一种干酪乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于益生菌的技术领域，具体涉及一种干酪乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.益生菌(probiotics)这一概念最早源于希腊语，意为“对生命有益”，并被世界卫生 组织(who)定义为活的微生物，当摄入足够的量时可以给宿主带来多种健康益处，包括 增强免疫力、调节肠道菌群、促进消化吸收、减轻肠易激综合症和降胆固醇等。益生菌 主要包括以下几大类：
①
双歧杆菌属(长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌等)；
②
乳杆菌属(干 酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等)；
③
芽孢杆菌属(枯草芽孢杆菌等)；
④
真菌 类(酵母菌等)。其中干酪乳杆菌(lactobacillus casei)属于乳杆菌属，革兰氏染色阳性 菌，兼性厌氧，是重要的乳酸菌种之一；广泛分布于人体和动物肠道和生殖道、发酵果 蔬以及乳品中。其具备较强的耐酸、耐胆盐能力，并且某些菌株还具有免疫调节、调节 肠道菌群和降胆固醇等有益功能。干酪乳杆菌除具有很多益生性能，还能够产生抑菌活 性物质，能抑制和杀死食品中的许多腐败菌及致病菌。这些益生菌的生理功能与机体的 生命活动息息相关，被广泛应用于工业、农牧业、食品和医药等重要领域。
3.目前，随着全球环境的不断变化，过敏性疾病已成为普遍存在的健康问题，超过30％ 的人正遭受过敏性疾病的影响。当前此类疾病大部分借助药物治疗，然而药物治疗具有 一定副作用，由此急需寻求较为安全有效的治疗手段。并且随着微生物学的迅猛发展， 各种研究发现益生菌对人类过敏性疾病具备有效的预防和治疗功效，但是其相关作用机 理尚不明确，其筛选的关键技术还有待研究突破。
4.此外，目前针对益生菌发酵乳大部分都是应用多菌种发酵不同乳源制备而成，而利 用具有保健功能天然提取物(如黑茶、芦笋等)结合具有缓解和/或预防过敏的益生菌来制 备发酵乳，从而获得兼具多种功能发酵乳鲜见报道。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种干酪乳杆菌及其应用。
6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
7.所述干酪乳杆菌(lactobacillus casei)au9077，于2021年01月18日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所，邮编100101)，该菌株保藏编号为cgmcc no.21663。
8.所述的干酪乳杆菌au9077可用于制备减缓和/或预防过敏性疾病药物。
9.另外，所述的干酪乳杆菌au9077可用于制备具有减敏效果和/或抗氧化活性的食品， 所述食品包括保健食品。
10.优选地，所述食品为黑茶发酵乳饮料和/或芦笋发酵乳。
11.本发明中，制备具有减敏效果和/或抗氧化活性的黑茶发酵乳饮料的方法包括如下步 骤：
12.(1)水煮黑茶，用两层纱布过滤后冷却，制得黑茶汤汁，备用；
13.(2)将脱脂乳粉、果葡糖浆和葡萄糖浆溶解于黑茶汤汁中进行初次调配，充分搅 拌均匀后得初混乳液；所述脱脂乳粉占黑茶汤汁的质量体积比为10～12％，所 述果葡糖浆占黑茶汤汁的质量体积比为2.5～3％，所述葡萄糖浆占黑茶汤汁的 质量体积比为2.5～3％，所述质量体积比的单位为g/ml；
14.(3)将初混乳液于65～75℃预热后，再经均质、杀菌、冷却，得无菌混合料乳液；
15.(4)在无菌的条件下，将干酪乳杆菌按接种量2～4％接种至无菌混合乳液中，于 32～35℃发酵44～48h，再于4℃后熟发酵12～24h，得黑茶发酵乳基料；接种时 是接种干酪乳杆菌活菌制剂或菌悬液(菌悬液中活菌量：1～5
×
108cfu/ml)；
16.(5)向黑茶发酵乳基料中加入灭菌后的与黑茶发酵乳基料等体积的二次调配液， 混合搅拌，然后经均质、无菌灌装、冷却至4℃，得黑茶发酵乳饮料；所述二 次调配液按如下方法制备：以水为溶剂，加入白砂糖、羧甲基纤维素钠、海藻 酸钠丙二醇酯和柠檬酸钠，搅拌均匀，灭菌并冷却后所得；其中，所述白砂糖 在黑茶发酵乳饮料中的质量百分比浓度为8～10％，羧甲基纤维素钠在黑茶发 酵乳饮料重点质量百分比浓度为0.07～0.09％，海藻酸钠丙二醇酯在黑茶发酵 乳饮料中的质量百分比浓度为0.08～0.1％，柠檬酸钠在黑茶发酵乳饮料中的质 量百分比为0.1～0.15％。
