43蛋白通过hitrap
tm igm purification hp(ge healthcare)和superose
tm 6increase 10/300 gl(ge healthcare)纯化，再经sds-page进行鉴定。ms43蛋白的 sds-page鉴定大小为70kd左右，结果如图4所示。
[0091]
实施例2：sars-cov-2及其变异毒株rbd的表达与纯化
[0092]
在sars-cov-2原始毒株的rbd蛋白(其氨基酸序列如seq id no:18所示)的编码序列的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子tga，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体(购自invitrogen)中，然后将所得重组载体转染至293f细胞(购自invitrogen)中，进行sars-cov-2rbd-his蛋白的表达。
[0093]
分别在sars-cov-2变异毒株omicron(b.1.1.529)亚型ba.1的rbd蛋白(其氨基酸序列如seq id no:19所示)的编码序列和omicron(b.1.1.529)亚型ba.2的rbd蛋白(其氨基酸序列如seq id no:20所示)的编码序列的3’端分别连上6个组氨酸标签 (hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子tga，通过bac-to-bac杆状病毒表达系统 (invitrogen)进行表达。将含有目的基因的pfastbac1质粒转化至dh10bac感受态细胞中, 生成重组杆粒(bacmids)。将重组杆粒bacmids转染至sf9细胞中进行病毒的扩增,并在hi5 细胞中进行蛋白表达。表达48h后,收集hi5细胞上清液,使用histrap tm excel(gehealthcare)通过镍亲和层析纯化可溶性蛋白。
[0094]
含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析柱histrap tm excel(ge healthcare)和凝胶过滤层析superdex
tm 200increase 10/300gl column(ge healthcare)纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。sars-cov-2rbd-his蛋白、变异毒株omicron(b.1.1.529)亚型ba.1 的rbd-his蛋白和omicron(b.1.1.529)亚型ba.2的rbd-his蛋白的sds-page鉴定大小为 30kd左右，分别如图5a～c所示。
[0095]
实施例3：表面等离子共振技术检测各抗体与sars-cov-2原始毒株及其变异株的 rbd蛋白的结合能力
[0096]
表面等离子共振分析利用biacore 8k(biacore inc.)进行。具体步骤如下：
[0097]
分别将上述实施例所制备的单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43进行生物素化，然后固定到series sensor chip sa芯片(cytiva life sciences)上；用pbst缓冲液(2.7 mm kcl，137mm nacl，4.3mm na2hpo4，1.4mm kh2po4，0.05％吐温)分别将上述实施例所制备的sars-cov-2原始毒株及其变异株的rbd蛋白进行倍比稀释，从低浓度到高浓度逐一上样至芯片。结合动力学常数的计算是利用biaevaluation software 8k (biacore，inc.)软件进行的。各抗体与各rbd之间的平衡解离常数(kd)如表1所示，表 1结果表明：单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43都能够和sars-cov-2原型毒株及变异毒株omicron亚型ba.1、omicron亚型ba.2的rbd蛋白以较高的亲和力结合。
[0098]
表1、单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43与sars-cov-2原始毒株及变异毒株的rbd之间的亲和性结果
[0099][0100]
实施例4：sars-cov-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装
[0101]
1)分别将编码sars-cov-2原始毒株(wt)及变异毒株delta(b.1.617.2)、omicron (b.1.1.529)亚型ba.1和omicron(b.1.1.529)亚型ba.2的s蛋白后18位氨基酸的基因去掉， s蛋白其余序列进行合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到sars-cov-2-wt-s-del18、 b.1.617.2-s-del18、b.1.1.529-ba.1-s-del18和b.1.1.529-ba.2-s-del18基因的核苷酸序列，序列分别如seq id no:21～24所示。
[0102]
2)分别将1)中获得的该蛋白基因克隆到pcaggs载体上，得到表达质粒 pcaggs-sars-cov-2-wt-s-del18、pcaggs-b.1.617.2-s-del18、pcaggs
‑ꢀ
b.1.1.529-ba.1-s-del18和pcaggs-b.1.1.529-ba.2-s-del18。
[0103]
sars-cov-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装步骤如下：
[0104]
