一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用的制作方法

一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用
(一)技术领域
1.本发明属于转基因植物新品种培育领域，具体涉及同时高效表达两种抗虫基因和一种耐草甘膦基因的表达载体及其在培育抗虫耐草甘膦的植物细胞、植物方面的应用。
(二)

背景技术：

2.全球人口迅速增长带动了粮食需求的大量增加。事实上，通过常规的品种改良和栽培技术改进，特别是杀虫剂的使用，粮食生产在过去几十年已经明显提高。上世纪60年代兴起的细胞遗传学和细胞生物学技术引发了“绿色革命”，使粮食作物的产量显著提高、抗病性和抗虫性明显增强。然而，这些技术的广泛采用也同时给环境和人类健康带来一些新的问题，如农药和化肥的使用导致土壤侵蚀加剧。同时，在这些技术使用20年后，对粮食增产的贡献也明显减少。为克服这些问题，来自于政府、大学、研究机构及公司的科学家们正在寻求新的技术和方法。随着dna技术的迅速发展，到上世纪80年代科学家们已经开发出一些新的现代育种技术和方法，其中利用农杆菌介导转化和基因枪转化的转基因技术是最为成功的一项。
3.随着生物技术的发展以及各国对生物技术领域投入的加大，使得全球育种家和生物技术研究机构能够突破传统的育种框架和育种年限来培育新的植物品种。1995年美国批准了转基因抗虫棉的商业化种植批准，1996年转基因抗虫棉开始推广，中国也在1996年开始引入转基因抗虫棉。2019年-2021年，我国陆续首次审批了抗虫耐除草剂玉米和大豆的农业转基因生物安全证书，标志着我国转基因生物育种技术进入加速期。另外，草地贪夜蛾作为一种杂食性害虫已经于2018-2019年从云南入侵我国，这种害虫危害性大、耐药性强，目前已经对我国的玉米等作物造成严重危害，通过生物育种的方法来防治草地贪夜蛾等害虫迫在眉睫。
4.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)是一种常见的革兰氏阳性土壤微生物，它能产生一种对特定生物具有高度选择性的杀虫蛋白。对bt蛋白已进行了数十年安全性试验证实，它对人类和动物不具毒性。cry1ab基因是从苏云金芽孢杆菌hd-1菌株克隆得到的，其表达产物cry1ab蛋白在鳞翅目害虫中具有广谱的杀虫活性(hfte h and whiteley h r.microbiological reviews,1989,53(2):242-255.；van frankenhuyzen k.j invertebr pathol.2009,101(1):1-16)。截至2012年1月，共有近70种cry2蛋白被鉴定出来，涵盖了从cry2aa至cry2ai共9小类，并以cry2ae类占绝大多数，cry2ae蛋白仅对鳞翅目昆虫有毒杀作用，且cry2ae对美洲棉铃虫的毒力要高于cry2aa(zheng a et al.ann.microbiol.2010,60(1):129-134)。虽然cry2蛋白分子量比cry1小，但相对cry1毒素而言，cry2对鳞翅目的杀虫范围更广，与cry1之间存在不对称交叉抗性，在农业害虫防治方面具有更大的应用前景。近年来，以转cry2ae单价基因或cry2ae cry1ac双价基因为主的第二代转基因植物正逐渐取代以转cry1a类基因为主的第一代转基因植物以缓和目标害虫对抗虫植物的适应以及抗性风险等问题，如转基因棉花bollgard ii(tabashnik b e et al.appl.environ.microbiol.2002,68(8):3790-3794.)。cry1ab与cry2ae蛋白功能区域的
氨基酸相似度极低，仅为17.9％。因此，二者的杀虫谱差异很大，也不容易产生交付抗性，非常适合联合使用。
5.杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
6.目前，通过转基因的方法让植物耐受草甘膦是应用最广泛的杂草解决方案。草甘膦，化学名称为n-(磷酸甲基)甘氨酸，是一种有机膦类除草剂，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，拥有40多年的长期安全使用记录。可以通过在植物中表达cp4(来源于农杆菌cp4菌株，编码cp4epsps蛋白)(padgette,s r et al.1996.pages 53-84in herbicide-resistant crops)等epsps基因和gat(来源于土壤微生物宏基因组的草甘磷n-乙酰转移酶的基因)等能表达降解草甘膦的酶的基因赋予植物耐草甘膦的性状。
7.让植物同时表达多种目的蛋白的方法主要包括多表达框分子克隆堆积法、杂交堆积法、基因融合法，其中多表达框分子克隆堆积法以其具备的稳定性好、可预见性强和后期植物转育容易等优势被广泛使用。而多表达框堆积策略的效果受诸多因素的影响，包括基因的选择、编码序列的选择、每个表达框包括启动子、终止子等在内的调控元件的选择、各读码框的排列等。这些因素都会对目的基因的表达水平、表达模式已经不同代次间的稳定性特别是高代次的基因沉默情况有不同的影响。因此一个能高效稳定的表达多个目的基因的表达载体需要经过严格的探索与测试，而这种载体对获得稳定高效的转基因作物起到决定性作用。
(三)

技术实现要素：

8.本发明目的是提供一种同时稳定高效表达抗虫基因(cry1ab、cry2ae)和耐草甘膦基因(cp4基因)的双元载体，及其在制备抗虫耐草甘膦植物细胞、农作物方面的应用，使相应的转基因作物具有更广的杀虫谱，同时延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性，且同时耐草甘膦。
9.本发明采用的技术方案是：
10.本发明提供一种同时稳定高效表达抗虫基因和耐除草剂草甘膦基因的表达载体，所述的表达载体含有抗虫基因cry1ab、抗虫基因cry2ae和耐草甘膦基因cp4。
11.进一步，本发明所述抗虫基因cry1ab编码的氨基酸序列如seq id no：2所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为seq id no：1所示；本发明所述抗虫基因cry2ae编码的氨基酸序列如seq id no：4所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为seq id no：3所示；本发明所述耐草甘膦基因cp4编码的氨基酸序列如seq id no：6所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为seq id no：5所示。
12.seq id no：1cry1ab基因
13.atggacaacaacccgaacatcaacgagtgcatcccgtacaactgcctctccaacccggaggtggaggtgctcggcggcgagcgcatcgagaccggctacaccccgatcgacatctccctctccctcacccagttcctcctctccgagttcgtgccgggcgccggcttcgtgctcggcctcgtggacatcatctggggcatcttcggcccgtcccagtgggacgccttcctcgtgcagatcgagcagctcatcaaccagcgcatcgaggagttcgcccgcaaccaggccatctcccgcctggagggcctctccaacctctaccagatctacgccgagtccttccgcgagtgggaggccgacccgaccaacccg