17.优选地，其特征在于，步骤(1)中水和黑茶质量体积比为1:100至1:150，所述质量 体积比的单位为g/ml。
18.优选地，步骤(3)和步骤(5)中所述的均质条件为20～25mpa，2～3次；步骤(5) 中所述二次调配液是在80℃条件下灭菌15min。
19.本发明中，制备具有减敏效果和/或抗氧化活性的芦笋发酵乳的方法包括如下步骤：
20.(1)芦笋提取物的制备：将冷冻干燥的芦笋粉溶于水中并于60～65℃，优选为60℃ 水浴提取1.5～2.5h，优选为2h，抽滤并收集滤液，于
‑
80℃预冻5～7h，优选为6h，预冻后迅速于真空冷冻干燥机中冻干24h以上，得芦笋提取物，备用；
21.(2)芦笋发酵乳的制备：脱脂乳粉、芦笋提取物、果葡糖浆、葡萄糖浆和水在 60～65℃条件下混合搅拌均匀后得复原乳；所述复原乳中，脱脂乳粉与复原乳 的质量体积比为10～12％，芦笋提取物与复原乳的质量体积比为0.1～0.5％，果 葡糖浆与复原乳的质量体积比为2.5～3％，葡萄糖浆与所述脱脂复原乳的质量 体积比为2～4％，所述质量体积比的单位为g/ml；将复原乳经65～75℃预热、 均质、灭菌(121℃，15～20min)、冷却至37～40℃，再将干酪乳杆菌按接种量 2～4％接种至复原乳于32～35℃发酵44～48h，再于4℃后熟发酵12～24h，得芦 笋发酵乳；接种时是接种干酪乳杆菌活菌制剂或菌悬液(菌悬液中活菌量：1～5
ꢀ×
108cfu/ml)。
22.优选地，步骤(1)中芦笋粉与水的质量体积比为1:10至1:40，所述质量体积比的单 位为g/ml。
23.优选地，步骤(2)中的均质条件为20～25mpa，2～3次。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.所述干酪乳杆菌au9077在mrs固体培养基上菌落呈乳白色，湿润，边缘整齐。并 且革兰氏染色阳性，杆状，无芽孢，16s rdna序列如seq id no.1所示。所述干酪乳杆 菌
au9077具有较为优异的模拟胃肠液耐受性、抑菌活性、细胞表面活性和对caco
‑
2细胞 的黏附性等体外益生特性；并且表现为安全，包括不产生常见生物胺和溶血素，对绝大部 分常用抗生素敏感。
26.在β
‑
乳球蛋白致敏的小鼠模型中，菌株au9077可以显著减少过敏小鼠血清中组胺、 特异性ige、il
‑
4及mcp
‑
1的分泌；也能上调小鼠结肠组织中过敏相关细胞因子(ifn
‑
γ、 il
‑
10、tnf
‑
α和tgf
‑
β)基因的表达，而下调il
‑
4基因的表达；同时菌株au9077能修 复过敏小鼠肠粘膜结构的损伤；此外，菌株au9077可以有效增加过敏小鼠的肠道有益菌 群丰度。
27.总之，本发明所述干酪乳杆菌(lactobacillus casei)au9077可调节免疫，缓解过敏 症状，并且对β
‑
乳球蛋白诱导的过敏反应引起的肠粘膜结构的破坏具有一定保护作用，也 能有效增加过敏小鼠的肠道有益菌群，在预防和/或缓解过敏方面表现出有效性；另外利 用菌株au9077所制备的黑茶发酵乳饮料和/或芦笋发酵乳具有明显的减敏效果和/或抗氧 化活性。表明其可作为具备减敏功效的益生菌而开发各类益生产品。
附图说明
28.图1干酪乳杆菌au9077菌落形态图；
29.图2动物实验设计流程；
30.图3菌株au9077对小鼠免疫器官指数、ige、组胺和细胞因子含量(il
‑
4、mcp
‑
1)的影 响；
31.图4菌株au9077对小鼠结肠组织细胞因子基因的相对表达的影响；
32.图5小鼠结肠组织病理学检查(he x200)；
33.图6小鼠肠道微生物venn图；
34.图7小鼠肠道微生物结构组成分布图和属类物种丰度聚类热图。
具体实施方式
35.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很 多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况 下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
