一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒，属于生物技术领域。


背景技术：

[0002][0003]
目前研究发现，相比野生株或其他voc，奥密克戎变异株有更多突变，变异速度快(目前已有ba.1、ba.2、ba.3及ba.1.1四种型别，且国内均已检出)，很可能产生了比delta突变株更强的传染性和免疫逃逸能力，降低了疫苗和中和抗体的效力，且再次感染的风险增加，这对全球疫情防控提出了新挑战。因此快速检测奥密克戎变异株感染，并及时防控成为了亟待解决的问题。但目前主流的检测方法是高通量测序，经济成本高耗时长。同时个别的荧光检测试剂盒通量低，造价高，且操作复杂，需提前检测出新冠病毒阳性，然后用该试剂盒进行专门的奥密克戎变异株检测，基于以上原因很多基层检测单位难以第一时间开展奥密克戎的检测，耽误了宝贵的防控时间及防控策略的制定。
[0004]
目前上市的奥密克戎荧光检测试剂盒针对特定的几个变异位点进行检测，造价昂贵，50人份约10000元，单个标本的试剂成本为200元。此外高通量测序方法造价更高，单个标本的试剂成本为2000元。
[0005]
现有的奥密克戎荧光试剂盒操作复杂。需要先开展sars-cov-2的荧光检测，当sars-cov-2荧光阳性时，再用该试剂盒检测奥密克戎变异位点，当几个变异位点荧光阳性时才可确定该标本为奥密克戎感染，总体检测时间约为4小时。高通量测序时间则长达20小时。
[0006]
中国专利cn202111497771.2提供了基于多重荧光定量arms-pcr技术的新冠病毒奥密克戎突变序列检测技术及其应用，主要基于荧光定量arms-pcr 技术针对目前奥密克戎变异株s基因特异性突变类型，如序列位置23599，序列变化t》g、序列位置23048，序列变化g》a、序列位置23202，序列变化c》a、序列位置22898，序列变化g》a进行单管或多管多重检测。
[0007]
虽然中国专利cn202111497771.2提供了基于多重荧光定量arms-pcr技术检测奥密克戎突变序列的技术方案，但是其也存在如下技术问题：1)其针对 s区的单独的突变位点进行检测，而s区是sars-cov-2突变最活跃的基因区域，奥密克戎的突变速度更是远高于其他变异株，因此当目标位点的核苷酸发生变异时，仅针对单独位点进行检测有可能造成假阴性；2)该专利申请时间为2021 年12月，此时奥密克戎变异株较少，仅有ba.1一个型别，但是截止到2022年 2月10日全球已经出现了ba.1、ba.2、ba.3及ba.1.1四种型别，各个型别之间变异较大，很难保证该技术的有效性；3)需要先使用其他试剂盒检测出 sars-cov-2阳性，然后再利用该试剂盒判断是否为奥密克戎感染，操作繁琐，造价高。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒。
[0009]
本发明的发明人设计了一种针对奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒，可同时检测sars-cov-2的三个基因片段，分别是用于判断 sars-cov-2感染的orf1a/b基因和n基因，及用于判断奥密克戎变异株感染的s 基因。这其中判断sars-cov-2感染的orf1a/b基因和n基因引物为美国疾控中心及英国安格利亚罗斯金大学研究人员所设计，检测奥密克戎变异株感染的s基因引物探针是发明人自行设计的。s-f引物位于全基因组的22976-22996核苷酸位点， s-r引物位于全基因组的23058-23078核苷酸位点，s-probe引物位于全基因组的 22998-23023核苷酸位点。
[0010]
本发明中，针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组，其核苷酸序列如下表所示：
[0011]
名称序列修饰orf1a/b-fggatcaagaatcctttggtgg orf1a/b-rgtcacaaaatcctttaggatttgga orf1a/b-probecatcgtgttgtctgtactgccgttgcc5’fam/bhq1 3’n-fgaccccaaaatcagcgaaat n-rtctggttactgccagttgaatctg n-probeaccccgcattacgtttggtggacc5’vic/bhq1 3’s-factgaaatctatcaggccggt s-rcaacaccataagtgggtcgga s-probeacaaaccttgtaatggtgttgcaggt5’cy5/bhq2 3’[0012]
