金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层及制备方法与其在神经和骨组织修复中的应用

1.本发明涉及一种金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层及制备方法与其在神经和骨组织修复中的应用，属于生物医用材料领域。


背景技术：

2.在人体骨骼系统中，神经组织主要分布在骨代谢活跃的区域，其正常功能对于维持骨骼微环境稳定和促进骨折愈合至关重要。例如，当人体发生骨折后，神经细胞分泌的降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，cgrp)可促进骨组织再生，利于术后骨植入材料实现骨整合(materials today,2018,21(4):362-376)。然而，当神经系统发生病变或功能损伤时，会导致骨折周围神经支配不足，这使得骨折部位常表现为骨痂强度低、骨折愈合延迟和骨不连，严重制约了骨修复过程。因此，开发具有良好神经再生功能的新型骨修复材料对于促进神系统经病变或损伤患者的骨修复具有重要意义。
3.金属钛材及其合金具有良好的生物相容性、化学稳定性和耐蚀性，是临床上常用的骨植入材料。但钛基材表面为生物惰性，导致其促进成骨和神经再生的能力不足。现有研究结果显示，细胞在植入物表面的黏附和细胞内外的信号传导受到细胞膜整联蛋白活性的调控。在非活化状态时，整联蛋白分子处于闭合、折叠的构象，与细胞外基质蛋白的亲和性较低。而活化的整联蛋白与细胞外基质蛋白结合后，可进一步招募胞内结构蛋白，形成黏着斑，进而激活胞内信号通道，调控细胞的迁移、增殖和分化等行为。因此，通过活化细胞整联蛋白，有望调控成骨细胞和神经细胞的活性，到达促进骨和神经组织快速修复的目的。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层及制备方法与其在神经和骨组织修复中的应用。所述金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层具有良好的生物活性，能通过释放金属离子活化神经细胞整联蛋白，促进神经细胞分化和神经肽释放，潜在性地调控骨组织修复。与此同时，纳米涂层释放的金属离子还能活化成骨细胞的整联蛋白，进而促进其成骨分化。
5.第一方面，本发明提供一种金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层。所述纳米涂层以相互交错的二氧化钛纳米线为载体，且金属离子以离子或者氧化物的形式存在于二氧化钛纳米线表面或以离子的形式掺入二氧化钛晶格内部。二氧化钛纳米线结构具有比表面积大、亲水性高的特点，可促进其表面吸附细胞外基质蛋白。这些吸附的细胞外基质蛋白利于活化细胞膜的整联蛋白，并与金属离子产生协同作用。尤其是本发明的纳米涂层中金属离子的引入保留了二氧化钛纳米线结构，可进一步促进细胞在其表面黏附和功能表达。
6.所述金属离子为碱土金属离子和/或过渡金属离子，优选为ca
2
、mg
2
、mn
2
中的至少一种。相比于k

、na

等单价金属离子，二价金属离子的电荷密度高，电子接受能力强，更易与整联蛋白结合，即二价离子活化整联蛋白的能力强。以及，ca
2
、mg
2
、mn
2
在金属离子在细
胞内外的含量较高，生物相容性较好。
7.所述金属离子占纳米涂层的质量分数为0.1-10％，优选为0.1-6％。此含量范围的金属离子掺杂二氧化钛涂层可溶出合适浓度的金属离子，既能活化细胞整联蛋白，又不明显抑制细胞分化和矿化等细胞功能，促进组织修复。
8.较佳地，所述金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层的厚度为2-5μm。此厚度范围内的涂层保持为纳米线形态。涂层的厚度过低则此时涂层为纳米叶或纳米孔形态，厚度过高涂层易从基材上剥落。
9.较佳地，所述二氧化钛纳米线的直径为20-60nm。
10.较佳地，所述金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层释放金属离子以活化整联蛋白，尤其是神经细胞整联蛋白和/或成骨细胞整联蛋白。本发明的涂层使用ca
