高粱sbms1蛋白及其编码基因与应用
技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及高粱sbms1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：：2.杂种优势是生物界的一种普遍现象，是指两个基因型不同的亲本杂交产生的杂种，在生长势、生活力、繁殖力、适应性以及产量、品质等性状方面超过其双亲的现象。杂种优势利用也是提高作物产量的重要途径，其中，雄性不育基因的克隆及雄性不育系的培育是自花授粉作物有效利用杂种优势的前提和基础。以水稻为代表，主要有“质核互作三系”和“光温敏不育两系”两种利用途径。在高粱上，利用细胞质雄性不育系实现了杂种优势利用。然而，“质核互作三系”和“光温敏不育两系”都有各自的缺点。例如，细胞质雄性不育系的培育需要多代的回交，费时费力；制种时需要不育系、保持系、恢复系三系配套，制种流程繁琐；恢复系遗传资源有限，需要特殊培育；光温敏雄性不育系的育性不稳定容易受到环境变化的影响等。3.植物高度雄性不育是指植物的雌配子体发育正常，并且大部分雄配子体发育异常而通常只能产生少量有功能活性花粉的现象。植物依靠少量正常的花粉可以自交保持，特别是一些繁殖系数较高的作物如水稻、小麦、高粱、油菜、谷子、珍珠粟等。利用这种高度雄性不育材料培育成不育系，配合具有显性抗除草剂性状的材料作为恢复系，可以制备杂交种，大大扩宽杂种优势利用的遗传基础，简化了制种流程，且不育系育性较为稳定，相比较传统“质核互作三系”和“光温敏不育两系”优势明显。技术实现要素：4.本发明的第一个目的是提供sbms1蛋白的新用途。5.本发明提供了sbms1蛋白在调控植物雄性育性中的应用：6.所述sbms1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：7.a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；8.a2)在序列3所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；9.a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物雄性育性相关的蛋白质；10.a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于高粱且与植物雄性育性相关的蛋白质。11.上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。12.上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。13.上述a4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。14.上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。15.本发明的第二个目的是提供与sbms1蛋白相关的生物材料的新用途。16.本发明提供了与sbms1蛋白相关的生物材料在调控植物雄性育性中的应用：17.所述生物材料为下述a1)至a8)中的任一种：18.a1)编码sbms1蛋白的核酸分子；19.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；20.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；21.a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；22.a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；23.a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；24.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；25.a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物。26.上述应用中，a1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：27.b1)序列1所示的基因组dna分子；28.b2)序列2所示的cdna分子；29.b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码sbms1蛋白的cdna分子或基因组dna分子；30.b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码sbms1蛋白的cdna分子或基因组dna分子。31.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。32.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质sbms1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码蛋白质sbms1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质sbms1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。33.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。34.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。35.上述应用中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。36.上述应用中，a2)所述的含有编码蛋白质sbms1的核酸分子的表达盒(sbms1基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达蛋白质sbms1的dna，该dna不但可包括启动sbms1转录的启动子，还可包括终止sbms1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。37.可用现有的表达载体构建含有所述sbms1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。38.上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。39.上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。40.本发明的第三个目的是提供m1或m2所示的物质的新用途；41.m1、抑制或降低植物中sbms1蛋白活性或者含量的物质；42.m2、抑制或降低植物中sbms1蛋白编码核酸表达的物质或敲除植物中sbms1蛋白编码核酸的物质。