36.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技 术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
37.实施例1
38.(1)菌株的分离及纯化
39.1)样品的采集：分别在湖南省南山牧场(不同奶站)、望城(乳品公司及牧场)和 宁乡(乳品公司及牧场)用50ml无菌离心管进行取样、编号，并用含冰袋取样箱迅速转 运至微生物实验室；总共从这些地区共采集样品71份。
40.2)乳酸菌的分离：在无菌条件下称取25g所取样于含225ml无菌生理盐水(0.85％ nacl)的500ml锥形瓶中混匀，以10倍梯度稀释至10
‑2～10
‑6，并在mrs固体(含0.5％ caco3(w/v))平板上进行涂布，在37℃条件下培养48h。挑取出现溶钙圈的单菌落进行 革兰氏染
色，将呈现阳性的菌株三次划线纯化并编号保存。得到的菌株均在含40％甘油 的mrs液体培养基中于
‑
80℃冷冻保存。
41.(2)菌株体外益生特性和初步安全性评价
42.1)菌悬液的制备：将菌株在mrs液体培养基中37℃过夜培养，活化2次，然后4℃、 8 000r/min离心3min；用无菌生理盐水2次洗涤，重悬，使得菌悬液od
600nm
大致为0.8。 对照菌株鼠李糖乳杆菌gg(lactobacillus rhamnosus gg，lgg)为相同培养和处理方式。
43.2)耐酸和耐胆盐评价
44.分别往ph为3和含牛胆盐(3.0g/l)的mrs液体培养基中接种3％的菌悬液，37℃ 培养12h，观察培养液是否浑浊，浑浊即表明菌株具有耐受性。通过耐酸和胆盐的评价， 干酪乳杆菌au9077具备较佳的耐受性。
45.3)模拟胃肠液耐受性评价
46.将菌株au9077活化并制备成菌悬液，然后分别加入0.5ml的菌悬液至4.5ml的无 菌模拟胃液、肠液中，旋涡混合15s，在37℃的环境中孵育3h，利用平板计数法分别测 定0h和3h的活菌数，菌株在胃肠液中的存活率按如下方式计算：
[0047][0048]
4)抑菌活性
[0049]
抑菌活性测定：通过牛津杯法测定抑菌活性，并以抑菌圈直径表示菌株抑菌能力， 大肠杆菌和李斯特菌为指示菌株。
[0050]
5)菌株表面活性
[0051]
自聚集：直接吸取1ml筛选菌株的菌悬液于1.5ml离心管中，旋涡10s，然后37℃ 静置5h，缓慢吸取200μl上层菌液，测定od
600nm
值，重复3次测定，菌株自聚集计算 公式如下：
[0052][0053]
式中：a1：静置5h后上层菌液的od
600nm
值；a0：初始菌悬液的od
600nm
值。
[0054]
共聚集：分别以李斯特菌和大肠杆菌为指示菌去评价分离菌株的共聚集能力；把相 同体积的受试菌株和指示菌的菌悬液混合，涡旋混合10s，37℃静置5h，缓慢吸取200 μl上层菌液，测量od
600nm
值(a
混
)，重复3次测定，菌株共聚集计算公式如下： [0055]
式中：a2和a3分别表示受试菌与指示菌菌悬液各自单独处理5h的吸光值。
[0056]
疏水性：将2ml菌悬液加入至10ml离心管中，然后加入等体积有机试剂(分别以 十六烷和乙酸乙酯进行评价)，旋涡混合2min，在通风橱中常温放置0.5h后，测定水层 溶液od
600nm
值，重复3次测定，计算公式如下：
[0057][0058]
式中：a
x
表示菌悬液的初始od
600nm
值，a
y
表示放置30min后的od
600nm
值。
[0059]
6)对caco
‑
2细胞的黏附能力
[0060]
细胞培养：取液氮保存的caco
‑
2细胞37℃水中迅速解冻，800r/min离心5min，加 入1ml dmem高糖培养基混匀，转入细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清(fbs)的dmem 培养基在5％co2、37℃培养箱中培养，两天换一次液，当细胞的长至培养瓶的90％以上 时进行传代，传代3次后用于试验。
[0061]
黏附试验：将1ml caco
‑
2细胞悬液(1.0
×
105cells/ml)于6孔细胞培养板中，于co2培养箱中培养，直至细胞长至单层。吸出培养液，并用无菌pbs 2次洗涤，加入1ml菌 悬液(此处菌株菌悬液用含10％fbs的dmem培养基重悬所得)，在培养箱中孵育2h； 然后吸去菌悬液，再用无菌pbs清洗3次，以洗去未能黏附的菌体，最后用细胞刮收集 细胞，分别使用血球计数板测定各孔caco
‑