2
、mg
2
、mn
2
，此时金属离子的电荷密度、电子接受能力呈现的活化能力适于该涂层在神经和骨组织修复中的应用。
11.第二方面，本发明提供上述任一项所述的金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：(1)将钛基材浸没在氢氧化钠水溶液中，采用水热反应法在钛基材表面原位生长钛酸钠纳米层；(2)将步骤(1)制备的表面原位生长钛酸钠纳米层的基材依次浸泡于盐酸和含有金属离子的水溶液中以通过离子交换而在钛酸钠纳米层中掺杂金属离子；(3)将步骤(2)所得钛基材退火以得到金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层。
12.较佳地，步骤(1)中，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1-10mol/l；水热反应温度为150-300℃，反应时间为8-30h。
13.较佳地，步骤(2)中，所述盐酸的浓度为0.01-1mol/l，浸泡时间为0.5-4h；所述含有金属离子的水溶液的浓度为0.001-1mol/l，浸泡时间为0.1-24h。
14.较佳地，步骤(3)中，退火温度为400-700℃，退火时间为0.5-4h。
15.较佳地，所述钛基材为医用钛基材，包括纯钛或者钛合金。
16.第三方面，本发明提供了一种可促进神经和骨组织修复的金属离子掺杂tio2纳米涂层。
附图说明
17.图1中的a为tio2和mn
2
掺杂tio2纳米涂层的xrd图谱，b为mn
2
掺杂tio2纳米涂层的离子溶出量，c为tio2和mn
2
掺杂tio2纳米涂层的sem照片；图2中的a为mn
2
掺杂tio2纳米的tem照片和元素面分布图，b为mn
2
掺杂tio2纳米涂层的mn 2p
3/2
高分辨xps图谱，c为mn
2
掺杂tio2纳米涂层的锐钛矿(101)晶面的xrd图谱；图3中的a为tio2和mn
2
掺杂tio2纳米涂层表面神经细胞的整联蛋白α5(itga5)基因表达量，b为整联蛋白β3(itgb3)基因表达量，c为微管蛋白tubulin分泌量，d为神经肽cgrp分泌量；图4中的a为tio2和mn
2
掺杂tio2纳米涂层表面成骨细胞的整联蛋白表达量，b为alp活性，c为细胞外基质矿化表达量，d为骨钙蛋白ocn表达量；图5中的a为tio2和mg
2
掺杂tio2纳米涂层的xrd图谱，b为mg
2
掺杂tio2纳米涂层的
离子溶出量，c为mg
2
掺杂tio2纳米涂层的sem照片；图6中的a为tio2和mg
2
掺杂tio2纳米涂层表面神经细胞的整联蛋白α5(itga5)基因表达量，b为整联蛋白β3(itgb3)基因表达量，c为微管蛋白tubulin分泌量，d为神经肽cgrp分泌量；图7中的a为tio2和mg
2
掺杂tio2纳米涂层表面成骨细胞的整联蛋白表达量，b为alp活性，c为细胞外基质矿化，d为骨钙蛋白(ocn)表达量。
具体实施方式
18.通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各百分含量指质量百分含量。
19.本公开提供一种可促进神经和骨组织修复的金属离子掺杂二氧化钛纳米涂层。该生物涂层具有纳米线结构(如图1中的c和图5中的c所示)。纳米线的涂层结构可促细胞黏附，利于神经再生和成骨分化等功能表达。
20.所述纳米涂层以相互交错的二氧化钛纳米线为载体，且金属离子以离子或者氧化物的形式存在于二氧化钛纳米线表面和/或以离子的形式掺入二氧化钛晶格内部。相比于纳米叶和纳米孔的涂层形态，纳米线形态的二氧化钛更易吸附细胞外基质蛋白。这些吸附的细胞外基质蛋白利于活化细胞膜的整联蛋白。所述二氧化钛主要为锐钛矿型，还可以含有少量金红石型。锐钛矿相的二氧化钛生物相容性更高。
21.整联蛋白结构中含有多个金属离子结合位点，如金属离子依赖的粘附位点(metal ion dependent adhesion site，midas)、临近midasa位点(adjacent to midas，admidas)和协同金属离子结合位点(synergistic metal ion binding site，symbs)。本发明所述涂层的金属离子可为ca