43.本发明提供了m1或m2所示的物质在如下1)或2)中的应用：44.1)调控植物雄性育性；45.2)培育雄性不育的转基因植物。46.上述应用中，所述调控植物雄性育性为使植物雄性不育，体现为：当敲除植物中的sbms1蛋白编码核酸后，该植物雄性不育，进一步体现为：当敲除植物中的sbms1蛋白编码核酸后，该植物的花粉活性和/或结实率显著降低。47.本发明的第四个目的是提供一种培育雄性不育的转基因植物的方法。48.本发明提供的培育雄性不育的转基因植物的方法包括如下步骤：降低受体植物中sbms1蛋白的含量和/或活性或抑制或降低受体植物中sbms1蛋白编码核酸的表达或敲除受体植物中sbms1蛋白编码核酸，得到转基因植物；所述转基因植物为雄性不育。49.上述方法中，所述sbms1蛋白编码核酸的序列为序列1或序列2所示的dna分子。50.进一步的，所述转基因植物为雄性不育体现为所述转基因植物的花粉活性低于所述受体植物和/或所述转基因植物的结实率低于所述受体植物。51.更进一步的，所述敲除受体植物中sbms1蛋白编码核酸的物质为crispr/cas9系统。所述crispr/cas9系统中sgrna的靶序列具体为序列4所示的dna分子。52.上述任一所述应用或方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步的，所述禾本科植物为高粱(如高粱tx430)。53.本发明的最后一个目的是提供一种特异sgrna或含有所述sgrna编码基因的表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或转基因植物细胞系，所述sgrna的靶序列为序列4所示的dna分子。54.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供sbms1蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。通过实验证明：sbms1基因的功能缺失会导致高粱的高度雄性不育。与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：由于sbms1基因功能的缺失会特异性导致高粱的高度雄性不育；可利用敲除或抑制sbms1的特异性表达技术获得高粱高度雄性不育系，在农业生产上具有十分重要的应用。附图说明55.图1为sbms1基因结构、靶点设计及靶点处基因编辑类型。56.图2为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的sbms1基因组序列比对示意图。57.图3为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的植株形态学观察示意图。58.图4为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗部表型观察示意图。59.图5为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉i2-ik染色观察示意图。60.图6为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉育性及结实率统计图。具体实施方式61.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。62.下述实施例中的高粱dna的提取采用改进的ctab法进行。具体步骤如下：取叶片0.1-0.2克放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入800ul65℃预热的ctab溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入800ul氯仿/异戊醇溶液(氯仿:异戊醇＝24:1)，猛烈混匀，12000rpm离心10分钟，取上清，再次加入800ul氯仿/异戊醇溶液(氯仿:异戊醇＝24:1)，12000rpm离心10分钟，取上清于新离心管中，加入600ul异丙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的dna离心，12000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用500ul70％乙醇清洗两次，离心干燥，溶于100ul去离子水中，-20℃冰箱保存。63.下述实施例中的sbms1基因的基因组序列如序列表中的序列1所示，sbms1基因的cds序列如序列表中的序列2所示，sbms1蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。64.下述实施例中的高粱tx430记载于文献“sato-izawak,tokuek,ezurah.developmentofastableagrobacterium-mediatedtransformationprotocolforsorghumbicolortx430[j].plantbiotechnology,2018,35(2).”中。[0065]实施例1、sbms1蛋白在调控植物育性中的应用[0066]一、sbms1敲除高粱的获得[0067]1、敲除靶点的设计[0068]根据sbms1基因序列，利用植物crispr/cas9在线靶点设计网站crispr-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计sbms1基因敲除靶序列，最终筛选得到的sbms1基因敲除靶序列如下：5’‑ccgcacgtagggcgaatcca-3’(序列4)。[0069]2、用于infusion连接且含靶序列的片段的获得[0070]在10μl的体系中加入crispr(sobic)上游引物5’‑agatgatccgtggcaccgcacgtagggcgaatccagttttagagctatgc-3’和下游引物5’‑gcatagctctaaaactggattcgccctacgtgcggtgccacggatcatct-3’各5μl，94℃10min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10min，完成退火，获得用于infusion连接且含靶序列的dna片段。[0071]3、sbms1敲除载体的构建[0072]将pcas9载体利用限制性内切酶aarⅰ(catno.er1581，thermofisherscientific，unitedstates)37℃酶切5h，得到pcas9线性载体。然后将步骤2获得的dna片段5’‑agatgatccgtggcaccgcacgtagggcgaatccagttttagagctatgc-3’利用in-fusionhdcloningkits(catno.639648，takara，japan)连入pcas9线性载体，转化大肠杆菌感受态细胞trans-t1(catno.cd501，transgenbiotech，china)并涂布含壮观霉素spec的固体lb培养基上，挑取单克隆并利用引物5’‑cccttcaccgtcagatgctact-3’和5’‑tggataatgtgcaagggatcttt-3’(目标产物序列大小为1090bp)进行测序鉴定。