a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺hek293t细胞(购自atcc crl-3216)，使第二天细胞汇合密度至80％左右。培养液为含10％fbs的dmem培养基。
[0105]
b.转染：取上述步骤2)中的各s蛋白的表达质粒，用pei转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与pei按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％fbs的dmem培养基)，37℃培养24h。
[0106]
c.加毒：将假病毒包装骨架病毒g*vsv-delg(购自武汉枢密脑科学技术有限公司) 加入上述转染后的hek293t细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％fbs的dmem培养基)，并加入vsv-g抗体(表达该抗体的杂交瘤细胞购自atcc细胞库)，在培养箱中继续培养 30h。
[0107]
d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。
[0108]
分别得到sars-cov-2原型毒株(sars-cov-2wt)及变异毒株delta(b.1.617.2)、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1、omicron(b.1.1.529)亚型ba.2的假病毒。
[0109]
实施例5：抗体中和假病毒感染的检测
[0110]
将经纯化的单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43(由实施例1制得)分别以 5倍倍比稀释至第9个梯度(2.56pg/ml)，将稀释液与1.6
×
104tcid
50
实施例4获得的一系列sars-cov-2原始毒株及变异毒株的假病毒分别混合，在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种vero细胞(购自atcc ccl81)的96孔板中。孵育18～20小时后，通过cq1 confocal quantitative image cytometer(yokogawa)检测。根据带gfp荧光的细胞数，计算抗体对上述一系列sars-cov-2原型毒株及变异毒株delta、ba.1和ba.2的假病毒的中和能力，其结果分别如图6～9所示，结果统计如表2；结果显示，相对于单价纳米抗体s43，其构建体ts43和ms43的假病毒中和效果均得以提高。
[0111]
表2、单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43对sars-cov-2原始毒株及变异毒株的假病毒的中和能力
[0112][0113]
注：ic
50
(μg/ml)为抗体的半抑制浓度。*表示最高浓度10mg/ml时测定仍未达到100％抑制率。
[0114]
实施例6：抗体中和活病毒感染的检测
[0115]
本实施例中，通过基于细胞病变效应(cpe)的活病毒中和试验，测定各抗体对新冠病毒活病毒的中和效果。具体步骤如下：
[0116]
将经纯化的单价纳米抗体s43及其ts43和ms43(由实施例1制得)分别以2倍倍比稀释至第11个梯度，每个梯度4个重复孔，每孔50μl，将稀释液与等体积的100 tcid
50
的sars-cov-2原始毒株或其变异毒株delta、omicron亚型ba.1于37℃孵育。1 小时后，将混合物加入到悬浮的vero细胞中，并在37℃下继续孵育3天。观察和记录细胞病变情况。使用graphpad prism 7.0计算纳米抗体及其构建体的ic
50
。实验均在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(bsl3)中进行。
[0117]
单价纳米抗体s43及其ts43和ms43对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒中和效果见表3，表3结果显示：ts43和ms43对新冠病毒原始毒株及变异毒株的活病毒均具有良好的抑制效果。
[0118]
表3、单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43对sars-cov-2原始毒株及变异毒株的活病毒的中和能力
[0119][0120]
注：ic
50
(μg/ml)为抗体的半抑制浓度。
[0121]
实施例7：抗体雾化前后稳定性的检测
[0122]
使用aerogen solo(aerogen inc.,chicago,usa)雾化器，分别将单价纳米抗体s43及其构建体ts43和ms43进行雾化，然后使用含有20ml pbs的全玻璃skc(eighty four, pa,usa)收集雾化后的抗体，并按实施例5所述进行假病毒中和试验。结果如图10所示，其中，a为纳米抗体s43在雾化前、后对sars-cov-2原型毒株假病毒的中和活性结果，b为纳米抗体构建体ts43对sars-cov-2原型毒株假病毒的中和活性结果，c为纳米抗体构建体ms43对sars-cov-2变异毒株delta(b.1.617.2)假病毒的中和活性结果；图10结果表明：本发明的纳米抗体构建体ts43和ms43在雾化前、后对新冠病毒原型毒株或其变异毒株的假病毒的中和活性保持稳定，提示它们均适于通过雾化途径给药。
[0123]
上述结果表明，本发明的基于纳米抗体s43的构建体ts43和ms43具有开发成为治疗新型冠状病毒及其变异毒株感染的高中和活性抗体药物、特别是雾化药物的潜力。
[0124]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；
而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。