gccctccgcgaggagatgcgcatccagttcaacgacatgaactccgccctcaccaccgccatcccgctcttcgccgtgcagaactaccaggtgccgctcctctccgtgtacgtgcaggccgccaacctccacctctccgtgctccgcgacgtgtccgtgttcggccagcgctggggcttcgacgccgccaccatcaactcccgctacaacgacctcacccgcctcatcggcaactacaccgaccacgccgtgcgctggtacaacaccggcctggagcgcgtgtggggcccggactcccgcgactggatcaggtacaaccagttccgccgcgagctcaccctcaccgtgctcgacatcgtgtccctcttcccgaactacgactcccgcacctacccgatccgcaccgtgtcccagctcacccgcgagatctacaccaacccggtgctggagaacttcgacggctccttccgcggctccgcccagggcatcgagggctccatccgctccccgcacctcatggacatcctcaactccatcaccatctacaccgacgcccaccgcggcgagtactactggtccggccaccagatcatggcctccccggtgggcttctccggcccggagttcaccttcccgctctacggcacgatgggcaacgccgccccgcagcagcgcatcgtggcccagctcggccagggcgtgtaccgcaccctctcctccaccctctaccgccgcccgttcaacatcggcatcaacaaccagcagctctccgtgctcgacggcaccgagttcgcctacggcacctcctccaacctcccgtccgccgtgtaccgcaagtccggcaccgtggactccctcgacgagatcccgccgcagaacaacaacgtgccgccgcgccagggcttctcccaccgcctctcccacgtgtccatgttccgctccggcttctccaactcctccgtgtccatcatccgcgccccgatgttctcctggattcaccgctccgccgagttcaacaacatcatcccgtcctcccagatcacccagatcccgctcaccaagtccaccaacctcggctccggcacctccgtggtgaagggcccgggcttcaccggcggcgacatcctccgccgcacctccccgggccagatctccaccctccgcgtgaacatcaccgccccgctctcccagcgctaccgcgtgcgcatccgctacgcctccaccaccaacctccagttccacacctccatcgacggccgcccgatcaaccagggcaacttctccgccaccatgtcctccggctccaacctccagtccggctccttccgcaccgtgggcttcaccaccccgttcaacttctccaacggctcctccgtgttcaccctctccgcccacgtgttcaactccggcaacgaggtgtacatcgaccgcatcgagttcgtgccggccgaggtgaccttcgaggccgagtacgacctggagcgcgcccagaaggccgtgaacgagctcttcacctcctccaaccagatcggcctcaagaccgacgtgaccgactaccacatcgaccaggtgtccaacctcgtggagtgcctctccgacgag。
14.seq id no：3cry2ae基因
15.atgaacaacgtgctcaacaacggccgcaccaccatctgcgacgcctacaacgtggtggcccacgacccgttctccttcgagcacaagtccctcgacaccatccgcaaggagtggatggagtggaagcgcaccgaccactccctctacgtggccccgatcgtgggcaccgtgtcctccttcctcctcaagaaggtgggctccctcatcggcaagcgcatcctctccgagctctggggcctcatcttcccgtccggctccaccaacctcatgcaggacatcctccgcgagaccgagcagttcctcaaccagcgcctcaacaccgacaccctcgcccgcgtgaacgccgagctggagggcctccaggccaacatccgcgagttcaaccagcaggtggacaacttcctcaacccgacccagaacccggtgccgctctccatcacctcctccgtgaacaccatgcagcagctcttcctcaaccgcctcccgcagttccgcgtgcagggctaccagctcctcctcctcccgctcttcgcccaggccgccaacatgcacctctccttcatccgcgacgtggtgctcaacgccgacgagtggggcatctccgccgccaccctccgcacctaccagaactacctcaagaactacaccaccgagtactccaactactgcatcaacacctaccagaccgccttccgcggcctcaacacccgcctccacgacatgctggagttccgcacctacatgttcctcaacgtgttcgagtacgtgtccatctggtccctcttcaagtaccagtccctcctcgtgtcctccggcgccaacctctacgcctccggctccggcccgcagcagacccagtccttcacctcccaggactggccgttcctctactccctcttccaggtgaactccaactacgtgctcaacggcttctccggcgcccgcctcacccagaccttcccgaacatcggcggcctcccgggcaccaccaccacccacgccctcctcgccgcccgcgtgaactactccggcggcgtgtcctccggcgacatcggcgccgtgttcaaccagaacttctcctgctccaccttcctcccgccgctcctcaccccgttcgtgcgctcctggctcgactccggctccgaccgcggcggcgtgaacaccgtgaccaactggcagaccgagtccttcgagtccaccctcggcct
ccgctgcggcgccttcaccgcccgcggcaactccaactacttcccggactacttcatccgcaacatctccggcgtgccgctcgtggtgcgcaacgaggacctccgccgcccgctccactacaacgagatccgcaacatcgagtccccgtccggcaccccgggcggcctccgcgcctacatggtgtccgtgcacaaccgcaagaacaacatctacgccgtgcacgagaacggcaccatgatccacctcgccccggaggactacaccggcttcaccatctccccgatccacgccacccaggtgaacaaccagacccgcaccttcatctccgagaagttcggcaaccagggcgactccctccgcttcgagcagtccaacaccaccgcccgctacaccctccgcggcaacggcaactcctacaacctctacctccgcgtgtcctccctcggcaactccaccatccgcgtgaccatcaacggccgcgtgtacaccgcctccaacgtgaacaccaccaccaacaacgacggcgtgaacgacaacggcgcccgcttcctcgacatcaacatgggcaacgtggtggcctccgacaacaccaacgtgccgctcgacatcaacgtgaccttcaactccggcacccagttcgagctcatgaacatcatgttcgtgccgaccaacctcccgccgatctac。