[0073]pcas9载体的核苷酸序列如序列表中的序列5所示，其中，序列5第1611-1863位为胭脂碱合酶终止子，第1992-2789位为氨基糖苷类磷酸转移酶的编码基因序列，第2882-3061位为胭脂碱合酶启动子序列，第3445-7545位为化脓性链球菌ii型crispr/cas系统的cas9(csn1)内切酶的编码基因序列，第7546-7566位为核定位信号序列，第7640-9632位为玉米泛素启动子序列，第9707-10087位为水稻snrnau3启动子序列，第10923-11013位为小向导rna(sgrna)的编码基因序列。[0074]测序结果表明：sbms1基因敲除载体为将靶序列5’‑ccgcacgtagggcgaatcca-3’插入pcas9载体第10087位和第10923位之间，且保持其它序列不变后得到的载体。[0075]4、敲除高粱的获得及鉴定[0076]将步骤3构建的sbms1基因敲除载体导入农杆菌eha105，得到重组菌；使用农杆菌介导的遗传转化手段转化高粱tx430幼胚愈伤，得到t0代转基因植株。利用引物5’‑gtggagccctgctgctg-3’和5’‑aagggcaggctacgacta-3’(目标产物序列大小为315bp)对t0代转基因植株进行dna检测，确定转基因植物编辑方式，获得t1代种子，在温室进行播种，对t1代转基因植株再次进行dna检测并使用表1中的引物对sbms1基因进行扩增与测序，检测编辑方式是否稳定遗传及植株编辑位点的纯杂合，最终得到高度雄性不育植株，经过测序发现均为纯合编辑单株，分别命名为sbms1#8、sbms1#11、sbms1#20。[0077]表1、基因测序引物[0078]引物名产物长度上游引物下游引物sbms1-1921gggacgagcctacaggaataacagtgcggttgtaaggtsbms1-21210tccctctgaagaaacctcgactcattcgcattggacsbms1-31254ctttcgtgatcggtgtcctgcaccagcagtaaccatsbms1-41369atgcttagggaacttgaaaggagtatgaatggtggg[0079]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#8的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了一个碱基a的插入，该碱基a的插入位置为序列1第259位和第260位之间(图1)，从而造成移码并提前终止，sbms1蛋白功能缺失。野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的sbms1基因组序列比对示意图如图2所示。[0080]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#11的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了3bp的碱基缺失，该缺失碱基位于序列1第260-262位(att)，从而造成对应于序列3所示的sbms1蛋白氨基酸序列第88位asp(d)变为ala(a)以及第89位ser(s)缺失。[0081]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#20的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了25bp的碱基缺失，该缺失碱基位于序列1第238-262位，从而移码并提前终止，sbms1蛋白功能缺失。[0082]二、sbms1敲除高粱的育性分析[0083]1、植株和穗部形态观察[0084]取开花期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8进行植株形态学观察。取成熟期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8进行穗部表型观察。[0085]野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的植株形态学观察示意图如图3所示，结果表明：与野生型高粱品种tx430相比，基因编辑纯合株系sbms1#8株高没有明显差异。野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗部表型观察示意图如图4所示，结果表明：野生型高粱品种tx430结实正常，而基因编辑纯合株系sbms1#8结实受到严重影响而只有少量的种子。说明sbms1突变之后严重影响高粱结实。[0086]2、花粉i2-ik染色[0087]取开花期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8花药置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴i2-ki溶液，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成黑色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。[0088]结果如图5所示，对野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8花粉进行i2-ik染色时发现野生型高粱品种tx430花粉能够正常着色(图5左)，而基因编辑纯合株系sbms1#8大部分花粉不能够正常着色(图5右)。基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉活性显著低于野生型高粱品种tx430(图6左)。[0089]3、结实率[0090]取成熟期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗，每个穗随机统计5个一级分支的小花数和结实数，根据公式“结实率＝(结实数/小花数)*100％”计算结实率，野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8分别统计至少5株的结实率。[0091]结果如图6所示。结果表明：野生型高粱品种tx430能够正常结实，而基因编辑纯合株系sbms1#8结实率明显下降(图6右)。说明基因编辑纯合株系sbms1#8表现出部分雄性不育表型，即将sbms1突变之后可以导致高粱高度雄性不育，sbms1具有调控植物雄性育性的功能。