2细胞数和平板计数法测定各孔黏附细菌数。 黏附能力计算公式如下：
[0062][0063]
7)安全性评价
[0064]
溶血性：把2μl受试菌的菌液点种到血琼脂平板上，37℃培养72h，观察受试菌株 是否出现溶血情况，并以金黄色葡萄球为阳性对照。
[0065]
抗生素敏感性和产脱羧酶实验：采用药物敏感性片剂试剂盒(含20种抗生素)评价 受试菌株对抗生素敏感性。
[0066]
利用赖氨酸脱羧酶试剂盒评价受试菌株的产生物胺活性。
[0067]
如表1所示，与对照菌株lgg相比，干酪乳杆菌au9077表现出良好模拟胃肠液耐 受性(存活率＞90％)、菌株表面活性(包括自聚集、共聚集和疏水性)和对caco
‑
2细胞 黏附性等益生特性；并且其能够抑制常见致病菌(大肠杆菌和李斯特菌)，可作为益生菌 的候选菌株。
[0068]
表1干酪乳杆菌au9077体外益生特性结果
[0069][0070][0071]
如表2所示，干酪乳杆菌au9077不产生常见生物胺和溶血素，并对20种抗生素中绝 大部分抗生素敏感，初步判定为安全菌株。
[0072]
表2干酪乳杆菌au9077体外安全性评价结果
[0073][0074]
a
菌株对抗生素敏感直径d，
“‑”
d＜5mm；“ ”：5mm≤d＜15mm；“ ”：15mm≤d＜25 mm；“ ”：d≥25mm。
b
“‑”
非溶血；“α”溶血；“β”溶血。
c
“‑”
赖氨酸脱羧酶活性呈阴性；“
”ꢀ
赖氨酸脱羧酶活性呈阳性。
[0075]
(3)菌株的鉴定
[0076]
将干酪乳杆菌au9077活化后，通过划线法得到单菌落，观察其菌株特征，由图1可 知，其菌落呈乳白色，湿润，边缘整齐；细胞显微形态为杆状，无芽孢，革兰氏染色阳 性。
[0077]
通过16s rdna的pcr扩增产物进行测序，测序结果见seq id no.1，登录ncbi网 站，进行blast序列比对，结果显示菌株au9077与干酪乳杆菌(lactobacillus casei)的 16s rdna同源性达99％以上，可确定该菌为干酪乳杆菌(lactobacillus casei)。并将该干 酪乳杆菌在2021年月保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.21663，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编 100101。
[0078]
实施例2菌株的抗过敏活性的小鼠体内评价
[0079]
(1)菌株的活化
[0080]
将保存在
‑
80℃冰箱的干酪乳杆菌au9077的原始菌种活化2代后，在固体mrs培养 基上划线，37℃静置培养72h后挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，经过37℃恒温培 养24h，按1％(v/v)接种量接种到液体mrs培养基中，连续培养2代。
[0081]
(2)菌悬液的制备
[0082]
将活化好的干酪乳杆菌au9077接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后8 000r/min 离心4min收集菌体沉淀，再重悬于pbs缓冲液中，调整菌体浓度为108cfu/ml、10
10 cfu/ml。
[0083]
(3)动物模型的构建
[0084]
实验动物：balb/c雌性小鼠，20g左右，spf级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限 公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2019
‑
0004；在湖南省药物安全评价研究中心 屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2015
‑
0016。
[0085]
18～22g的雌性balb/c小鼠，先置于动物房适宜性喂养一周，房间温度维持在25℃左 右，12h昼夜交替，保持通风状态，提供基础日粮以及纯净水。一周后，将小鼠进行随机 分组，每组体重的组间差异小于3g，随机分成6组，开始正式试验。设置空白对照组、模 型对照组、干酪乳杆菌au9077高、低剂量组。具体分组如表3：
[0086]
表3试验分组及处理
[0087][0088]