16.seq id no：5cp4基因
17.atgctacacggtgcaagcagccggccggcaaccgctcgcaaatcttccggcctttcgggaacggtcaggattccgggcgataagtccatatcccaccggtcgttcatgttcggcggtcttgccagcggtgagacgcgcatcacgggcctgcttgaaggtgaggacgtgatcaataccgggaaggccatgcaggctatgggagcgcgtatccgcaaggaaggtgacacatggatcattgacggcgttgggaatggcggtctgctcgcccctgaggcccctctcgacttcggcaatgcggcgacgggctgcaggctcactatgggactggtcggggtgtacgacttcgatagcacgttcatcggagacgcctcgctcacaaagcgcccaatgggccgcgttctgaacccgttgcgcgagatgggcgtacaggtcaaatccgaggatggtgaccgtttgcccgttacgctgcgcgggccgaagacgcctaccccgattacctaccgcgtgccaatggcatccgcccaggtcaagtcagccgtgctcctcgccggactgaacactccgggcatcaccacggtgatcgagcccatcatgaccagggatcataccgaaaagatgcttcaggggtttggcgccaacctgacggtcgagacggacgctgacggcgtcaggaccatccgccttgagggcaggggtaaactgactggccaagtcatcgatgttccgggagacccgtcgtccacggccttcccgttggttgcggcgctgctcgtgccggggagtgacgtgaccatcctgaacgtcctcatgaacccgaccaggaccggcctgatcctcacgcttcaggagatgggagccgacatcgaggtgatcaacccgcgcctggcaggcggtgaagacgttgcggatctgcgcgtgcgctcctctaccctgaagggcgtgacggtcccggaagatcgcgcgccgtccatgatagacgagtatcctattctggccgtcgccgctgcgttcgccgaaggggccacggtcatgaacggtcttgaggaactccgcgtgaaggaatcggatcgcctgtcggcggtggccaatggcctgaagctcaacggtgttgactgcgacgagggtgagacctcactcgtggtccgtggccggcctgatggcaagggcctcggcaacgccagtggagcggccgtcgccacgcacctcgatcatcgcatcgcgatgtccttcttggtgatgggtctcgtctcagagaacccggtgaccgtcgatgacgccacgatgatagcgacgagcttcccagagttcatggatctgatggcgggcctcggggccaagatcgaactgtctgacacgaaggccgcttga。
18.本发明所述表达载体是将两个同源性非常低的抗虫蛋白编码基因cry1ab、cry2ae和耐草甘膦基因cp4构建到同一个植物表达载体中，使相应的转基因作物具有更广的杀虫谱，同时延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性，且同时耐草甘膦。该载体可以将以上三个基因同时转入受体植物，使植物具有抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等主要鳞翅目害虫和抗草甘膦除草剂的特性。cry1ab对草地贪夜蛾、玉米螟和其他鳞翅目害虫都有很好的杀灭效果，结合cry2ae对棉铃虫等鳞翅目出色的杀灭效果，可以非常高效的解决作物主要鳞翅目害虫的防治问题。特别是近几年草地贪夜蛾已经从云南入侵我国，本载体赋予植物的性状对有效控制草地贪夜蛾也非常关键。
19.耐草甘膦基因包括对草甘膦不敏感的epsps基因和对草甘膦具有解毒作用的乙酰
转移酶基因。耐草甘膦基因在作为选择标记的同时也可以赋予植物耐草甘膦的性状，可选的，也可以通过过表达其它耐除草剂基因来实现上述功能，如耐草铵膦基因(bar/pat)(wehrmann a et al.nat biotechnol.1996,14(10):1274-8)、耐烟嘧磺隆基因(cyp81a9)(liu x.et al.theor appl genet.2019,132(5):1351-1361.)等。
20.本发明所述表达载体包含启动子，所述启动子包括玉米泛素启动子、camv35s启动子与玉米actin2的第二个内含子组成的复合启动子p35s-intron，也可以是其他强组成型启动子，比如水稻的泛素启动子(wang j,oard j h.plant cell reports,2003.)，木薯的veinmosaicvirus(csvmv)启动子、austranlianbananastreakvirus(bsv)启动子、mirabilismosaicvirus(mmv)启动子等。另外，还可以通过在使用增强子和内含子等元件来增强目标基因的表达，比如使用烟草的mar(matrix attachment regions)序列(dolgova as,dolgov sv.biotech.2019,9(5):176.)、水稻actin基因的内含子(oszvald m et al.biotechnology and bioprocess engineering,2007,12(6):676-683.)、玉米hsp70基因的内含子等(brown s m，santino c g.ca2108000a1.1993.)。所述玉米泛素启动子pzmubi核苷酸序列如seq id no：11所示，所述复合启动子p35s-intron核苷酸序列如seq id no：7所示，其中，p35s的序列如seq id no：7中第1bp-787bp所示，玉米actin2基因第二个内含子序列如seq id no：7中第787bp-905bp所示。本发明还提供了另外一种p35s-intron2复合启动子，从5’端至3’依次为p35s启动子和玉米hsp70基因第一个内含子序列，p35s启动子的核苷酸序列为seq id no：7中第1bp-787bp所示，玉米hsp70的第一个内含子的核苷酸序列如seq id no：12所示。
21.seq id no：7p35s-intron