[0092]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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：的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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：，具体涉及高粱sbms1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：：2.杂种优势是生物界的一种普遍现象，是指两个基因型不同的亲本杂交产生的杂种，在生长势、生活力、繁殖力、适应性以及产量、品质等性状方面超过其双亲的现象。杂种优势利用也是提高作物产量的重要途径，其中，雄性不育基因的克隆及雄性不育系的培育是自花授粉作物有效利用杂种优势的前提和基础。以水稻为代表，主要有“质核互作三系”和“光温敏不育两系”两种利用途径。在高粱上，利用细胞质雄性不育系实现了杂种优势利用。然而，“质核互作三系”和“光温敏不育两系”都有各自的缺点。例如，细胞质雄性不育系的培育需要多代的回交，费时费力；制种时需要不育系、保持系、恢复系三系配套，制种流程繁琐；恢复系遗传资源有限，需要特殊培育；光温敏雄性不育系的育性不稳定容易受到环境变化的影响等。3.植物高度雄性不育是指植物的雌配子体发育正常，并且大部分雄配子体发育异常而通常只能产生少量有功能活性花粉的现象。植物依靠少量正常的花粉可以自交保持，特别是一些繁殖系数较高的作物如水稻、小麦、高粱、油菜、谷子、珍珠粟等。利用这种高度雄性不育材料培育成不育系，配合具有显性抗除草剂性状的材料作为恢复系，可以制备杂交种，大大扩宽杂种优势利用的遗传基础，简化了制种流程，且不育系育性较为稳定，相比较传统“质核互作三系”和“光温敏不育两系”优势明显。技术实现要素：4.本发明的第一个目的是提供sbms1蛋白的新用途。5.本发明提供了sbms1蛋白在调控植物雄性育性中的应用：6.所述sbms1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：7.a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；8.a2)在序列3所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；9.a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物雄性育性相关的蛋白质；10.a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于高粱且与植物雄性育性相关的蛋白质。11.上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。12.上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。13.上述a4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。14.上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。15.本发明的第二个目的是提供与sbms1蛋白相关的生物材料的新用途。16.本发明提供了与sbms1蛋白相关的生物材料在调控植物雄性育性中的应用：17.所述生物材料为下述a1)至a8)中的任一种：18.a1)编码sbms1蛋白的核酸分子；19.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；20.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；21.a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；22.a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；23.a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；24.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；25.a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物。26.上述应用中，a1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：27.b1)序列1所示的基因组dna分子；28.b2)序列2所示的cdna分子；29.b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码sbms1蛋白的cdna分子或基因组dna分子；30.b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码sbms1蛋白的cdna分子或基因组dna分子。31.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。32.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质sbms1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码蛋白质sbms1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质sbms1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。33.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。34.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。35.上述应用中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。36.上述应用中，a2)所述的含有编码蛋白质sbms1的核酸分子的表达盒(sbms1基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达蛋白质sbms1的dna，该dna不但可包括启动sbms1转录的启动子，还可包括终止sbms1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。37.可用现有的表达载体构建含有所述sbms1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。38.上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。39.上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。40.