2
、mg
2
、mn
2
等碱土金属或过渡金属离子中的至少一种。当一定浓度的ca
2
、mg
2
和mn
2
金属离子与它们结合后，可活化整联蛋白，促进细胞的黏附和分化。
22.所述金属离子占纳米涂层的质量分数为0.1-10％，优选为0.1-6％。金属离子的掺杂量过高，易溶出过量的金属离子，过度活化整联蛋白，从而降低细胞的活性。相比于未掺杂金属离子的tio2纳米涂层，本发明所得金属离子掺杂tio2纳米涂层具有更优的生物活性，可刺激神经细胞和成骨细胞分化，是一种潜在的生物医用材料，可用于神经系统病变或损伤患者的骨修复材料的研究与开发。
23.以下示例性说明本发明所述可促进神经和骨组织修复的金属离子掺杂tio2纳米涂层的制备方法。采用水热反应、离子交换和高温退火三步法，在该过程中金属离子通过离子交换吸附在钛酸钠纳米线表面，经过后续退火后在钛基材表面原位制备具有纳米线结构的金属离子掺杂二氧化钛(tio2)涂层，这为研究开发新型的骨-神经组织修复用涂层材料提供可能。
24.利用水热反应在钛基材表面原位构建钛酸钠纳米层。将医用钛基材浸没在氢氧化钠水溶液中，采用水热反应法在其表面原位生长钛酸钠纳米层。该纳米层由相互交错的钛酸钠纳米线构成。通过控制水热反应的时间和浓度可调控纳米层的形貌使其形成纳米线。所述涂层可形成于纯钛或钛合金表面。所述水热反应法的反应温度为150-300℃，优选为180-250℃。水热反应保温时间为8-30h，优选为12-18h。氢氧化钠浓度为0.1-10mol/l，优选为0.5-2mol/l。氢氧化钠水溶液浓度过低，水热反应温度过低或保温时间过短，基材表面不
易形成合适纳米结构的涂层。氢氧化钠浓度过高，水热反应温度过高或保温时间过长，所得纳米涂层的厚度较大，会降低涂层与基材的结合力。
25.利用离子交换法在钛酸钠纳米涂层中掺杂金属离子。将制备的钛酸钠纳米层浸泡在盐酸溶液中一段时间，即使用h

交换钛酸钠中的na

，这利于后续退火时将钛酸钠转变为二氧化钛。所述盐酸溶液浓度为0.01-1mol/l，优选为0.05-0.5mol/l，浸泡时间为0.5-4h，优选为1-3h。盐酸浓度过低或浸泡时间过短不利于退火后形成tio2。盐酸浓度过高或浸泡时间会降低退火后涂层与基体的结合力。随后浸泡在含有金属离子的水溶液中一段时间，得到含有金属离子的纳米涂层，将金属离子与h

交换形成掺杂金属离子的纳米线涂层。所述金属离子溶液的浓度为0.001-1mol/l，优选为0.005-0.5mol/l；浸泡时间为0.1-24h，优选为0.5-15h。离子溶液浓度过低或浸泡时间过短则不易将金属离子掺入tio2涂层，离子溶液浓度过高或浸泡时间过长易使得涂层掺入过量的金属离子，不利于其表面细胞的功能发挥。
26.将掺杂金属离子的纳米涂层退火。所述退火温度为400-700℃，优选为450-600℃，退火时间为0.5-4h，优选为1-2h。退火可将钛酸钠转变为生物相容性高的二氧化钛。经过退火后，钛酸钠转变为二氧化钛，金属离子以离子/氧化物的形式存在于二氧化钛纳米线表面或以离子的形式掺入了二氧化钛晶格内部。
27.本发明所得纳米涂层具有良好的生物活性，能通过释放金属离子(优选为二价金属离子)活化神经细胞整联蛋白，促进神经细胞分化和神经肽释放，潜在性地调控骨组织修复。与此同时，纳米涂层释放的金属离子还能活化成骨细胞的整联蛋白，进而促进其成骨分化。
28.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
29.实施例1
30.a：mn
2
掺杂tio2纳米涂层的制备
31.将砂纸打磨光滑的钛片置于氢氧化钠水溶液中，采用水热反应法，在钛片表面原位生长钛酸钠纳米涂层。水热反应法所用氢氧化钠水溶液体积为60ml，氢氧化钠水浓度为1mol/l。水热反应时间为15h，水热反应温度分别为220℃。将水热反应制备的涂层采用离子交换法分别在盐酸溶液和mncl2水溶液中浸泡一段时间后，采用高温退火法制备mn
2