22.atggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagaccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctcgaggttggttctgctgtccggttgtcaatcctttagctaccatacatgtgtttcagttttcttttgcctgtttattcatttctgatttaataaactgatgggattttgatgccaaacacag
23.本发明所述表达载体还包括终止子，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。所述终止子包括根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子tnos(核苷酸序列如seq id no：9所示)、camv35s终止子t35s。
24.进一步，本发明所述表达载体还包括用于增强cry2ae基因表达的叶绿体信号肽序列，所述信号肽包括玉米epsps基因的叶绿体信号肽序列(核苷酸序列如seq id no：10所示)或水稻epsps基因的叶绿体信号肽序列(核苷酸序列如seq id no：8所示)。
25.seq id no：8水稻epsps基因叶绿体信号肽
26.atggcggcgaccatggcgtccaacgctgcggctgcggctgcggtgtccctggaccaggccgtggctgcgtcggcagcgttctcgtcgcggaagcagctgcggctgcctgccgcagcgcgcggagggatgcgggtgcgggtgcgggcgcggggtcggcgggaggcggtggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggctgag
27.seq id no：9tnos终止子
28.cccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc
29.seq id no：10玉米epsps基因叶绿体信号肽序列
30.atggcggccatggcgaccaaggccgccgcgggcaccgtgtcgctggacctcgccgcgccgtcgcgccgccaccaccgcccgagctcggcgcgcccgcccgcccgccccgccgtccgcgggctgcgggcgcctgggcgccgcgtgatcgccgcgccgccggcggcggcagcggcggcggcggtgcaggcgggtgccgag
31.seq id no：11玉米pubi
32.ctacagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagct
atatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcag
33.更进一步，所述表达载体包含启动抗虫基因cry1ab表达的玉米泛素启动子(zmubipromoter)pzmubi，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子tnos；启动抗虫基因cry2ae表达的玉米泛素启动子(zmubipromoter)pzmubi，玉米epsps基因的叶绿体信号肽，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子tnos；启动耐草甘膦基因cp4表达的camv35s启动子与玉米actin2的第二个内含子组成的复合启动子p35s-intron，水稻epsps基因的叶绿体信号肽，终止该基因表达的camv35s终止子t35s。
34.进一步，本发明所述表达载体还包括用于提高抗虫基因或抗除草剂基因的表达的基质附着区序列，所述基质附着区序列为烟草mar序列，其核苷酸序列为seq id no：13所示，通过在表达载体目的基因表达框启动子的5’端或者终止子的3’端增加基质附着区序列(mar)来进一步提高抗虫基因或抗除草剂基因的表达。
35.本发明中用于提供表达载体骨架的基础载体可以是pcambia系列载体(cambia,canberra,aus tralia)或者其它载体，优选pcambia 1300载体。
36.本发明所述表达载体包括启动子-cry2ae基因-启动子-cry1ab基因-启动子-cp4基因；或者mar-启动子-cry2ae基因-启动子-cry1ab基因-启动子-cp4基因。
37.本发明还提供一种所述表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述的应用是将所述的表达载体(1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae或1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae)电击转化农杆菌eha105，获得含有表达载体的农杆菌菌株，用农杆菌菌液侵染植物，获得含表达载体的植物细胞。
38.本发明还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因t-dna的植物细胞，在植物转基因细胞培养中将耐草甘膦基因cp4作为筛选标记。
39.本发明同时还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因t-dna的转基因植物。
40.本发明进一步提供了利用所述载体获得同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因的植物细胞或者植物的方法，该方法可以是农杆菌介导转化法、基因枪法、原生质体侵染法或者其他植物遗传转化方法，优选农杆菌介导转化法。
41.本发明构建的表达载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括：玉米、水稻等；双子叶植物包括：大豆、油菜、棉花等。
42.本发明所述转基因植物具有鳞翅目害虫抗性，包括草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等。
43.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明在cry2ae基因前面加了叶绿体信号肽序列，一方面增加了cry2ae蛋白的表达量，增加幅度为20％-100％；另一方面，降低了高表达量的cry2ae蛋白对植物生长发育造成的干扰。同时，本发明载体同时表达cry1ab、cry2ae和cp4蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，扩宽了转基因作物的抗虫范围，特别的对入侵我国的草地贪夜蛾有非常好的抗性，而且还有效地延缓了害虫抗性的产生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力，这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，能更好满足大规模农业生产的需求。
(四)附图说明
44.图1：同时表达cry1ab、cry2ae和cp4基因的载体t-dna结构示意图。
45.pzmubi表示玉米泛素启动子；ctp1和ctp2分别表示不同的叶绿体信号肽；p35s-intron表示camv35s启动子和植物基因内含子组成的复合启动子；cry2ae表示cry2ae基因和终止子；cry1ab表示cry1ab基因和终止子；cp4表示cp4-epsps基因和终止子。