正常组小鼠在整个实验过程中均日常饲养，空白组小鼠在第7、14、21和28d对其进 行腹腔注射无菌生理盐水，实验组及模型组小鼠在第7、14、21和28d对其进行腹腔注射 0.2ml 2mg/ml过敏原(1ml的弗氏佐剂 1ml 2mg/ml的β
‑
乳球蛋白)，实验组灌胃 1ml相应的试验菌株的菌悬液，模型组则灌胃1ml pbs缓冲液。从第7天开始，每周四 次，整个流程如图2所示。
[0089]
试验第34d禁食12h，第35d用5mg的β
‑
乳球蛋白口服激发1次后，对老鼠状况进 行观察，再眼球取血，脱颈处死小鼠，取出小鼠的脾脏和胸腺称重，收集老鼠结肠及粪便 保存于液氮中，用于后续试验。
[0090]
(4)过敏相关指标的测定
[0091]
1)小鼠免疫器官指数的测定
[0092]
口服激发1h后，称取小鼠体重，采血后脱颈处死；解剖并取出小鼠脾脏和胸腺，将 周围的脂肪组织剔干净，用滤纸将脾脏和胸腺上的血渍吸净后，称取其重量。按下式计算 脾脏及胸腺指数：脾脏指数＝脾脏的质量(mg)/小鼠体重(g)；胸腺指数＝胸腺的质 量(mg)/小鼠体重(g)。
[0093]
2)小鼠结肠病理观察
[0094]
取小鼠结肠组织浸泡于10％的福尔马林溶液固定，置于4℃冰箱中保存；将样品送至 湖南省药物安全评价研究中心通过he染色技术，进行组织病理学检查。
[0095]
3)小鼠血清中组胺、特异性ige以及细胞因子含量
[0096]
利用elisa试剂盒检测，检测血清中组胺、il
‑
4、mcp
‑
1、ige含量，按说明书进行 操作。
[0097]
4)pcr检测结肠组织il
‑
4、ifn
‑
γ、il
‑
10、tnf
‑
α、tgf
‑
β基因表达
[0098]
①
总rna抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌，无rna酶)
[0099]
取匀浆管，加入1ml的trizol reagent，置冰上预冷；取100mg组织，加入到匀浆管 中；匀浆仪充分研磨直至无可见组织块；12 000r/min离心10min取上清；加入250μl三 氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min；4℃下12 000r/min离心10min；将400 μl上清转移
到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀；
‑
20℃放置15min； 4℃下12 000r/min离心10min，管底的白色沉淀即为rna。吸除液体，加入75％乙醇1.5 ml洗涤沉淀；4℃下12 000r/min离心5min；将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹 3min。加入15μl无rna酶的水溶解rna；55℃孵育5min；使用nanodrop 2 000检测 rna浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl待测rna溶液于检测基座上，放下样品臂， 使用电脑上的软件开始吸光值捡测；将浓度过高的rna进行适当比例的稀释，使其终浓 度为100
‑
500ng/μl。
[0100]
②
反转录
[0101]
按照表4体系进行配置，并轻轻混匀并离心；逆转录程序设置参照表5；枪头和pcr 均经过湿热灭菌，无rna酶。
[0102]
表4逆转录反应体系配制(20μl反应体系)
[0103][0104]
表5逆转录程序设置
[0105][0106]
③
定量pcr
[0107]
取0.2mlpcr管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
[0108][0109]
④
pcr扩增
[0110]
预变性
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95℃，10min
[0111]
循环(40次)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95℃，15s
→
60℃，30s
[0112]
熔解曲线
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
65℃
→
95℃，每15s升温0.3℃ 引物序列见表6：
[0113]
表6引物序列
[0114][0115][0116]
⑤
结果处理方法
[0117]
