抗粘附迁移和侵袭的18β-甘草次酸-RGDK,其合成,抗癌转移活性和应用

抗粘附迁移和侵袭的18
β-甘草次酸-rgdk,其合成,抗癌转移活性和应用
技术领域
1.本发明涉及一种18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys,涉及它的制备方法,涉及它抑制肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭的活性,进一步涉及它能抑制癌向肺转移。因而本发明涉及它在制备抗癌转移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

2.甘草次酸是甘草酸在人体内的主要代谢产物。甘草酸是甘草的主要有效成分。甘草次酸含多个手性碳。18位碳原子就是其中之一。如果只改变18位手性碳原子的构型,那么便出现α和β两种差向异构体。97％天然甘草次酸是18β-甘草次酸。虽然18β-甘草次酸具有多种药理活性,但是因为活性低而严重限制了18β-甘草次酸的应用。为克服18β-甘草次酸的缺点,业内技术人员对18β-甘草次酸进行了各种化学修饰。不过成效不显著。
3.巨噬细胞是穿透肿瘤的最丰富的免疫细胞。肿瘤相关的巨噬细胞(tam)可以促进肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭,因而对癌转移有重要影响。肿瘤相关的巨噬细胞促进肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭的部分机制涉及由癌细胞表达的白细胞介素-1α(il-1α)能够募集环氧化酶-2(cox2)表达的巨噬细胞。反过来,募集的巨噬细胞又促进肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭,进一步推进肿瘤转移进程。这些知识说明,能够进入白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋的化合物应该有能力抑制巨噬细胞募集,因而有能力抑制肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭以及有能力抑制癌转移。在分析了白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋的形态之后,发明人设计了下式的18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys。利用分子对接技术,发明人将该化合物与白细胞介素-1α及环氧化酶-2对接。发现18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys可以很好地进入白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋(此处省略分子对接图)。这些理论研究使发明人认识到,18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys可抑制肿瘤细胞粘附,迁移和侵袭,因而可抑制癌向肺转移。根据这种认识,发明人完成了后面的实验研究。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种下式结构的新化合物18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys。
[0005][0006]
本发明的第二个内容是提供上式的18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的制备方法,该方法包括；
obzl消失。结束反应,冰浴下用5％khso4水溶液调节反应液ph至7,反应液减压浓缩。冰浴下再用5％khso4水溶液调节反应液ph至2,用乙酸乙酯萃取(30ml
×
3),乙酸乙酯层用饱和nacl水溶液洗(30ml
×
3),用无水硫酸钠干燥12小时。过滤,滤液减压浓缩,得到1.3g(88％)标题化合物,为无色油状物。esi-ms(m/e):375[m-h]-。
[0020]
实施例4制备hcl
·
asp(obzl)-lys(cbz)-obzl
[0021]
将2.7g(4.0mmol)boc-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl溶于20ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m),冰浴下反应4小时。tlc(二氯甲烷:甲醇,20:1)显示boc-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl消失。结束反应,反应液减压浓缩。残留物用15ml无水乙酸乙酯溶解,溶液液减压浓缩。该操作重复3次,彻底除去游离的氯化氢。将残留物悬浮于15ml石油醚中,悬浮液超声,静置。倾去石油醚,残留物再悬浮于15ml石油醚中,悬浮液再超声。该操作重复3次,得到2.0g(97％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):576[m h]

。
[0022]
实施例5制备boc-arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl
[0023]
采用实施例1的方法从1.3g(3.5mmol)boc-arg(no2)-gly和2.3g(3.8mmol)hcl
·
asp(obzl)-lys(cbz)-obzl得到2.1g(66％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):934[m h]

。
[0024]
实施例6制备hcl
·
arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl
[0025]
采用实施例4的方法从1.8g(2.0mmol)boc-arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl得到1.6g(93％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):834[m h]

。
[0026]
实施例7制备18β-甘草次酸-arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl
[0027]
采用实施例1的方法从0.8g(1.7mmol)18β-甘草次酸和1.3g(1.5mmol)hcl
·
arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl得0.7g(40％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):1285[m h]

。
[0028]
实施例8制备18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys
[0029]
将0.45g(0.35mmol)18β-甘草次酸-arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl溶于6ml甲醇，加45mg钯碳，抽去空气,边搅拌边通氢气,常温下反应。12小时后,tlc(乙酸乙酯:水:冰醋酸,4:1:1)显示18β-甘草次酸-arg(no2)-gly-asp(obzl)-lys(cbz)-obzl消失。滤除钯碳,滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗,得到0.23g(71％)标题化合物,为无色固体。ft-ms(m/e):927.60973[m h]