掺杂tio2纳米涂层。盐酸溶液浓度为0.1mol/l，浸泡时间为2h。mncl2水浓度为0.01mol/l(浸泡时间为1h)或0.1mol/l(浸泡时间为5h)。退火温度为600℃，退火时间为1h。
32.采用同样的方式，但是省略mncl2溶液浸泡过程，以制备未掺杂mn
2
的tio2纳米涂层。
33.所用mncl2水溶液浓度为0.01mol/l和浸泡时间为1h以及退火形成的样品标记为tio
2-mn1。所用mncl2水溶液浓度为0.1mol/l和浸泡时间为5h以及退火形成的样品标记为tio
2-mn2。不经过mncl2水溶液浸泡直接退火形成的样品标记为tio2。
34.涂层制备结束后，对纳米涂层的组成进行分析。如图1中的a所示的xrd图谱，三种
涂层的主要物相为锐钛矿型tio2，含有少量金红石型tio2。
35.对涂层的离子释放量进行分析，所用溶液为0.9wt.％的nacl，浸泡时间为1、4和7天。由如图1中的b所示的离子释放量可知，tio
2-mn1和tio
2-mn2随着浸泡时间延长，其mn
2
溶出量增加，并且tio
2-mn2较tio
2-mn1的离子溶出量更大。
36.由如图1中的c所示的sem照片可知，三种涂层的表面形貌皆为纳米线，纳米线的直径为20-60nm。eds测试结果显示，tio
2-mn1和tio
2-mn2中mn的含量分别为1.9wt.％、和3.9wt.％。
37.由如图2中的a所示的tem和元素面分布照片可知，mn元素均匀分布在纳米线表面，由如图2中的b所示的xps结果可知，纳米涂层中存在高价的mn
3
和mn
4
，可知掺杂的mn可以含高价态mn的氧化物的式存在于纳米线表面。由如图2中的c所示的xrd结果可知，mn掺杂使得锐钛矿的(101)晶面对应的衍射峰发生偏移，可知mn进入了tio2晶格内部，并改变了晶面间距。
38.b：mn
2
掺杂tio2纳米涂层促进神经细胞整联蛋白表达、细胞分化和神经肽分泌量检测
39.采用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤pc12细胞进行神经细胞相关实验。
40.(1)整联蛋白表达
41.将密度为2.5
×
105/孔的pc12细胞接种于灭菌的样品表面。培养3d后，使用trizol试剂盒(invitrogen，usa)提取rna，并用primescript rt试剂盒(takara，japan)通过rna逆转录产生cdna。采用9700型实时pcr系统(abi，usa)进行实时定量聚合酶链式反应，并记录实验结果。根据2-δδct
法对检测结果进行分析和计算。所测基因包括ita5和itb3。
42.(2)细胞分化检测
43.将pc12细胞以2
×
104/孔的密度接种于涂层表面。培养4d后，样品在4％的甲醛溶液中固定30min，使用pbs洗涤2次。随后将样品放入孔板，加入含有0.5％triton x-100的pbs室温破膜处理10min，随后使用bsa封闭液在37℃环境下处理1h，使用pbs清洗样品3次。加入β-tubulin一抗(tuj1，abcam，usa)，4℃孵育过夜，使用pbs清洗样品3次。加入二抗(alexa fluor 488，abcam，usa)，并室温下处理1h，使用pbs清洗样品3次。细胞核使用dapi(abcam，usa)避光染色5min，随后使用pbs清洗3次。采用荧光显微镜(leica，germany)对细胞进行观察拍照，使用image j软件对微管蛋白tubulin的荧光强度进行统计分析。
44.(3)cgrp神经肽分泌量
45.将密度为5
×
104/孔的pc12细胞接种于灭菌的样品表面。孵育2天后，采用elisa法检测培养液中cgrp的含量。
46.图3中的a和b为pc12细胞在不同样品表面培养3d后的整联蛋白基因表达结果，发现细胞内itga5和itgb3的基因表达量随着纳米涂层mn
2
溶出量的增加而增加，表明金属离子掺杂tio2纳米涂层溶出的mn
2
利于活化pc12细胞的整联蛋白。
47.微管蛋白是神经细胞分化的一种标志物，微管蛋白的形成对于维持神经轴突生长具有重要作用。图3中的c为pc12细胞在不同样品表面培养4d后微管蛋白tubulin的荧光强度统计结果。随着涂层mn
2
释放量增加，pc12细胞微管蛋白的荧光强度增加。以上实验结果证实了mn
