CircPIAS1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途

circpias1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及circpias1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途。


背景技术：

2.随着医疗水平的提高和卫生状况的改善，全球癌症总体死亡率持续下降，但是肝癌的发病率和死亡率却逐年上升，肝癌已经成为全球癌症相关性死亡的第三大原因。最新数据显示，2018年全球肝癌发病达84万人，我国是肝癌患病率最高的国家，占据一半以上的肝癌新发及死亡病例，给国家和人民带来沉重的经济负担，并耗费大量医疗资源，因此，迫切需要开拓新的诊疗策略应对这种严重威胁人类生命的重大疾病。
3.由于早期诊断不足以及治疗手段有限，肝癌平均5年无瘤生存率仅为25％左右。当前的常规治疗方法中，少数接受手术的患者五年复发率高达60-75％；大部分患者接受肝动脉化疗栓塞治疗，但疗效一般且副作用大；fda批准的全身性靶向药物索拉菲尼(sorafenib)和仑伐替尼(lenvatinib)存在不同程度的耐药及获益相对有限等问题；而肝癌免疫治疗尚处于起步阶段。国内外大量的研究指出，肝癌难治性的瓶颈在于肝癌发生进展过程中的复杂性、多样性、多重基因变异性，这种特性有助于肿瘤细胞的生长和免疫逃避；因此，不断地深入探索新的肝癌相关基因通路及寻求更为有效的治疗靶点是改善肝癌临床结局的关键。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对上述问题，提供circpias1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途。
5.circrna是一类共价闭合环状的rna分子，现有研究表明，circrna比线性rna稳定，种类繁多且来源丰富，能够充当mirna海绵、编码蛋白质、参与基因的转录后调控，从而发挥特定的生物学功能(图1)。circrna与肝癌的关系也是目前研究的热点之一。近几年发现，在肝癌中不同的circrna发挥致癌或者抑癌的作用，调控肿瘤生长增殖、侵袭和转移。因此，深入研究circrna与肝癌的互作关系有望为肝癌提供新型的诊疗标志物。
6.目前研究显示大多数circrna充当mirna海绵，在mirna装配到rna诱导沉默复合物时，调节mirna的稳定性，从而使得mirna对应的靶基因表达增强或减弱，发挥其生物学功能。本发明的circpias1，最早通过高通量测序发现其可能在肝脏、乳腺、直肠等组织中表达，通过序列分析得知，circpias1为其亲本pias1基因第4-10外显子对应的mrna首尾拼接而成的环状rna，至今尚未见有关circpias1在肿瘤方面的研究报道。
7.申请人通过体内外实验研究，首次发现circpias1具有促进肝癌增殖和迁移能力的作用，靶向circpias1通路具有抗肝癌的作用，该结果为进一步设计和筛选针对circpias1的肿瘤靶向诊疗新策略开发提供科学依据。
8.本发明提供circpias1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途，所述circpias1由pias1基因第4-10号外显子对应的mrna首尾拼接得到。
9.在其中一个实施例中，所述circpias1的核苷酸序列如seq id no.1所示：
10.seq id no.1：
11.catcagacaacagtcagcgctttcgagaaacctgttttgcatttgccttgacaccacaacaagtgcagcaaatcagtagttccatggatatttctgggaccaaatgtgacttcacagtacaggtccagttaaggttttgtttatcagaaaccagttgtccacaagaagatcacttcccacccaatctttgtgtgaaagtgaatacaaaaccttgcagccttccaggttaccttccacctacaaaaaatggcgtggaaccaaagcgacccagccgaccaattaatatcacctcacttgtccgactgtccacaacagtaccaaacacgattgttgtttcttggactgcagaaattggaagaaactattccatggcagtatatcttgtaaaacagttgtcctcaacagttcttcttcagaggttacgagcaaagggaataaggaatccggatcattctagagctttaattaaagagaagttgactgcggatccagacagtgaaatagctacaaccagcctaagggtttctctactatgtccacttggtaaaatgcggctgacaattccgtgtcgggcccttacatgttctcatctacaatgttttgacgcaactctttacattcagatgaatgagaaaaaaccaacctgggtttgtcctgtctgtgataagaaggctccatatgaacaccttattattgatgg。
12.circpias1收录于circbase数据库(环状rna数据库)，编号为hsa_circ_0007088，其成熟序列如seq id no.1所示，长度700nt。
13.本发明还提供一种circpias1抑制剂在制备用于肝癌治疗的药物中的用途。
14.本发明还提供一种circpias1抑制剂联合索拉非尼在制备用于肝癌治疗的药物中的用途。
15.发明人通过实验发现，circpias1过表达的肝癌细胞的增殖能力显著增加，克隆能力显著增强，且具有更强的生长及迁移能力。而采用circpias1抑制剂或circpias1抑制剂联合索拉非尼可有效抑制肝癌肿瘤的生长。
16.在其中一个实施例中，所述circpias1抑制剂包括靶向circpias1连接区域(junction区域)并使其失活的特异性核苷酸序列。
17.在其中一个实施例中，所述特异性核苷酸序列选自：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3中的一种或两种以上；
18.circpias1-抑制物001：ttgatggcatcagacaaca(seq id no.2)，
19.circpias1-抑制物002：gatggcatcagacaacagt(seq id no.3)，
20.circpias1-抑制物003：ccttattattgatggcatc(seq id no.4)。
21.本发明还提供一种circpias1抑制剂在制备用于抑制肝癌细胞生长和迁移能力的药物中的用途。
22.本发明还提供一种circpias1抑制剂联合索拉非尼在制备用于抑制肝癌细胞生长和迁移能力的药物中的用途。
23.采用circpias1抑制剂或circpias1抑制剂联合索拉非尼可有效抑制肝癌细胞的生长和迁移能力的效果。
24.本发明还提供一种调控circpias1表达水平的试剂在制备用于肝癌治疗的药物中的用途。
25.通过下调circpias1表达水平可抑制肝癌细胞的生长和迁移能力。
26.本发明还提供一种用于肝癌诊断和/或预后评估的试剂，包括检测生物样本中
circpias1含量的试剂。
27.在其中一个实施例中，所述生物样本为血清、血浆或者外泌体。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明以circpias1作为靶点，通过下调circpias1表达或抑制circpias1达到抑制肝癌细胞生长和迁移能力的效果。
附图说明
30.图1为circrna作为mirna海绵对mirna靶基因的调控作用示意图。
31.图2为circpias1在21例肝癌病人血清外泌体中的表达丰度。
32.图3为circpias1在肝癌中真实表达的验证结果。
33.其中，a为circpias1的序列构成示意图，b为circpias1验证convergent primers及探针设计示意图，c为circpias1 junction区域测序峰图，d为rnase r酶切实验结果。
34.图4为norhtern blot实验和qrt-pcr实验验证构建hepg2过表达circpias1细胞株的结果。
35.其中，a为norhtern blot实验结果，b为qrt-pcr实验结果。
36.图5为cck-8增殖实验验证过表达circpias1促进肝癌细胞增殖能力的结果。
37.图6为平板克隆实验验证过表达circpias1促进肝癌细胞干性的结果。
38.图7为transwell实验验证过表达circpias1促进肝癌细胞迁移能力的结果。
39.图8为qrt-pcr实验验证构建plc/prf/5敲低circpias1细胞株的结果。
40.图9为cck-8增殖实验验证敲低circpias1抑制肝癌细胞增殖能力的结果。
41.图10为transwell实验验证敲低circpias1抑制肝癌细胞迁移能力的结果。