(理论值:927.60883)；1hnmr(dmso-d6,300mhz):δ/ppm＝10.01(s,1h),8.93(d,j＝8.0hz,1h),8.45(s,1h),8.31(s,2h),7.99(d,j＝13.5hz,1h),7.63(d,j＝7.8hz,1h),7.26(d,j＝7.3hz,2h),5.50(s,1h),4.39
–
4.24(m,2h),3.89(dd,j＝16.7,6.0hz,2h),3.63(d,j＝17.8hz,1h),3.19
–
3.13(m,1h),3.02(dd,j＝11.1,4.7hz,2h),2.71(t,j＝6.9hz,2h),2.59(dd,j＝9.9,4.7hz,2h),2.33(dd,j＝15.2,7.4hz,3h),2.13(s,1h),2.11
–
1.97(m,3h),1.92
–
1.80(m,2h),1.67(q,j＝13.4,12.8hz,6h),1.50(q,j＝8.7,7.6hz,7h),1.36(d,j＝7.2hz,8h),1.29(s,3h),1.15(d,j＝12.8hz,3h),1.05(d,j＝7.7hz,9h),0.97(s,2h),0.91(s,4h),0.71(d,j＝8.1hz,7h).；
13
cnmr(dmso-d6,75mhz):δ/ppm＝199.6,175.8,175.4,174.9,173.2,170.5,170.3,169.2,165.5,158.0,77.0,61.6,54.6,53.2,47.9,45.3,43.4,43.3,40.8,40.5,40.2,39.9,39.7,39.4,39.1,37.1,32.6,31.8,28.9,28.7,28.6,27.2,23.4,21.9,18.8,16.7,16.5。
[0030]
实施例9评价18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抗肿瘤细胞粘附的活性
[0031]
1).制备样品
[0032]
将18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys用dmso配成浓度为10mm的溶液,再用dmem稀释,终浓度为2.5μm,同时将dmso的含量控制为0.5％。将18β-甘草次酸用dmso配成浓度为10mm的溶液,再用dmem稀释,终浓度为25μm的溶液,同时将dmso的含量控制为0.5％。将arg-gly-asp-lys(rgdk四肽)用含0.5％dmso的dmem配制成25μm的溶液。制备含0.5％dmso的dmem。
[0033]
2).实验操作
[0034]
取生长状态良好处于对数生长期的llc细胞，倒去细胞培养液，加入1-2ml pbs缓冲液，弃去，重复2次，加入1ml胰蛋白酶-edta消化液置于孵箱中消化。在显微镜下观察细胞，如果大部分细胞由不规则形状变为规则圆形颗粒，并从瓶壁脱落飘起，加2mldmem培养基终止消化，用滴管沿瓶壁反复用力吹打使细胞分散于液体中，并将液体转移至经灭菌的15ml离心管中，1368g离心3分钟。弃上清液，加dmem培养基吹打细胞使其分散均匀，用细胞计数板在显微镜下计数，稀释至最终细胞浓度为5
×
106个/ml,transwell小室上室每孔加100μl无血清dmem培养基稀释的细胞悬液将细胞悬浮液均匀接种于96孔板中,每孔加100μl细胞悬浮液,同时加25μl18β-甘草次酸的溶液或18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的溶液或rgdk的溶液或者dmem。37℃于5％co2的细胞孵箱内培养1小时,用pbs洗去未粘附的细胞。在倒置显微镜下选择9个细胞分布均匀的区域拍照计数。
[0035]
3).实验结果
[0036]
粘附的细胞数以均值
±
sd个表示,经单因素方差分析进行组间统计学比较,结果列入表1。结果显示,18β-甘草次酸对llc细胞粘附的抑制作用与dmem无显著性差异。18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys对llc细胞粘附的抑制活性非常显著性强于18β-甘草次酸。可见,本发明有突出的抑制细胞粘附的活性。
[0037]
表1 18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抗llc细胞粘附的活性
[0038][0039]
a)与dmem比p《0.01；b)与dmem比p》0.05；n＝8.
[0040]
实施例10评价18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys细胞迁移活性
[0041]
1)制备样品
[0042]
采用实施例9的方法制备样品。
[0043]
2)实验操作
[0044]