其中，
[0013]
荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则连接在探针的3’末端。所述检测orf1a/b基因荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。所述检测n基因荧光基团为vic，淬灭基团为bhq1。所述检测s基因荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2。
[0014]
本发明还提供了针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测试剂盒，包括上述针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组。
[0015]
进一步地，所述的试剂盒还包括多重荧光检测试剂，多重荧光检测试剂可以是市场通用的多重荧光检测试剂，如南京诺唯赞生产的hiscript ii u one stepqrt-pcr probe kit试剂。
[0016]
本发明还提供了本发明的引物探针组工作液的制备方法，包括如下步骤：
[0017]
1)将合成的引物探针干粉加无rna酶水配制成10微摩尔/升的工作浓度。
[0018]
2)将用于检测orf1a/b基因、n基因和s基因的引物探针组分别按照上游引物：下游引物：探针的体积比为2:2:1的比例分别配置成三种探针引物混合液；在本发明中上游引物：下游引物：探针所加体积比为400:400:200(μl)。
[0019]
3)最后将三种探针引物混合液等体积混合制备为引物探针工作液。
[0020]
在检测时，通用的多重荧光检测试剂加上本发明的引物探针工作液即可上机检测，并能同时判断sars-cov-2感染及是否奥密克戎变异株感染。
[0021]
本发明的目的通过以下技术方案实现：针对特异的奥密克戎变异株的基因保守序列，设计pcr引物和荧光taqman探针。在常规pcr的基础上添加一条两端标记荧光染料基团的核苷酸探针，其中荧光基团在5’端，淬灭基团在3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时荧光基团被淬灭基团抑制，不产生荧光，当探针结合到靶序列时，上游引物会延伸至该位置，在外切酶作用下探针被水解，荧光基团荧光信号释放并被仪器收集检测，从而提示靶序列的存在。发明人还加入了用于判断sars-cov-2感染的orf1a/b基因及n基因的荧光探针引物序列，从而形成了一个组合，利用荧光pcr技术的实时性、高灵敏性及良好的特异性，在反应结束时甚至结束前便可直观快速的判断sars-cov-2感染及奥密克戎变异株感染。此外s基因荧光基团选择cy5，淬灭基团选择bhq2而不是bhq1，提高了其稳定性和扩增效率。
[0022]
本发明的针对奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒，具有如下技术效果：
[0023]
1.造价低廉。
[0024]
引物合成中仅探针价格稍高，三个基因共6条引物3条探针，每条引物合成仅需几十元，探针为1500元左右，总的合成成本约为5000元左右，以合成最低的1 个od量计算可检测1200个标本，每个标本成本为4元左右。试剂盒为通用多重荧光检测试剂盒，100人份约为800元，每个标本成本为8元左右。因此单个标本总体的试剂成本为12元。目前上市的奥密克戎荧光检测试剂盒针对特定的几个变异位点进行检测，造价昂贵，50人份约10000元，单个标本的试剂成本为200元，是本发明的16倍。此外高通量测序方法造价更高，单个标本的试剂成本为2000元。在本发明中选择的是南京诺唯赞生产的hiscript ii u one step qrt-pcr probekit试剂盒。该试剂盒为100人份，发明人降低原有量的三分之一其结果仍无明显变化，因此100人份试剂盒可检测300个标本，实际成本更低。
[0025]
2.检测时间短，操作简便
[0026]
现有的奥密克戎荧光试剂盒操作复杂。需要先开展sars-cov-2的荧光检测，当sars-cov-2荧光阳性时，再用该试剂盒检测奥密克戎变异位点，当几个变异位点荧光阳性时才可确定该标本为奥密克戎感染，总体检测时间约为4小时。相比于检测奥密克戎变异位点的荧光试剂盒，本发明需要的实验操作更加简便，通用试剂加上本发明的引物探针工作液即可上机检测，并能同时判断sars-cov-2 感染及是否奥密克戎变异株感染，总体检测时间约为1.5小时。高通量测序时间则长达20小时。在结果判断上也一目了然，仅需关注三个通道的循环数(ct值)。简单的操作流程，常规的荧光检测仪器设备，基层单位也可开展。