46.图2：增加mar调控序列且同时表达cry1ab、cry2ae和cp4基因的载体t-dna结构示意图。
47.mar表示植物基质附着区(matrix attachment regions)序列，具有稳定和增强基因表达的功能；pzmubi表示玉米泛素启动子；ctp1和ctp2分别表示不同的叶绿体信号肽；p35s-intron表示camv35s启动子和植物基因内含子组成的复合启动子；cry2ae表示cry2ae基因和终止子；cry1ab表示cry1ab基因和终止子；cp4表示cp4-epsps基因和终止子。
(五)具体实施方式
48.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
49.在不背离本发明实质的情况下，对本发明的步骤、方法或者条件进行修改或者替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
50.实施例1、启动子的选择
51.为了获得一个比p35s更好的启动子，我们通过在p35s启动子的3’融合一段玉米actin2基因第二个内含子来提高表达效率，具体如下：
52.1、t-dna载体构建：
53.(1)含复合启动子p35s-intron的t-dna载体构建
54.人工合成从5’端到3’依次为水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列(oscpt)和耐草甘膦基因cp4(经过密码子优化)的核苷酸序列oscpt-cp4，其中水稻epsps基因叶绿体信号肽序列如seq id no：8所示，密码子优化后cp4基因核苷酸序列如seq id no：5所示。
55.以玉米基因组(b73)为模板，通过pcr克隆玉米actin2基因第二个内含子片段zmactin2-intron(i-f:5
’‑
ctctctcgaggttggttctgctgtccggttgtc；i-r:5
’‑
catggtggcagatctgtgtttggcatcaaaatc)，其核苷酸序列如seq id no：7中第788bp-905bp所示；
56.以人工合成的从5’端至3’端依次包含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列(osctp)和cp4基因的核苷酸序列oscpt-cp4为模板，通过pcr克隆osctp-cp4(引物为cp4-f:5
’‑
gatgccaaacacagatctgccaccatggcggcgac；cp4-r:5
’‑
ggagcctcgagttatcaagcggccttcgtgtcagac)；
57.以上述pcr产物zmactin2-intron和zmctp-cp4为模板，通过pcr克隆actin2-intron-osct p-cp4片段(i-f:5
’‑
ctctctcgaggttggttctgctgtccggttgtc；cp4-r:5
’‑
ggagcctcgagttatcaagcggccttcgtgtcagac)，序列5’端和3’端分别设置一个xhoi位点。
58.用限制性内切酶xhoi对pcambia1300载体进行酶切，同时用fastap对该载体进行去磷酸化处理，防止自连；同样用xhoi对上述pcr获得的核苷酸片段actin2-intron-osctp-cp4进行酶切。然后，将上述酶切后的载体和片段连接后获得载体1300-p35s-intron-cp4。
启动子p35s为pcambia1300载体上自带片段，其核苷酸序列如seq id no：7中第1bp-787bp所示(即pcambia1300载体上(ncbi序列号：af234296)8714bp-7934bp所示。
59.(2)含p35s启动子的t-dna载体构建
60.作为对照，以上述人工合成的包含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列(osctp)和cp4基因的核苷酸片段oscpt-cp4为模板，通过pcr克隆osctp-cp4片段(引物为cp4-f2:5
’‑
tctctcgagaccatggcggcgaccatggcgtcc；cp4-r:5
’‑
ggagcctcgagttatcaagcggccttcgtgtcagac)，序列5’端和3’端分别设置一个xhoi位点。用限制性内切酶xhoi对pcambia1300载体进行酶切，同时用fastap对该载体进行去磷酸化处理，防止自连；用xhoi对上述pcr获得的核苷酸片段osctp-cp4，将酶切后的osctp-cp4片段与pcambia1300载体载体进行连接，获得载体1300-p35s-cp4。
61.3、t-dna载体转化农杆菌
62.将步骤2获得的t-dna载体(1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4)电击转化农杆菌eha105，采用kan进行筛选，获得含有t-dna载体的农杆菌菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，用于转基因作物侵染。
63.4、水稻转化：
64.转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙.生命科学.1998,10:125-131；刘凡等.分子植物育种.2003,1:108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。
65.分别取步骤3中构建的含有t-dna载体(1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4)的农杆菌划板。挑单菌落接种至培养基，28℃培养至od600为0.6，获得农杆菌菌液，作为转化用农杆菌。培养基组成：3g/l k2hpo4、1g/lnah2po4、1g/lnh4cl、0.3g/l mgso4·
7h2o、0.15g/l kcl、0.01g/l cacl2、0.0025g/l feso4·
7h2o、5g/l蔗糖、20mg/l乙酰丁香酮，溶剂为水，ph＝5.8。
66.将待转化的愈伤组织放入od600为0.6的农杆菌菌液中培养，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(ms 2mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 30g/l葡萄糖 30g/l蔗糖 3g/l琼脂(sigma 7921) 20mg/l乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤组织，转移到筛选培养基(ms 2mg/l 2,4-d 30g/l蔗糖 3g/l琼脂(sigma7921) 20mg/l乙酰丁香酮 2mm草甘膦(sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(ms 0.1g/l肌醇 5mg/l脱落酸(aba) 1mg/l萘乙酸(naa) 5mg/l 6-苄基腺嘌呤(6-ba) 20g/l山梨醇 30g/l蔗糖 2.5g/l植物凝胶(gelrite))上，28℃培养20天，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2ms 0.2mg/l naa 20g/l蔗糖 2.5g/l gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室。将含有载体1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4的转基因水稻植株分别命名为icp和cp。