42.图11为paris实验验证circpias1在肝癌细胞中的定位结果。
43.其中，a为qrt-pcr实验验证circpias1在胞浆胞核和浆中的表达结果，b为fish实验结果。
44.图12为circpias1抑制剂与sorafenib联合应用对肿瘤生长影响的结果。
45.其中，a为免疫组化鉴定肿瘤细胞，b为实验结束后不同处理组所采集肿瘤的体积比较，c为不同处理组肿瘤重量曲线，d为不同处理组肿瘤体积生长曲线。*：p《0.001。
46.图13为不同浓度的circpias1抑制剂和sorafenib对肝癌细胞和正常人肝细胞存活率影响的曲线。
47.其中，左图为circpias1抑制剂，右图为索拉非尼。
具体实施方式
48.为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
49.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
50.实施例1
51.生物信息数据库分析。
52.(1)geo数据库：
53.基因表达综合(gene expression omnibus,geo)数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)于2000年由ncbi创建，全球研究机构所提交的基因表达数据收录于该网站。为了探索与肝癌发生发展密切相关的重要基因和通路，发明人利用ncbi geo数据库进行搜索分析，其中数据集gse77661包含多个人类癌和癌旁circrna表达测序数据，在关于肝癌数据集的分析中，发现了一个可能与肝癌有关联的circrna——hsa_circ_0007088(circpias1)表达。
54.(2)exorbase数据库：
55.exorbase数据库是一个人类血液外泌体circrna、lncrna和mrna的数据库，外泌体是大多数细胞都可以分泌的纳米级的内吞囊泡，含有大量不同类型的rna，可以调节受体细胞的行为，并可作为疾病的循环生物标志物。exorbase对标准化rna-seq数据的rna表达谱进行了整合和可视化，这些数据涵盖了正常个体和不同疾病患者。
56.本发明中，发明人利用exorbase数据库分析发现，circpias1在肝癌病人的血清外泌体中表达(图2)。为了验证circpias1的表达，发明人根据circbase收录的序列分析了circpias1的转录结构(图3a)，并设计了convergent primer(图3b)，convergent primer的核苷酸序列如seq id no.5～6所示，通过测序证实了circpias1是由pias1 mrna第4个外显子与第10个外显子首尾拼接而成(图3c)，酶切实验进一步表明circpias1比线性pias1 mrna(linepias1)更能够抵抗rnase r的酶切作用(图3d)，从而证实了其成环性。
57.实施例2
58.circpias1对肝癌细胞恶性表型的影响。
59.一、实验方案
60.利用人肝癌细胞株(hepg2、plc/prf/5)进行体外细胞学功能实验，通过慢病毒感染表达系统分别建立circpias1稳定高表达(plo5-vector(对照空载体)vs.plo5-circpias1(高表达))和敲低(plko.1-shc202(对照组，non-target shrna)vs.plko.1-shcircpias1(敲低))多株肝癌细胞系，应用cck-8实验、平板克隆实验、软琼脂集落形成实验、transwell实验、划痕实验等，验证circpias1表达对于肝癌细胞生长、增殖、转移的作用。
61.二、验证实验
62.(1)cck-8增殖实验
63.第一步：取对数期生长的circ-pias过表达和敲低肝癌细胞株，消化计数，并用含10％fbs的dmem培养基稀释至每毫升10000个细胞。
64.第二步：吸取稀释好的细胞悬液按照每孔100μl的体积将细胞接种于96孔板(每孔细胞数为100个/100μl)，并围绕板的边缘加一圈灭菌的双蒸水，置于细胞培养箱培养过夜。
65.第三步：按照比例配制cck-8工作液(1：100)，从培养箱取出细胞，小心弃去上清，向每孔加入100μl稀释好的cck-8工作液，置于37℃培养4h。
66.第四步：孵育结束后将96孔板置于酶标仪中，读取450nm波长下的吸光值。
67.第五步：每天于固定时间进行检测，以天数为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲
线。
68.(2)平板克隆实验
69.第一步：将生长状态良好的细胞进行消化计数，使用完全培养基重悬并调整细胞密度为1000个/ml。
70.第二步：将细胞悬液接种于6孔板中，每组设置3个复孔，轻轻摇匀后放进细胞培养箱培养。
71.第三步：将接种好的细胞于培养箱连续培养7-14天，中途每隔两天观察细胞状态并更换新鲜完全培养基，待大多数单个克隆细胞数目大于100为止。
72.第四步：克隆形成后，从培养箱取出细胞，弃去培养基，使用新鲜的pbs清洗两次，加入预冷的甲醇并置于4℃固定30min；吸取固定液，用pbs清洗两遍，加入0.5％的结晶紫染色2h。
73.第五步：回收结晶紫，将孔板竖直缓慢放入自来水中清洗至背景干净，晾干后显微镜下拍照，统计视野下大于1mm的紫色克隆个数。
74.(3)软琼脂集落形成实验
75.将细胞接种于6孔培养板中，细胞生长至约95％后使用。2h后，将5
×
103细胞重新悬浮于0.375％琼脂含有10％fbs的dmem培养基1ml中，并将其倾倒在6孔板中0.6％琼脂dmem培养基(2.0ml/孔)的顶部。2周后，计数并拍摄》100个细胞的菌落。菌落体积的计算公式为：体积＝(长度
×
宽度2)/2。
76.(4)transwell实验
77.第一步：实验前，对细胞进行无血清培养饥饿24h。
78.第二步：消化细胞，使用无血清dmem重悬并计数，调整细胞浓度为5
×
105个/ml。
79.第三步：将500μl含10％fbs的dmem培养基加入24孔板孔中。
80.第四步：取出小室，用100μl无血清培养基轻轻润洗小室pc膜，随后将200μl细胞悬液加入小室内部。
81.第五步：用镊子将含有细胞的小室小心转移至含有完全培养基的24孔板中，避免出现气泡，将24孔板置于细胞培养箱培养24h。
82.第六步：培养结束后，取出小室并小心吸去上室培养基，用棉签轻轻擦去上室内的细胞。
83.第七步：使用甲醇固定细胞30min，0.5％的结晶紫染色2h，自来水冲洗至背景清晰。
84.第八步：正置显微镜下随机选取3-5个视野，计算过膜细胞数。
85.(5)划痕实验
86.第一步：培养板接种细胞前先用防脱色marker笔在12孔板背面画横线标记。
87.第二步：消化细胞并计数，将计数后的细胞接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜。
88.第三步：待细胞贴壁后，用灭菌的200μl枪头垂直于孔板从上至下快速划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。
89.第四步：取走细胞培养基，用pbs轻轻冲洗划痕区域三次，洗去细胞碎片，加入无血清培养基培养。
90.第五步：将培养板放入培养箱，每隔4-6h取出拍照，根据收集图片数据分析划痕面积。
91.(6)qrt-pcr实验
92.a)设计circpias1引物，并送交引物合成公司合成，circpias1引物序列对如下所示：
93.circpias1正向引物序列：tgtcgggcccttacatgttc(seq id no.5)；
94.circpias1反向引物序列：tctcgaaagcgctgactgtt(seq id no.6)。
95.b)circpias1定量pcr条件：(i)初始变性：5min，95℃；(ii)45个循环：变性15sec，95℃；退火20sec，55℃；延伸20sec，72℃。(iii)最后延伸：5min，72℃。
96.三、结果
97.利用慢病毒感染的方式对hepg2细胞进行了circpias1过表达肝癌稳定株的构建，图4a为northern blot实验结果，图4b为qrt-pcr实验结果，相比于plo5-v，plo5-circpias1的表达量明显增多，表明hepg2过表达circpias1细胞株构建成功。图5为cck-8实验结果，相比于plo5-v，plo5-circpias1的细胞数量更多，表明circpias1过表达的肝癌细胞增殖能力显著增加。图6为平板克隆形成实验结果，相比于plo5-v，plo5-circpias1对应的菌落数量明显更多，表明circpias1过表达的肝癌细胞成克隆能力显著增强。图7为transwell实验结果，相比于plo5-v，plo5-circpias1细胞的迁移能力明显更强，表明circpias1在体外具有促进肝癌细胞生长及迁移的作用。