δδct法：
[0118]
a＝ct(目的基因，待测样本)
‑
ct(内标基因，待测样本)
[0119]
b＝ct(目的基因，对照样本)
‑
ct(内标基因，对照样本)
[0120]
k＝a
‑
b
[0121]
表达倍数＝2
‑
k
[0122]
通过建立β
‑
乳球蛋白(β
‑
lg)诱导的过敏小鼠模型，评价了干酪乳杆菌au9077的低、 高剂量对致敏小鼠免疫调节能力和对结肠组织的影响。结果如图3～5所示，小鼠腹腔注射 β
‑
lg可以显著降低免疫器官指数以及血清中细胞因子mcp
‑
1、il
‑
4的水平，且β
‑
lg致敏小 鼠血清中组胺、sige含量显著高于c组(p<0.05)。而经过菌株au9077干预后的β
‑
lg致 敏小鼠能够显著减低血清中的组胺、sige以及提高细胞因子mcp
‑
1、il
‑
4的分泌水平。通 过q
‑
pcr分析小鼠结肠组织中相关细胞因子基因的相对表达量发现，与m组相比，经低 剂量的菌悬液干预后，能够显著升高il
‑
10和tgf
‑
β基因的表达量，同时显著降低il
‑
4的 水平，且增加ifn
‑
γ的表达水平。同时，利用he染色观察小鼠结肠组织病理发现，菌株 au9077处理后的试验组小鼠结肠组织中炎症细胞浸润的肠黏膜固有层可见少量的肥大细 胞，结构完整，轮廓清晰，无脱颗粒现象，与c组结构相似。这些结果表明该菌株具有缓 解或预防过敏
性疾病的潜在功能。
[0123]
实施例3β
‑
乳球蛋白致敏小鼠肠道菌群的影响
[0124]
(1)小鼠模型的建立
[0125]
本实施例的小鼠模型均按照实施例2中进行建立。
[0126]
(2)小鼠粪便样本dna提取
[0127]
收集各组小鼠新鲜粪便，及时冻存于
‑
80℃，使用dna提取试剂盒按说明书进行基因 组dna抽提。
[0128]
(3)pcr扩增
[0129]
采用上一步提取的dna为模板，进行扩增，扩增区域为细菌16s rrna基因的v3
‑
v4 区。引物序列、扩增体系、扩增条件如表7、8和9所示。
[0130]
表7引物序列
[0131][0132]
表8扩增体系
[0133][0134]
表9扩增条件
[0135][0136]
(4)pcr产物的检测、合并和纯化
[0137]
扩增完毕后，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳条件：1.5％琼脂糖凝胶， 100v，30min；利用genetools analysis software(version4.03.05.0，syngene)对pcr产 物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各pcr产物进行混合。
[0138]
(5)文库制备与上机测序
[0139]
建库按照ultra tm dna library prep kit for标准流程进行建库操 作，完成后使用illumina nova 6000平台对构建的扩增子文库进行pe250测序。以上内容 委托广东美格基因科技有限公司进行。
[0140]
由表10、图6和图7可知，在venn图中，c组特有物种数目最多，m组次之。微 生物群落结构分布图及聚类热图显示，在门水平上，相比于c组，m组的拟杆菌门及疣微 菌门相对丰度较高，灌胃菌株au9077后拟杆菌门和厚壁菌门成为小鼠肠道中优势菌门； 在科水平上，各组不同科丰度值差异较大，c组、m组、试验组优势菌科分别为鼠杆菌 科、艾克曼菌科、
乳酸杆菌科；在属水平上进行聚类后，同剂量试验组聚成一类，低剂 量组与c组较为接近。alpha多样性分析结果表明，对小鼠致敏后微生物多样性增加，灌 胃乳酸菌后小鼠微生物多样性降低；试验组有向c组靠拢的趋势，与m组距离较远，在 门类群落聚集分析图中发现，m组与c组群落结构组成有明显区别，但试验组聚类更接近 于m组；菌株au9077能有效改善由于过敏症状造成的小鼠肠道菌群的变化，增加有益菌 丰度。
[0141]
表10小鼠肠道微生物α多样性分析结果
[0142][0143]
实施例4黑茶发酵乳饮料的制备
[0144]
(1)菌种的活化及培养
[0145]
将
‑
80℃冻存的干酪乳杆菌au9077的菌液接入mrs液体培养基中，37℃培养24h， 活化3代。活化后的菌株按一定接种量(v/v)接种到液体mrs培养基中在适宜温度下恒 温培养30h，测定菌株活菌数与od
600nm
值。
[0146]
(2)黑茶汤汁的制备
[0147]