67.5、目的基因cp4表达量分析：
68.分别选取不同代次，各20株长势良好且通过分子生物学鉴定为单拷贝的icp和cp转基因水稻植株叶片，通过elisa的方法对获得的转基因水稻叶片中cp4的表达量进行分析。elisa测定使用上海佑隆生物科技有限公司的检测试剂盒进行(货号：aa0841)。实验方
no：10所示，tnos终止子核苷酸序列如seq id no：9所示。
85.以人工合成的zmctp-cry2ae-tnos片段为模板，通过pcr克隆序列zmctp-cry2ae-tnos(引物为2ab-f:5
’‑
tttaggatccaccatggcggccatggcgaccaag；2ab-r:5
’‑
cccggctggtaccgatctagtaacatagatgacacc)，序列5’端和3’端分别设置一个bamhi位点和kpni位点。
86.以玉米基因组(b73)为模板，通过pcr克隆玉米ubi启动子pzmubi(引物为ubi-f2:5
’‑
cagtgccaagcttctacagtgcagcgtgacccggtc；引物为ubi-r2:5
’‑
atggtggatccctgcagaagtaacaccaaacaacagggt)，核苷酸序列如seq id no：11所示。启动子5’端和3’端分别设置一个hindiii位点和bamhi位点。pcr克隆获得的核苷酸序片段记为pzmubi2。
87.用限制性内切酶hindiii和bamhi对pcambia1300载体进行双酶切；用hindiii和bamhi对pcr克隆的玉米ubi启动子pzmubi2进行双酶切；用bamhi和kpni对pcr克隆的zmctp-cry2ae-tnos段进行双酶切。回收上述载体和两个片段，将上述载体和片段进行三段连接后获得终载体1300-pzmubi2-zmctp-cry2ae。
88.作为对照，以人工合成的zmctp-cry2ae-tnos片段为模板，通过pcr克隆序列cry2ae-tnos(引物为2ab-f:5
’‑
ctgcagggatccaccatgaacaacgtgctcaacaac；2ab-r:5
’‑
cccggctggtaccgatctagtaacatagatgacacc)，序列5’端和3’端分别设置一个bamhi位点和kpni位点。通过上述相同的方法，将cry2ae-tnos和pzmubi2酶切产物连入pcambia1300载体中，获得终载体1300-pzmubi2-cry2ae。
89.将获得的t-dna载体(1300-pzmubi2-zmctp-cry2ae和1300-pzmubi2-cry2ae)电击转化农杆菌eha105，采用kan筛选，获得含有t-dna载体的农杆菌菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，用于转基因作物侵染。
90.2、水稻转化
91.转化方法与实施例1中方法一致，除了将筛选培养基中的草甘膦替换为50mg/l的潮霉素(hyg)。获得含载体1300-pzmubi2-zmctp-cry2ae和1300-pzmubi2-cry2ae的转基因水稻植株，分别命名为ctp2ae和2ae。
92.3、目的基因表达量分析
93.分别选取不同代次，各20株长势良好且通过分子生物学鉴定为单拷贝的ctp2ae和2ae转基因水稻植株叶片，通过elisa的方法对获得的转基因水稻中的cry2ae表达量进行分析。elisa测定使用检测试剂盒进行(envirologix公司，货号：ap-005-ct nw v10)。实验方法参照试剂盒的说明书进行，具体步骤如下所述：
94.(1)将标样浓度稀释为2.5ppb、1.25ppb、0.625ppb、0.3125ppb，作为标准样品；
95.(2)向酶联板的每个孔中加入不同浓度标准样品各100μl，用parafilm膜封住酶联板孔，室温下在水平振荡仪上慢速遮光孵育45min，注意避免孔中液体洒出或溅到封口膜上；
96.(3)孵育完毕后，迅速倒出孔中的液体，每孔用250μl washing buffer(pbst buffer)彻底洗3次，将板在吸水纸上甩干；
97.(4)向每个孔中加入100μl酶标液并摇匀，用parafilm膜封住酶联板，室温下在水平振荡仪上慢速遮光孵育45min；
98.(5)孵育完毕后，迅速倒出孔中的液体，每孔用250μl washing buffer(pbst buffer)彻底洗3次，将板在吸水纸上甩干；
99.(6)向孔中加入100μl substrate并摇匀，用parafilm膜封住酶联板，孵育15-30min，其间可以观察到孔中的溶液由无色逐渐转变为蓝色；
100.(7)向孔中加入100μl终止液并混匀，溶液由蓝色转变为黄色，30min内在酶标仪中测定od450值。根据标样的od450值，以标准品吸光度值为纵坐标，以cry2ae标准品浓度(ppb)为横坐标，绘制标准曲线图。为了排除每次测定之间的系统误差，每次测定样品都同时制作标准曲线。本次测试的标准曲线公式是：y＝0.701x 0.089(r2＝0.9926)。
101.将不同代次的转基因水稻植株叶片，粗提取的蛋白样品进行适当稀释(如200-500倍)，若样品od450值处于标样od450范围之外，重新稀释样品并重新检测；若样品od450值处于标样od450范围之内，将样本的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，即可计算出样品中目的蛋白的浓度，结果见表2。
102.cry2ae蛋白含量(μg/g)＝样本浓度(ppb)*稀释倍数*样品提取液体积(μl)/叶片质量(mg)/1000
103.表2：zmctp介导靶标基因表达水平分析
[0104][0105]
备注：ctp2ae代表载体1300-pzmubi-zmctp-cry2ae的转基因植株，2ae代表载体1300-pzmubi2-cry2ae的转基因植株。表中数据代表20个独立转基因材料的表达量的平均数
±
标准差。**表示通过t.test检验，在0.1％的显著水平上与对照相存在显著差异。
[0106]
测试结果表明，通过转化载体1300-pzmubi2-zmctp-cry2ae获得的转基因水稻植株叶片中cry2ae的表达量显著高于通过转化载体1300-pzmubi2-cry2ae获得的转基因水稻植株叶片中cry2ae的表达量。因此，我们认为玉米epsps叶绿体信号肽zmctp可以有效提高目的蛋白cry2ae基因在水稻等植株中高表达。因此我们在后续表达载体构建中增加zmctp。
[0107]
实施例3、含抗虫蛋白编码基因cry1ab、cry2ae和耐草甘膦基因cp4的表达载体构建
[0108]
为了构建同时高效表达cry1ab、cry2ae和cp4基因的载体，之前已经人工合成从5’端到3’依次为水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列(oscpt)和耐草甘膦基因cp4(经过密码子优化)的核苷酸序列oscpt-cp4；人工合成的从5’端至3’依次为玉米epsps基因叶绿体信号肽编码序列(zmctp)、cry2ae基因的核苷酸序列和tnos终止子序列的核苷酸序列zmctp-cry2ae-tnos。另外，人工合成从5’端到3’依次为cry1ab基因核苷酸序列和tnos终止子序列的核苷酸片段cry1ab-tnos，其中cry1ab基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，tnos终止子核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0109]