本发明的第三个目的是提供m1或m2所示的物质的新用途；41.m1、抑制或降低植物中sbms1蛋白活性或者含量的物质；42.m2、抑制或降低植物中sbms1蛋白编码核酸表达的物质或敲除植物中sbms1蛋白编码核酸的物质。43.本发明提供了m1或m2所示的物质在如下1)或2)中的应用：44.1)调控植物雄性育性；45.2)培育雄性不育的转基因植物。46.上述应用中，所述调控植物雄性育性为使植物雄性不育，体现为：当敲除植物中的sbms1蛋白编码核酸后，该植物雄性不育，进一步体现为：当敲除植物中的sbms1蛋白编码核酸后，该植物的花粉活性和/或结实率显著降低。47.本发明的第四个目的是提供一种培育雄性不育的转基因植物的方法。48.本发明提供的培育雄性不育的转基因植物的方法包括如下步骤：降低受体植物中sbms1蛋白的含量和/或活性或抑制或降低受体植物中sbms1蛋白编码核酸的表达或敲除受体植物中sbms1蛋白编码核酸，得到转基因植物；所述转基因植物为雄性不育。49.上述方法中，所述sbms1蛋白编码核酸的序列为序列1或序列2所示的dna分子。50.进一步的，所述转基因植物为雄性不育体现为所述转基因植物的花粉活性低于所述受体植物和/或所述转基因植物的结实率低于所述受体植物。51.更进一步的，所述敲除受体植物中sbms1蛋白编码核酸的物质为crispr/cas9系统。所述crispr/cas9系统中sgrna的靶序列具体为序列4所示的dna分子。52.上述任一所述应用或方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步的，所述禾本科植物为高粱(如高粱tx430)。53.本发明的最后一个目的是提供一种特异sgrna或含有所述sgrna编码基因的表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或转基因植物细胞系，所述sgrna的靶序列为序列4所示的dna分子。54.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供sbms1蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。通过实验证明：sbms1基因的功能缺失会导致高粱的高度雄性不育。与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：由于sbms1基因功能的缺失会特异性导致高粱的高度雄性不育；可利用敲除或抑制sbms1的特异性表达技术获得高粱高度雄性不育系，在农业生产上具有十分重要的应用。附图说明55.图1为sbms1基因结构、靶点设计及靶点处基因编辑类型。56.图2为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的sbms1基因组序列比对示意图。57.图3为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的植株形态学观察示意图。58.图4为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗部表型观察示意图。59.图5为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉i2-ik染色观察示意图。60.图6为野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉育性及结实率统计图。具体实施方式61.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。62.下述实施例中的高粱dna的提取采用改进的ctab法进行。具体步骤如下：取叶片0.1-0.2克放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入800ul65℃预热的ctab溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入800ul氯仿/异戊醇溶液(氯仿:异戊醇＝24:1)，猛烈混匀，12000rpm离心10分钟，取上清，再次加入800ul氯仿/异戊醇溶液(氯仿:异戊醇＝24:1)，12000rpm离心10分钟，取上清于新离心管中，加入600ul异丙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的dna离心，12000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用500ul70％乙醇清洗两次，离心干燥，溶于100ul去离子水中，-20℃冰箱保存。63.下述实施例中的sbms1基因的基因组序列如序列表中的序列1所示，sbms1基因的cds序列如序列表中的序列2所示，sbms1蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。64.下述实施例中的高粱tx430记载于文献“sato-izawak,tokuek,ezurah.developmentofastableagrobacterium-mediatedtransformationprotocolforsorghumbicolortx430[j].plantbiotechnology,2018,35(2).”中。[0065]实施例1、sbms1蛋白在调控植物育性中的应用[0066]一、sbms1敲除高粱的获得[0067]1、敲除靶点的设计[0068]根据sbms1基因序列，利用植物crispr/cas9在线靶点设计网站crispr-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计sbms1基因敲除靶序列，最终筛选得到的sbms1基因敲除靶序列如下：5’‑ccgcacgtagggcgaatcca-3’(序列4)。[0069]2、用于infusion连接且含靶序列的片段的获得[0070]在10μl的体系中加入crispr(sobic)上游引物5’‑agatgatccgtggcaccgcacgtagggcgaatccagttttagagctatgc-3’和下游引物5’‑gcatagctctaaaactggattcgccctacgtgcggtgccacggatcatct-3’各5μl，94℃10min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10min，完成退火，获得用于infusion连接且含靶序列的dna片段。[0071]3、sbms1敲除载体的构建[0072]将pcas9载体利用限制性内切酶aarⅰ(catno.er1581，thermofisherscientific，unitedstates)37℃酶切5h，得到pcas9线性载体。