2
能促进神经细胞分化和微管蛋白形成。
48.神经系统产生的神经肽在骨的生长与重建过程中发挥着重要的调节作用，cgrp是
一种活性较高的神经肽，也被认为是调节骨重建最重要的神经肽。图3中的d为不同样品表面pc12细胞的cgrp分泌量。随着涂层mn
2
溶出量增加，涂层表面细胞的cgrp表达量呈上升趋势，与细胞的分化趋势一致。
49.综上可知，mn
2
掺杂tio2涂层可通过溶出mn
2
活化pc12细胞的整联蛋白，进而促进其分化，并且分化程度较好的pc12细胞具备调控成骨细胞活性的潜能。
50.c：mn
2
掺杂tio2纳米涂层促进成骨细胞整联蛋白表达和细胞分化
51.采用小鼠前成骨细胞mc3t3-e1进行成骨细胞相关实验。
52.(1)整联蛋白表达量
53.将密度为5
×
103/孔的mc3t3-e1细胞接种于灭菌的样品表面(1cm
×
1cm)。培养2d后，弃去上清液，使用pbs清洗样品2次。加入质量体积比4％的多聚甲醛溶液固定15min，使用pbs清洗样品3次。使用bsa封闭液在37℃环境下处理1h。分别滴加100μl稀释度为1：100的ita5和itb1的抗体(cst，usa)进行染色。将样品取出，用pbs清洗3次，每组加入100μl稀释度为1：200的荧光二抗(cst，usa)，37℃孵育30min。随后采用clsm对细胞进行观察和拍照。使用image j软件对ita5和itb1的荧光强度进行统计分析。
54.(2)碱性磷酸酶(alp)活性
55.将mc3t3-e1细胞接种于灭菌的样品表面。孵育7d或14d后，分别向每孔加入200μl含0.2％triton x-100的pbs溶液，置于冰上裂解15min。随后将裂解的悬浮液离心处理5min，收集上清液，转移至96孔板。将50μl的上清液与150μl的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，pnpp)混合，在避光下培养10min。采用酶标仪测定上清液的od值。此外，使用bca法检测细胞内的总蛋白含量，alp活性以μm/min
·
g表示。
56.(3)细胞外基质矿化
57.将mc3t3-e1细胞接种于灭菌的样品表面。孵育14d和21d后，使用pbs洗涤样品2次，加入多聚甲醛溶液固定15min。随后加入茜素红染液(alizarin red，ars，sigma-aldrich)，在37℃下孵育30min，pbs洗涤3次后，每孔加入500μl的氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride，cpc，sigma-aldrich)溶液用于评价细胞的钙沉积量，室温下孵育15min。采用酶标仪测定上清液在590nm处的od值。
58.(4)骨钙蛋白(ocn)表达量
59.将密度为5
×
103/孔的mc3t3-e1细胞接种于灭菌的样品表面(1cm
×
1cm)。培养14d后，弃去上清液，使用pbs清洗样品2次。加入4％的多聚甲醛溶液固定15min，使用pbs清洗样品3次。使用bsa封闭液在37℃环境下处理1h。分别滴加100μl稀释度为1：100的ocn的抗体(cst，usa)进行染色。将样品取出，用pbs清洗3次，每组加入100μl稀释度为1：200的荧光二抗(cst，usa)，37℃孵育30min。随后采用clsm对细胞进行观察和拍照。使用image j软件对ocn的荧光强度进行统计分析。
60.图4中的a为前成骨细胞在材料表面培养2d后的整联蛋白α5和β1的荧光统计结果，发现细胞内itga5和itgb1的荧光强度随着纳米涂层mn
2
溶出量的增加而增加，表明金属离子掺杂tio2纳米涂层溶出的mn
2
利于活化mc3t3-e1细胞的整联蛋白。
61.图4中的b为前成骨细胞在材料表面培养7d和14d后的alp活性，结果显示细胞alp活性随着纳米涂层mn
2
溶出量的增加而逐渐增加。
62.图4中的c为前成骨细胞在材料表面培养14d和21d后的细胞外基质矿化结果，发现
不同纳米涂层表面的mc3t3-e1细胞矿化量呈现如下趋势：tio
2-mn2＞tio
2-mn1＞tio2，表明金属离子掺杂tio2纳米涂层溶出的mn
2