取生长状态良好处于对数生长期的llc细胞,倾去细胞培养液,加2mlpbs缓冲液洗,倾去pbs缓冲液。该操作重复2次。加1ml胰蛋白酶-edta消化液,于孵箱中消化。在显微镜下观察细胞消化状态,如果大部分细胞由不规则形状变为规则圆形颗粒并从瓶壁脱落飘起,加入2mldmem培养基终止消化,滴管沿瓶壁反复用力吹打分散于液体中并将液体转移至
经灭菌的15ml离心管中,1368g离心3分钟。弃上清液,加不含胎牛血清的dmem吹打细胞使分散均匀,用细胞计数板在显微镜下计数,用不含胎牛血清的dmem将细胞稀释至终浓度为5
×
105个/ml的细胞悬浮液。在transwell小室上室加100μl细胞悬液,加25μl18β-甘草次酸的溶液或18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的溶液或rgdk的溶液或者dmem。下室加600μl含10％胎牛血清的dmem,置37℃及5％co2的细胞孵箱内培养7小时。
[0045]
将transwell小室从37℃及5％co2孵箱内取出,吸去上室液体,向上室加100μlpbs缓冲液,用蓬松的棉签轻轻擦去上室细胞和残留的培养基。该操作重复3次,使上室无细胞残留,加600μl浓度为4％的多聚甲醛,4℃固定30分钟。吸除下室残余液体,加600μl浓度为0.1％的结晶紫染色液,常温染色15分钟。吸除染色液,洗除小室上残余染色液,回收染色液,晾干小室,在倒置显微镜下每室选择9个细胞分布均匀的区域拍照计数。
[0046]
3)实验结果
[0047]
迁移的细胞数以均值
±
sd个表示,经单因素方差分析进行组间统计学比较,结果列入表1。数据显示,在25μm浓度下18β-甘草次酸对llc细胞迁移的抑制活性显著强于dmem。在2.5μm浓度下18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys对llc细胞迁移的抑制活性非常显著强于18β-甘草次酸。可见,本发明有突出的抑制细胞迁移的效果。
[0048]
表2 18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抗llc细胞迁移活性
[0049][0050]
a)与pbs比p《0.01；b)与18β-甘草次酸比p《0.01；n＝8.
[0051]
实施例11评价18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的抗细胞侵袭活性
[0052]
1)制备样品
[0053]
采用实施例9的方法制备样品。
[0054]
2)实验操作
[0055]
包被基质胶:提前将-20℃冰箱保存的黄色固体matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜,基质胶变成粉红色液体。按照基质胶和不含胎牛血清的dmem1/9的比例配制基质胶溶液。将100μl基质胶溶液加到transwell小室上室,置37℃及5％co2孵箱孵育5小时。
[0056]
水化基底膜:吸除transwell小室上室残余液体,加50μl不含胎牛血清的dmem,置37℃及5％co2孵箱孵育30分钟,再吸除小室上室残余液体。
[0057]
3)取生长状态良好处于对数生长期的llc细胞,倾去细胞培养液,加2mlpbs缓冲液洗,倾去pbs缓冲液。该操作重复2次。加1ml胰蛋白酶-edta消化液,于孵箱中消化。在显微镜下观察细胞消化状态,如果大部分细胞由不规则形状变为规则圆形颗粒并从瓶壁脱落飘起,则加2mldmem培养基终止消化,滴管沿瓶壁反复吹打使细胞分散于液体中并将液体转移至经灭菌的15ml离心管中,1368g离心3分钟。弃上清液,加不含胎牛血清的dmem吹打细胞使分散均匀,用细胞计数板在显微镜下计数,用不含胎牛血清的dmem将细胞稀释至终浓度为5
×
105个/ml的细胞悬浮液,加100μl细胞悬液至transwell小室上室,及25μl18β-甘草次酸的溶液或18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的溶液或rgdk的溶液或者不含胎牛血清的dmem。下室加600μl含10％胎牛血清的dmem,于37℃及5％co2的细胞孵箱培养7小时。
[0058]
将transwell小室从37℃及5％co2孵箱内取出,吸去上室液体,加100μlpbs缓冲液,用蓬松的棉签轻轻擦去上室细胞和残留的培养基。该操作重复3次,使上室无细胞残留。加600μl浓度为4％的多聚甲醛,4℃固定30分钟。吸除下室残余液体,加600μl浓度为0.1％的结晶紫染色液,常温染色15分钟。吸除染色液,洗除小室上残余染色液,回收染色液,晾干小室,在倒置显微镜下选择9个细胞分布均匀的区域拍照计数。
[0059]
3)实验结果
[0060]
显微镜下的细胞个数以均值
±