[0027]
3.灵敏度高，特异性好，可重复性好，且能够应用于环境标本检测
[0028]
本发明是基于目前全球出现的所有奥密克戎基因型的s区序列进行设计的，理论上可检测出所有型别的奥密克戎变异株。在实际应用中，发明人对江苏的所有奥密克戎变异株进行了检测(包括ba.1、ba.2及ba.1.1三种型别)，同时以 alpha(b.1.1.7)变异株及delta(b.1.617.2)变异株作为对照，结果显示其灵敏度及特异性均为100％。在对每周的新冠病毒标本进行复检时，发现与测序结果完全一致，显示出了很好的稳定性与可重复性。此外，最能体现其灵敏度优势的地方就是环境标本的检测。环境标本量大，病毒载量低，给检测工作造成了很大困难。环境标本由于病毒载量低很难开展高通量测序，但目前的形势是有感染者的地方基本都存在环境污染，无法测序就无法提供是否为奥密克戎变异株感染。利用本发明的方法在对环境标本进行检测时可检出奥密克戎变异株感染，检测结果与流行
病学溯源调查结果完全一致，其灵敏度及特异性均为100％。
附图说明
[0029]
图1为alpha变异株b.1.1.7型别患者样本检测结果。
[0030]
图2为delta变异株b.1.617.2型别患者样本检测结果。
[0031]
图3为奥密克戎变异株ba.1型别患者样本检测结果。
[0032]
图4为奥密克戎变异株ba.2型别患者样本检测结果。
[0033]
图5为奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本检测结果。
[0034]
图6为环境标本检测结果1(delta变异株感染)。
[0035]
图7为环境标本检测结果2(奥密克戎变异株感染)。
[0036]
图8为特异性验证结果(流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒)。
[0037]
图9为delta变异株b.1.617.2型别患者样本、奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本及奥密克戎变异株感染环境样本综合比对结果。
具体实施方式
[0038]
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0039]
实施例1
[0040]
1.引物探针的设计：
[0041]
发明人通过搜索并下载2020年至今的关于新冠病毒荧光检测文献，并合成相对应的探针引物进行实验检测，最后在11组orf1a/b及n基因的扩增引物中筛选出扩增效果最好的美国疾控中心设计的orf1a/b基因引物和英国安格利亚罗斯金大学研究人员所设计的n基因引物。
[0042]
发明人自行设计的奥密克戎变异株检测引物则是通过下载所有基因型别(包括ba.1、ba.2、ba.3及ba.1.1四种型别)的奥密克戎序列，对其26个基因片段进行比对分析，最后在s区设计了20对引物探针，在n区设计了10对引物探针。通过ncbi blast在线数据库对上述引物探针进行特异性比对分析。筛选pcr效率高，灵敏度高，特异性好，稳定性好的引物，最终得到1对s区的可用于判断奥密克戎变异株感染的引物及对应的探针序列。同时将其淬灭基团由bh1更换为 bh2提高了其稳定性和扩增效率。
[0043]
表1奥密克戎变异株多重荧光检测引物探针序列
[0044]
[0045][0046]
2.针对奥密克戎变异株的多重荧光检测的试剂盒
[0047]
针对奥密克戎变异株的多重荧光检测的试剂盒，包含上述引物探针组与多重荧光检测试剂，其中多重荧光检测试剂可选择市面目前通用的多重荧光检测试剂，在本发明中发明人选择的是南京诺唯赞生产的hiscriptiiu onestepqrt-pcrprobekit试剂盒。
[0048]
引物探针组配置成引物探针工作液使用，配置方法如下：
[0049]
1)将引物探针合成干粉加无rna酶水配制成10微摩尔/升的工作浓度。
[0050]
2)按照上游引物：下游引物：探针的体积比为2:2:1的比例配置成探针引物混合液，在本发明中所加体积比为400:400:200(μl)。
[0051]
3)最后将三种混合液等体积混合制备为引物探针工作液。
[0052]
在检测时，通用的多重荧光检测试剂加上配置好的引物探针工作液即可上机检测，并能同时判断sars-cov-2感染及是否奥密克戎变异株感染。
[0053]
3.检测过程如下：
[0054]
3.1体系配制
[0055]