1、构建耐草甘膦基因cp4表达框：
[0110]
同实施例1中t-dna载体1300-p35s-intron-cp4。
[0111]
2、构建抗虫基因cry1ab表达框：
[0112]
以人工合成的从5’端至3’依次为cry1ab基因和tnos终止子的核苷酸片段为模板，通过pcr克隆本核苷酸序列(引物为1ab-f:5
’‑
gcaggatccaccatggacaacaacccgaacatcaac；1ab-r:5
’‑
ccgcgccggaattcgatctagtaacatagatgacacc)，序列5’端和3’端分别设置一个bamhi位点和ecori位点。
agno3 200mg/l乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mm草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mm草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(ms 30g/l蔗糖 0.5mg/l 6-糠基氨基嘌呤(kinetin) 2.5g/l gelrite 200mg/l乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2ms 20g/l蔗糖 2.5g/l gelrite 200mg/l乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。获得分别含t-dna载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株，分别称为c1a2a和c1am2a。
[0123]
实施例5、转基因抗虫耐除草剂水稻的获得
[0124]
本实施例中水稻转化方法同实施例1，利用该方法获得实施例3中制备的载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因水稻植株。
[0125]
实施例6、转基因抗虫耐除草剂大豆的获得
[0126]
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(deng et al.plant physiology communications.1998,34:381-387；ma et al.scientia agricultura sinica.2008,41:661-668；zhou et al.journal of northeast agricultural university.2001,32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50ml naclo与2ml浓hcl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到b5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·
s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
[0127]
含有实施例3中制备的载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中28℃共培养30分钟。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10b5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。
[0128]
共培养的植物组织用b5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到b5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.5mm草甘膦的b5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2b5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
[0129]
实施例7、转基因玉米抗虫能力的测定
[0130]
1、试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1ab、cry2ae和cp4基因的抗虫耐草甘膦转基因品系c1a2a和c1am2a。对照为非转基因亲本材料ph4cv。
[0131]
2、草地贪夜蛾抗性测定：
[0132]
(1)室内生测：
[0133]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是
转基因植株后，各取10株，每株接1龄草地贪夜蛾10头，6天后观察死亡率。草地贪夜蛾来自本课题组田间收集草地贪夜蛾雌虫养殖后产的卵块。将卵块至于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表3所示。
[0134]
表3 草地贪夜蛾室内生物活性测定结果
#
[0135][0136]
#
表中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0137]
(2)大田生测：
[0138]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)进行人工接草地贪夜蛾初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后20d调查食叶级别。
[0139]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0140]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0141]
草地贪夜蛾大田抗性效果测试结果如表4所示。
[0142]
表4 草地贪夜蛾大田测试结果
[0143]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-5100％
#
少量取食斑点1c1a2a-26100％少量取食斑点1c1a2a-39100％少量取食斑点1c1a2a-6778％少量取食3c1a2a-73100％少量取食斑点1c1am2a-14100％少量取食斑点1c1am2a-1890％少量取食2c1am2a-31100％少量取食斑点1c1am2a-39100％少量取食斑点1c1am2a-55100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.5
[0144]
#
代表玉米螟的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0145]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对草地贪夜蛾低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对草地贪夜蛾表现出高抗。
[0146]
2、棉铃虫抗性鉴定：