然后将步骤2获得的dna片段5’‑agatgatccgtggcaccgcacgtagggcgaatccagttttagagctatgc-3’利用in-fusionhdcloningkits(catno.639648，takara，japan)连入pcas9线性载体，转化大肠杆菌感受态细胞trans-t1(catno.cd501，transgenbiotech，china)并涂布含壮观霉素spec的固体lb培养基上，挑取单克隆并利用引物5’‑cccttcaccgtcagatgctact-3’和5’‑tggataatgtgcaagggatcttt-3’(目标产物序列大小为1090bp)进行测序鉴定。[0073]pcas9载体的核苷酸序列如序列表中的序列5所示，其中，序列5第1611-1863位为胭脂碱合酶终止子，第1992-2789位为氨基糖苷类磷酸转移酶的编码基因序列，第2882-3061位为胭脂碱合酶启动子序列，第3445-7545位为化脓性链球菌ii型crispr/cas系统的cas9(csn1)内切酶的编码基因序列，第7546-7566位为核定位信号序列，第7640-9632位为玉米泛素启动子序列，第9707-10087位为水稻snrnau3启动子序列，第10923-11013位为小向导rna(sgrna)的编码基因序列。[0074]测序结果表明：sbms1基因敲除载体为将靶序列5’‑ccgcacgtagggcgaatcca-3’插入pcas9载体第10087位和第10923位之间，且保持其它序列不变后得到的载体。[0075]4、敲除高粱的获得及鉴定[0076]将步骤3构建的sbms1基因敲除载体导入农杆菌eha105，得到重组菌；使用农杆菌介导的遗传转化手段转化高粱tx430幼胚愈伤，得到t0代转基因植株。利用引物5’‑gtggagccctgctgctg-3’和5’‑aagggcaggctacgacta-3’(目标产物序列大小为315bp)对t0代转基因植株进行dna检测，确定转基因植物编辑方式，获得t1代种子，在温室进行播种，对t1代转基因植株再次进行dna检测并使用表1中的引物对sbms1基因进行扩增与测序，检测编辑方式是否稳定遗传及植株编辑位点的纯杂合，最终得到高度雄性不育植株，经过测序发现均为纯合编辑单株，分别命名为sbms1#8、sbms1#11、sbms1#20。[0077]表1、基因测序引物[0078]引物名产物长度上游引物下游引物sbms1-1921gggacgagcctacaggaataacagtgcggttgtaaggtsbms1-21210tccctctgaagaaacctcgactcattcgcattggacsbms1-31254ctttcgtgatcggtgtcctgcaccagcagtaaccatsbms1-41369atgcttagggaacttgaaaggagtatgaatggtggg[0079]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#8的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了一个碱基a的插入，该碱基a的插入位置为序列1第259位和第260位之间(图1)，从而造成移码并提前终止，sbms1蛋白功能缺失。野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的sbms1基因组序列比对示意图如图2所示。[0080]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#11的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了3bp的碱基缺失，该缺失碱基位于序列1第260-262位(att)，从而造成对应于序列3所示的sbms1蛋白氨基酸序列第88位asp(d)变为ala(a)以及第89位ser(s)缺失。[0081]与野生型高粱tx430基因组dna相比，sbms1#20的差异仅在于在序列1所示的编码sbms1蛋白的基因序列中，发生了25bp的碱基缺失，该缺失碱基位于序列1第238-262位，从而移码并提前终止，sbms1蛋白功能缺失。[0082]二、sbms1敲除高粱的育性分析[0083]1、植株和穗部形态观察[0084]取开花期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8进行植株形态学观察。取成熟期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8进行穗部表型观察。[0085]野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的植株形态学观察示意图如图3所示，结果表明：与野生型高粱品种tx430相比，基因编辑纯合株系sbms1#8株高没有明显差异。野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗部表型观察示意图如图4所示，结果表明：野生型高粱品种tx430结实正常，而基因编辑纯合株系sbms1#8结实受到严重影响而只有少量的种子。说明sbms1突变之后严重影响高粱结实。[0086]2、花粉i2-ik染色[0087]取开花期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8花药置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴i2-ki溶液，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成黑色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。[0088]结果如图5所示，对野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8花粉进行i2-ik染色时发现野生型高粱品种tx430花粉能够正常着色(图5左)，而基因编辑纯合株系sbms1#8大部分花粉不能够正常着色(图5右)。基因编辑纯合株系sbms1#8的花粉活性显著低于野生型高粱品种tx430(图6左)。[0089]3、结实率[0090]取成熟期的野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8的穗，每个穗随机统计5个一级分支的小花数和结实数，根据公式“结实率＝(结实数/小花数)*100％”计算结实率，野生型高粱品种tx430和基因编辑纯合株系sbms1#8分别统计至少5株的结实率。[0091]结果如图6所示。结果表明：野生型高粱品种tx430能够正常结实，而基因编辑纯合株系sbms1#8结实率明显下降(图6右)。说明基因编辑纯合株系sbms1#8表现出部分雄性不育表型，即将sbms1突变之后可以导致高粱高度雄性不育，sbms1具有调控植物雄性育性的功能。[0092]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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