在体系配制室进行实验体系配制。可选择市面目前通用的多重荧光检测试剂盒，在本发明中发明人选择的是南京诺唯赞生产的hiscriptiiu onestepqrt-pcrprobekit试剂盒。体系配制如表2所示：
[0056]
表2pcr反应体系
[0057][0058]
[0059]
体系配制完成后震荡混匀离心，按照10μl/人份分装至pcr反应管。
[0060]
3.2样本处理
[0061]
在加样室向上述准备好的pcr反应管中加入待测样本核酸、阳性对照及阴性对照各2.5μl，终体积为12.5μl，盖紧管盖，震荡离心。其中样本为发明人实验室所拥有的新冠病毒核酸，型别有奥密克戎变异株ba.1、ba.2及ba.1.1三种型别，其他型别包括alpha变异株b.1.1.7型及delta变异株b.1.617.2型，来源有患者标本及外环境标本。此外还包括用于特异性检测的流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒等核酸样本。阳性对照为测序成功的奥密克戎变异株ba.1核酸。阴性对照为无rna酶水。
[0062]
3.3 pcr扩增
[0063]
将pcr反应管放入abi quantstudio q5荧光定量pcr仪进行扩增检测，不选择rox校正。荧光基团分别为fam、vic及cy5。循环参数设定如表3所示:
[0064]
表3反应程序
[0065][0066]
3.4.结果分析
[0067]
阴性对照无荧光曲线，阳性对照出现三条平滑曲线。标本荧光曲线平滑且循环数(ct值)小于38判定为阳性，否则为阴性。当fam和vic仅有一种是ct≤38 时，无论cy5是否ct≤38均需进行复测。具体判定结果如表4所示：
[0068]
表4结果判定
[0069][0070][0071]
(1)alpha变异株b.1.1.7型别患者样本检测结果，fam和vic通道出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，但不是奥密克戎变异株。见图1
[0072]
(2)delta变异株b.1.617.2型别患者样本检测结果，fam和vic通道出现曲线且ct
≤38，表明为sars-cov-2感染，但不是奥密克戎变异株。见图2
[0073]
(3)奥密克戎变异株ba.1型别患者样本检测结果，fam、vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图3
[0074]
(4)奥密克戎变异株ba.2型别患者样本检测结果，fam、vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图4
[0075]
(5)奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本检测结果，fam、vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图5
[0076]
(6)环境标本检测结果1(delta变异株感染)，fam和vic通道出现曲线且 ct≤38，表明为sars-cov-2感染，但不是奥密克戎变异株。见图6
[0077]
(7)环境标本检测结果2(奥密克戎变异株感染)，fam、vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图7
[0078]
(8)特异性验证(流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒)，fam、 vic及cy5通道均无曲线，表明本发明引物组合不与其他病毒核酸发生反应。见图8
[0079]
(9)delta变异株b.1.617.2型别患者样本、奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本及奥密克戎变异株感染环境样本综合比对结果，delta变异株b.1.617.2型别患者样本fam和vic通道出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染；奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本及奥密克戎变异株感染环境样本fam、vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图9
[0080]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。