促进了mc3t3-e1细胞外基质矿化。
63.图4中的d为前成骨细胞在材料表面培养14d后ocn(成骨分化的晚期标志物)的荧光强度统计结果，发现细胞内ocn的荧光强度随着纳米涂层mn
2
溶出量的增加呈上升趋势，表明金属离子掺杂tio2纳米涂层溶出的mn
2
促进了mc3t3-e1细胞形成ocn。
64.因此，mn
2
掺杂tio2涂层可通过溶出mn
2
活化mc3t3-e1细胞的整联蛋白，进而促进其成骨分化。
65.实施例2
66.a：mg
2
掺杂tio2纳米涂层的制备
67.将砂纸打磨光滑的钛片置于氢氧化钠水溶液中，采用水热反应法，在钛片表面原位生长钛酸钠纳米涂层。水热反应法所用氢氧化钠水溶液体积为60ml，氢氧化钠水溶液浓度为1mol/l。水热反应时间为15h，水热反应温度为220℃。将水热反应制备的涂层采用离子交换法分别在盐酸溶液和mgcl2水溶液中浸泡一段时间后，采用高温退火法制备mg
2
掺杂tio2纳米涂层。盐酸浓度为0.1mol/l，浸泡时间为2h。mgcl2水浓度为0.1mol/l，浸泡时间为5h。退火温度为600℃，退火时间为1h。
68.采用同样的方式，但是省略mgcl2溶液浸泡过程，以制备未掺杂mg
2
的tio2纳米涂层。
69.所用mgcl2浓度为0.1mol/l和浸泡时间为5h以及退火形成的样品标记为tio
2-mg。不经过mgcl2浓度浸泡直接退火形成的样品标记为tio2。
70.如图5中的a所示的xrd图谱，tio
2-mg的主要物相为锐钛矿型tio2，含有少量金红石型tio2。
71.由如图5中的b所示的离子释放量可知，tio
2-mg随着浸泡时间延长，mg
2
的溶出量增加。
72.由如图5中的c所示的sem照片可知，tio
2-mg的表面形貌为纳米线，纳米线的直径为20-60nm。xps测试结果显示，tio
2-mg中mg的含量为1.5wt.％。
73.b：mg
2
掺杂tio2纳米涂层促进神经细胞整联蛋白表达、细胞分化和神经肽分泌量检测
74.所用神经细胞和相关实验步骤与实施例1相同。
75.图6中a和b为pc12细胞在不同样品表面培养3d后的整联蛋白基因表达结果。相比于tio2，tio
2-mg表面细胞内itga5和itgb3的基因表达量随着纳米涂层明显增加，表明tio
2-mg纳米涂层溶出的mg
2
利于活化pc12细胞的整联蛋白。
76.图6中的c为pc12细胞在不同样品表面培养4d后微管蛋白的荧光强度统计结果。相比于tio2，tio
2-mg表面pc12细胞微管蛋白的荧光强度增加，表明mg
2
能促进神经细胞分化和微管蛋白形成。
77.图6中的d为不同样品表面pc12细胞的cgrp分泌量。相比于tio2，tio
2-mg表面pc12细胞的cgrp表达量明显提升，与细胞的分化趋势一致。
78.综上可知，mg
2
掺杂tio2涂层可通过溶出mg
2
活化pc12细胞的整联蛋白，进而促进其分化，并且分化程度较好的pc12细胞具备调控成骨细胞活性的潜能。
79.c：mg
2
掺杂tio2纳米涂层促进成骨细胞整联蛋白表达和细胞分化
80.所用成骨细胞和相关实验步骤与实施例1相同。
81.图7中的a为前成骨细胞在材料表面培养2d后的整联蛋白α5和β1的荧光统计结果。相比于tio2，tio
2-mg表面细胞内itga5和itgb1的荧光强度增加，tio
2-mg纳米涂层溶出的mg
2
利于活化mc3t3-e1细胞的整联蛋白。
82.图7中的b为前成骨细胞在材料表面培养7d和14d后的alp活性，发现tio
2-mg表面细胞alp活性明显高于tio2。
83.图7中的c为前成骨细胞在材料表面培养14d和21d后的细胞外基质矿化结果，相比于tio2，tio
2-mg表面细胞的矿化量明显提升，表明tio
2-mg纳米涂层溶出的mg
2
促进了mc3t3-e1细胞外基质矿化。
84.图7中的d为前成骨细胞在材料表面培养14d后ocn的荧光强度统计结果，发现tio
2-mg表面细胞的荧光强度明显高于tio2，表明tio
2-mg纳米涂层可促进mc3t3-e1细胞形成ocn。
85.综上可知，mg
2
掺杂tio2涂层可通过溶出mg
2
活化mc3t3-e1细胞的整联蛋白，进而促进其成骨分化。