sd个表示,经单因素方差分析进行组间统计学比较。结果列入表3。数据显示,在25μm浓度下18β-甘草次酸对llc细胞侵袭的抑制活性显著性强于dmem。在2.5μm浓度下18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys对llc细胞侵袭的抑制活性非常显著强于18β-甘草次酸。可见,本发明有突出的抑制细胞侵袭的技术效果。
[0061]
表3 18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抗llc细胞侵袭活性
[0062][0063]
a)与dmem比p《0.01；b)与dmem及18β-甘草次酸比p《0.01；n＝8.
[0064]
实施例12评价18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抑制小鼠癌向肺转移的活性
[0065]
1)实验动物及试剂
[0066]
雄性c57bl/6小鼠(20
±
2g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。18β-甘草次酸的剂量为5μmol/kg/天。18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys的剂量为0.5μmol/kg/天。阴性对照为0.5％cmcna。阳性对照为rgdk,剂量为20μmol/kg/天。均腹腔注射给药。
[0067]
2)实验操作
[0068]
lewis小鼠肺癌细胞(llc),购自atcc,按单层细胞培养方法自行传递培养。选用含10％胎牛血清的dmem为培养基。按照贴壁细胞培养方法,每天传代一次,富集细胞至所需数量。预先将pbs缓冲液,胰蛋白酶-edta消化液和细胞需要的dmem培养基于37℃预热30分钟。待细胞生长状态良好,透明度大,内颗粒少,无空泡,胞膜清晰,培养液上清液清澈透明,无悬浮细胞和碎片并处于对数生长期及细胞生长至铺满瓶底面积80％时,去除原细胞培养液,加1ml pbs缓冲液清洗残留培养基3次,弃缓冲液,加1ml胰蛋白酶-edta消化液置孵箱中消化,在显微镜下观察细胞形态。如果大部分细胞由不规则形状变为规则圆形颗粒并有小部分从瓶壁脱落飘起,则加1mldmem终止消化。滴管沿瓶壁反复用力吹打细胞使脱壁并分散于液体中。将液体转移至经灭菌的15ml离心管中,1368g离心3分钟。弃上清液,用4℃生理盐水调整细胞浓度至2
×
107个/ml,台盼蓝染色计数表明活细胞数》95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠,左手固定小鼠,用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤,右手持1ml无菌注射器于小
鼠腋部皮下注射lewis小鼠肺癌细胞悬液(0.2ml/只)。接种后10天可见有实体瘤组织形成。第17-20天长出直径约2-3mm实体瘤,即得瘤源小鼠。
[0069]
将lewis肺癌荷瘤小鼠用乙醚麻醉,脱颈椎处死,用75％的乙醇浸泡消毒10分钟,在超净工作台上剥离瘤体,在无菌平皿中剪碎,置于玻璃组织匀浆器内按瘤块重(g)/生理盐水体积(ml)为1/3的比例用预冷至4℃的生理盐水轻轻研磨,制成细胞悬液,过200目细胞筛制成单细胞悬液,用生理盐水调整细胞浓度为2
×
107个/ml,台盼蓝染色计数表明活细胞数》95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠,左手固定小鼠,用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤,右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射lewis小鼠肺癌细胞悬液(0.2ml/只)。自接种日起每日对荷瘤小鼠进行观察,待小鼠腋下实体瘤长至黄豆粒大小时重新分组,保证每组小鼠肿瘤状态基本一致后开始给药,每天给药1次(0.1ml/10g),连续给药10天。期间隔1天用游标卡尺测定小鼠腋下肿瘤大小并记录。第10天用乙醚将小鼠麻醉,脱颈椎处死,取出肿瘤及肺。快速计算肺上的瘤结数,以均值
±
sd g表示,经单因素方差分析进行组间统计学比较。
[0070]
3)实验结果
[0071]
在小鼠lewis肺癌转移模型上,评价的18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抑制癌向转移的活性列入表4。数据显示,18β-甘草次酸抑制癌向肺转移的活性与cmcna无显著性差异,18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抑制癌向肺转移的活性非常显著强于18β-甘草次酸。可见,本发明有突出的抑制肿瘤转移的技术效果。
[0072]
表4 18β-甘草次酸-arg-gly-asp-lys抑制癌向肺转移的活性
[0073][0074]
a)与cmcna比p》0.05；b)与cmcna及18β-甘草次酸比p《0.01；n＝10。