[0147]
(1)室内生测
[0148]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄棉铃虫10头，6天后观察死亡率。棉铃虫卵块均购自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块至于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表5所示。
[0149]
表5 棉铃虫室内生物活性测定结果
[0150][0151]
#
表中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0152]
(2)大田生测：
[0153]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)进行人工接棉铃虫初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后20d调查食叶级别。
[0154]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0155]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0156]
棉铃虫大田抗性效果测试结果如表6所示。
[0157]
表6 棉铃虫大田测试结果
[0158]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-5100％
#
少量取食斑点1c1a2a-26100％少量取食斑点1
c1a2a-39100％少量取食斑点1c1a2a-6785％少量取食3c1a2a-73100％少量取食斑点1c1am2a-14100％少量取食斑点1c1am2a-18100％少量取食斑点1c1am2a-31100％少量取食斑点1c1am2a-39900％少量取食2c1am2a-55100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.5
[0159]
#
代表玉米螟的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0160]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对棉铃虫低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对棉铃虫表现出高抗。
[0161]
3、玉米螟抗性鉴定
[0162]
(1)室内生测
[0163]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄玉米螟10头，6天后观察死亡率。玉米螟卵块均购自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块至于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表7所示。
[0164]
表7 玉米螟室内生物活性测定结果
[0165][0166]
#
表中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0167]
(2)大田生测：
[0168]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)进行人工接玉米螟初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后20d调查食叶级别。
[0169]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；
6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0170]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0171]
玉米螟大田抗性效果测试结果如表8所示。
[0172]
表8 玉米螟大田测试结果
[0173]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-5100％
#
少量取食斑点1c1a2a-26100％少量取食斑点1c1a2a-39100％少量取食斑点1c1a2a-67100％少量取食1c1a2a-73100％少量取食斑点1c1am2a-14100％少量取食斑点1c1am2a-18100％少量取食斑点1c1am2a-31100％少量取食斑点1c1am2a-39100％少量取食1c1am2a-55100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.0
[0174]
#
代表玉米螟的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pubi1-cry1ab-pubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0175]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对玉米螟低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对玉米螟表现出高抗。
[0176]
实施例8、转基因玉米抗草甘膦能力的测定
[0177]
试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1ab、cry2ae和cp4基因的抗虫耐草甘膦转基因品系c1a2a、c1am2a。对照为非转基因亲本材料ph4cv。
[0178]
大田抗草甘膦性能测定：t2代转基因玉米和常规玉米种子在发芽后20天，4-6叶时期，分别喷施用自来水以体积比1:50、1:100和1:200稀释的41％草甘膦异丙胺盐(孟山都公司)，剂量为40l/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。
[0179]
通过在4-6叶期间大田喷施草甘膦，测定了不同代次的转基因玉米的抗草甘膦能力。结果见表9。
[0180]
表9 转基因抗虫耐除草剂玉米耐草甘膦能力试验
#
[0181][0182]
#
每亩喷施40l的1：100；1：200或者1:50倍稀释的农达(41％草甘膦，孟山都产品)。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1am2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-mar-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0183]
结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的草甘膦。c1a2a-5、c1a2a-26、c1a2a-67、c1am2a-14、c1am2a-18、c1am2a-31和c1am2a-39的抗性水平比较高，其在每亩喷施40l的1：50稀释的农达(41％草甘膦异丙胺盐，孟山都)的条件下没有对转基因玉米有可以看到的不利影响。
[0184]
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。