用砖刀敲碎的黑茶小块经水煮(100℃、10min)、两层纱布过滤、冷却(65℃)后制 得黑茶汤汁，备用。所述黑茶小块与水的质量体积比为1:150；
[0148]
(3)黑茶发酵乳饮料的制备具体如下步骤：
[0149]
将脱脂乳粉、果葡糖浆和葡萄糖浆溶于所制备的黑茶汤汁中进行初次调配，充分搅 拌均匀后得初混乳液；将所得的初混乳液经过预热(65℃)、均质(20mpa，2次)、灭 菌(121℃、15min)、冷却(40℃)后得无菌混合乳液；在无菌的条件下，向所得的混合 乳液中接种的发酵剂，然后进行发酵(33℃、48h)、后熟(4℃、24h)后得到黑茶发酵 乳基料；向上述黑茶发酵乳基料中加入灭菌后的与黑茶发酵乳基料等体积的二次调配 液，搅拌均匀，经均质(20mpa，2次)、无菌灌装、冷却(4℃)即得黑茶发酵乳饮料。
[0150]
所述脱脂乳粉占黑茶汤汁的质量体积比(g/ml)为12％、果葡糖浆占黑茶汤汁的质量 体积比(g/ml)为3％，所述葡萄糖浆占黑茶汤汁的质量体积比(g/ml)为3％；
[0151]
所述二次调配液按如下方法制备：以水为溶剂，加入白砂糖、羧甲基纤维素钠、海藻 酸钠丙二醇酯和柠檬酸钠，搅拌均匀，灭菌并冷却后所得；其中，所述白砂糖在黑茶发酵 乳饮料中的质量百分比浓度为8～10％，羧甲基纤维素钠(cmc)在黑茶发酵乳饮料重点质 量百分比浓度为0.07～0.09％，海藻酸钠丙二醇酯(pga)在黑茶发酵乳饮料中的质量百分 比浓度为0.08～0.1％，柠檬酸钠在黑茶发酵乳饮料中的质量百分比为0.1～0.15％。
[0152]
所述发酵剂为干酪乳杆菌au9077的菌悬液(5
×
108cfu/ml)，接种量为3％。
[0153]
所述果葡糖浆、葡萄糖浆、白砂糖、cmc、pga和所述柠檬酸钠均为食品级。
[0154]
(4)黑茶发酵乳饮料减敏作用和抗氧化能力的测定
[0155]
①
中性黑茶发酵乳饮料的制备(hnm)：将制备完成的黑茶发酵乳饮料于4℃、10 000r/min无菌的条件下离心10min，收集上清液并用无菌1％的naoh溶液调节ph值中 性，得
到无菌hnm，4℃暂存备用。
[0156]
②
减敏作用的评价
[0157]
rbl
‑
2h3细胞培养：取液氮保存的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(rbl
‑
2h3)在37℃ 水中快速解冻，800r/min离心5min，去掉冻存液，加入1ml dmem(高糖)培养基重 悬，并转移至细胞培养瓶中，随即吸入5～6ml含10％fbs的dmem培养基(简称完全 培养基)，于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养。每1天换1次液，当细胞长至 瓶壁的90％以上进行传代，连续传代三次后进行相关试验。
[0158]
rbl
‑
2h3脱颗粒模型的建立：将传代三次后且处于生长旺盛期的rbl
‑
2h3细胞消化 为细胞悬液(1.0
×
105cells/ml)，向6孔板中的各孔接种1ml悬液，再加入3ml完全培 养基，当细胞长至单层进行试验，根据试验方案分为试验组(hnm组)、模型组(m组) 和空白组(n组)；细胞建立模型如下：
[0159]
致敏：将培养完成的rbl
‑
2h3细胞除去培养液，并按实验方案要求进行分组。然后 hnm组和m组均加入1ml含抗
‑
dnp
‑
ige(0.5μl/ml)的完全培养基，n组用等量完全 培养基代替；于37℃、5％co2培养箱中过夜培养。
[0160]
样品处理：将过夜致敏的rbl
‑
2h3细胞除去培养液。然后，hnm组加入1mlhnm，m组和n组用等量完全培养基代替，于co2培养箱中处理1h。
[0161]
激发：将样品处理过的rbl
‑
2h3细胞除去培养液，并用pbs清洗2次。然后，hnm 组和m组均加入含dnp
‑
bsa(0.25μg/ml)的完全培养基，n组用等量完全培养基代替。 收集不同激发时间点的上清液或细胞，待dnp
‑
bsa激发0.5h后，测定黑茶发酵乳对 rbl
‑
2h3细胞β
‑
氨基己糖胺酶(β
‑
hex)的释放的抑制，获取培养液并1 000r/min、4℃ 离心5min，保留上清液备用。取上清液(50μl/孔)加至96孔培养板中，每孔加入50μl 显色液，37℃保温1h后，加入200μl终止液(0.1mol/l na2co3/nahco2，ph为11.0) 终止反应，酶标仪测定od