98.利用慢病毒感染的方式对plc/prf5细胞进行了敲低circpias1肝癌稳定株的构建，图8为qrt-pcr实验结果，相比于shnc，shcircpias1的表达水平明显更低，表明plc/prf/5敲低circpias1细胞株构建成功。图9为cck-8实验结果，相比于shnc，shcircpias1的细胞数量更少，表明circpias1敲低的肝癌细胞增殖能力显著减弱。图10为transwell实验结果，相比于shnc，shcircpias1的细胞的迁移能力明显降低，表明circpias1敲低的肝癌细胞迁移能力显著削弱。
99.实施例3
100.circpias1在肝癌细胞的定位。
101.一、实验方法
102.免疫荧光方法：
103.第一步：取对数期生长的肝癌细胞均匀接种于腔室培养皿，每孔接种1
×
105个。
104.第二步：待细胞贴壁后，弃去上清，使用pbs洗两遍，每孔加入200μl预冷的甲醇溶液固定15min。
105.第三步：弃去甲醇，pbs清洗两遍，加入0.1％的tritonx-100破膜5min。
106.第四步：pbs清洗两遍，加入适量cct6a(1：100稀释)一抗至每孔(以完全覆盖细胞为宜)，置于4℃孵育过夜。
107.第五步：取出样品并回收一抗，pbs清洗两遍，加入荧光二抗(1：1000稀释)室温孵育45min(加入二抗后全程避光操作)。
108.第六步：弃去二抗，pbs清洗两遍，加入dapi(1：5000稀释)染色5min。
109.第七步：pbs洗去残留的dapi染料，拆除腔室培养皿的外部装置，自然晾干后使用防淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。
110.二、结果
111.通过paris kit分离肝癌细胞胞浆和胞核rna分析发现，circpias1主要在胞浆表达(图11a)，通过fish实验观察到circpias1过表达后主要分布在胞浆(图11b)。circpias1定位对于其功能发挥具有重要影响。
112.实施例4
113.体内抑制circpias1的抗肝癌作用。
114.一、实验方法
115.(1)动物分组
116.利用裸鼠皮下成瘤模型，在动物模型成瘤后设置四组：第一组为vehicle对照组、第二组为circpias1抑制剂、第三组为sorafenib单药组、第四组为circpias1抑制剂 sorafenib组。其中，circpias1抑制剂为circpias1-抑制物001:ttgatggcatcagacaaca(seq id no.2)。
117.(2)监测指标
118.监测小鼠体重、生化指标等变化，观测小鼠移植瘤样本大小变化、实验结束时称重；并确定两者联合时ic50的数值。
119.(3)实验流程
120.消化细胞并计数，使用稀释后的基质胶(无血清dmem：基质胶＝4：1)重悬细胞，并将细胞按照每管1
×
107个/200μl分装；使用75％酒精消毒皮肤，采用皮下注射方式，经肋下穿入针头至腋下，缓慢推入200μl细胞，拔针后用消毒棉签轻轻按压伤口15s；一周后初步观察肿瘤形成情况，并随后每隔2-3天测量肿瘤生长数据，记录下主要指标(小鼠体重、瘤体体积等)绘制生长曲线；在实验终结点时(待瘤体长至大约100mm3)，采用颈椎脱臼法处死小鼠，拍照后小心取出瘤体，称重、测量大小并保存在4％的多聚甲醛中，用作后续病理检测。
121.二、结果
122.图12为circpias1抑制剂、sorafenib以及circpias1抑制剂与sorafenib联合使用，对肿瘤生长过程中肿瘤重量和体积的影响，从图中可以看出circpias1抑制剂和circpias1抑制剂联合索拉非尼可以明显减少肿瘤的体积和降低肿瘤的生长速率，结果表明circpias1抑制剂以及circpias1抑制剂联合索拉非尼治疗具有较好的抗肝脏肿瘤的效果。
123.图13为不同浓度的circpias1抑制剂和sorafenib对肝癌细胞(hepg2)和正常人肝细胞(miha)存活率影响的曲线图，实验检测出circpias1抑制剂和索拉非尼药理上安全的ic50值。circpias1抑制剂对hepg2的ic50值为15.6μm，对miha细胞的ic50值为38.5μm；sorafenib对hepg2的ic50值为12.6μm，对miha细胞的ic50值为38.4μm。该结果提示，靶向circpias1可成为肝癌治疗的新路径，从而为开拓肝癌新策略提供理论依据。
124.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
125.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。