406nm
值。对β
‑
hex释放抑制率的计算公式如下：
[0162][0163]
③
抗氧化能力评价
[0164]
参照试剂盒说明书测定黑茶发酵乳的总抗氧化能力(total antioxidant capacity， t
‑
aoc)、羟基自由基清除能力。dpph自由基清除能力测定方法为：向试管中加入1ml 待测样品(hnm)和1ml 0.2mm/l dpph乙醇溶液(用无水乙醇配制，4℃避光保存， 现配现用)，混匀后于室温下避光反应30min，测定溶液在517nm处的吸光度；用1ml 无水乙醇代替1ml dpph乙醇溶液为空白组；用1ml pbs缓冲液代替1ml待测样品为 对照组，并以1ml pbs缓冲液和无水乙醇混合液空白调零。每个样品重复3次，求平均 值。计算公式如下：
[0165][0166]
式中：a
s
——样品组吸光度，a
b
——空白组吸光度，a
c
——对照组吸光度。
[0167]
由此制备的黑茶发酵乳饮料，色泽均一，呈现红褐色；酸甜适口，润滑不腻，具备 浓郁的茶香兼具酸奶的风味特点，适宜大部分消费者的需求；由表11可知，黑茶发酵乳 饮料能够显著抑制rbl
‑
2h3细胞的脱颗粒；并且其总抗氧化能力、羟基自由基清除能力 以及dpph自由基清除能力均较高。从而说明干酪乳杆菌au9077所制备黑茶发酵乳的具 有一定
减敏作用和抗氧化能力。
[0168]
表11黑茶发酵乳饮料的β
‑
hex抑制结果和抗氧化活性
[0169][0170]
ck:表示未添加黑茶。
[0171]
实施例5芦笋发酵乳的制备
[0172]
(1)菌种的活化及培养
[0173]
将
‑
80℃冻存的干酪乳杆菌au9077的菌液接入mrs液体培养基中，37℃培养24h， 活化3代。活化后的菌株按一定接种量(v/v)接种到液体mrs培养基中在适宜温度下恒 温培养30h，测定菌株活菌数与od
600nm
值。
[0174]
(2)芦笋提取物的制备
[0175]
将冷冻干燥的芦笋粉溶于水中于60℃水浴提取2h，抽滤后收集滤液，于
‑
80℃预冻 6h，预冻后迅速将样品转移真空冷冻干燥机中，冻干24h以上，获得芦笋提取物，备用。 所述芦笋粉与水的质量体积比为1:40。
[0176]
(3)芦笋发酵乳的制备具体如下步骤：
[0177]
脱脂乳粉、芦笋提取物、果葡糖浆、葡萄糖浆和水在温度为65℃条件下混合搅拌均 匀后得复原乳，经预热(65℃)、均质(20mpa，2次)、灭菌、冷却(40℃)、接种发 酵剂、后熟(4℃、24h)后获得芦笋发酵乳。
[0178]
所述脱脂乳粉占复原乳的质量体积比(g/ml)为12％，所述芦笋提取物占复原乳的质 量体积比(g/ml)为0.5％，所述果葡糖浆占复原乳的质量体积比(g/ml)为3％，所述葡 萄糖浆占所述脱脂复原乳的质量体积比(g/ml)为3％，所述灭菌温度为121℃、时间为 20min，所述发酵剂为干酪乳杆菌au9077的菌悬液(5
×
108cfu/ml)，接种量为3％， 发酵温度为33℃，发酵时间为48h。
[0179]
(4)芦笋发酵乳减敏作用和抑菌能力的测定
[0180]
①
中性芦笋发酵乳的制备(lnm)：将制备完成的芦笋发酵乳于4℃、8 000r/min 无菌的条件下离心5min，收集上清液并用无菌1％的naoh溶液调节ph值中性，得到无 菌lnm，4℃暂存备用。
[0181]
②
减敏作用的评价
[0182]
按照实施例4中的方法进行测定
[0183]
③
抑菌能力评价
[0184]
通过牛津杯法测定抑菌活性，并以抑菌圈直径表示菌株抑菌能力，大肠杆菌和李斯 特菌为指示菌株。
[0185]
由此制备的芦笋发酵乳呈褐色，均匀一致；具有愉悦的芦笋风味，无异味。并且如 表12所示，随着芦笋提取物添加量的增加芦笋发酵乳的活菌数、滴定酸度也随之增加， 表明芦笋能够促进菌株的生长。此外，如表13所示，芦笋发酵乳上清液能够也显著抑制 rbl
‑
2h3细胞的脱颗粒；并且能够抑制常见致病菌(大肠杆菌和李斯特菌)。从而说明干 酪乳杆菌au9077所制备芦笋发酵乳的具有一定减敏作用。随着芦笋提取物添加量的不断 增加，芦笋发酵乳上清液的总抗氧化能力、羟基自由基清除能力以及dpph自由基清除逐 渐提高，说明干酪乳杆菌au9077所制备的芦笋发酵乳具有较强的抗氧化能力。
[0186]
表12芦笋发酵乳的黏度、滴定酸度、ph和活菌数结果
[0187][0188]
表13芦笋发酵乳的β
‑
hex抑制效果、抗氧化和抑菌活性
[0189]