一株变形杆菌及其菌剂和在降解头孢类抗生素中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株变形杆菌及其菌剂和在降解头孢类抗生素中的应用。


背景技术：

2.现阶段抗生素可被用于人和动物的临床治疗，或者被直接添加到动物饲料中，其迅速发展为人类带来了很大的利益。抗生素是一类能在极低的浓度下抑制其他生物正常生命活动、破坏生态平衡的药物，可以由生物或化学合成。据估计，全球抗生素消费量是在10~20万吨/年之间，由于我国作为养殖大国，在养殖过程中投入抗生素是不可缺少的环节，因此中国的抗生素年消费量超过了2.5万吨，是抗生素消费大国，而抗生素的使用及不当排放刺激了arb和arg的迅速出现，对环境健康构成了重大潜在威胁，带来的环境问题不容小觑。
3.抗生素按化学结构可分为磺胺类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氯霉素、大环内酯类、四环素类等。调查发现2013年中国抗生素的生产量为24.8万吨，消耗的抗生素总量约为16.2万吨，人类消耗量大约占48%，其中β-内酰胺类的消耗比例最高占24%。β-内酰胺类又分为青霉素类和头孢霉素类等，头孢类抗生素是目前广泛使用的一种抗生素。
4.目前文献上已报道过几种细菌对头孢类抗生素具有降解效果，其中包括假单胞菌、鞘氨醇单胞菌和苍白杆菌。其中假单胞菌ce21和ce22在头孢氨苄质量浓度为1mg/l下培养24h，对头孢氨苄降解率可分别达到90%和46.7%；苍白杆菌在头孢氨苄质量浓度为10mg/l下培养36h，降解率可达100%。而本发明找到了一株既能够耐受高浓度头孢类抗生素还能快速实现其降解的微生物。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株既能耐受高浓度头孢类抗生素又可以高效降解头孢类抗生素的降解菌株。
6.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一株变形杆菌，菌株为变形杆菌（proteus sp.），菌株名为cw-1，于2022年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.25658。
7.一种上述的变形杆菌在降解头孢类抗生素中的应用，头孢类抗生素为头孢氨苄、头孢噻肟或头孢克洛中的一种或多种。
8.优选地，头孢类抗生素的浓度为25~500 mg/l，变形杆菌的投加量为0.5%~1.5%；降解温度为15~45℃，ph为6~10。
9.一种利用上述的变形杆菌制备的菌剂。
10.一种上述的菌剂在降解头孢类抗生素中的应用，头孢类抗生素为头孢氨苄、头孢噻肟、头孢霉素或头孢克洛中的一种或多种。
11.优选地，头孢类抗生素的浓度为25~500 mg/l，菌剂的投加量为0.5%~1.5%；降解温度为15~45℃，ph为6~10。
12.一种上述的菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：s1、制备lb液体培养基；s2、将变形杆菌接种至lb液体培养基中进行培养，即可获得菌剂。
13.优选地，步骤s1中，lb液体培养基的组分为：nacl5.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、去离子水补足至1000ml，121℃灭菌20 min。
14.优选地，步骤s2中，培养条件为：温度20~40℃，时间24~48h，ph 6~10。
15.本发明的有益之处在于：本发明分离得到的菌株能够以头孢类抗生素为唯一碳源，在头孢类抗生素初始浓度为200 mg/l的无机盐培养基培养26h后，降解率可达90%以上；在头孢类抗生素初始浓度为500 mg/l的无机盐培养基培养48h后，降解率可达90%以上；并且该菌株能耐碱生长，ph 在6~10范围内，菌株cw-1对头孢氨苄的降解率都能达到80%以上；该菌株的降解效果好，是一株可降解头孢类抗生素及耐受抗生素能力很强的菌株，对头孢类抗生素适应性强，在头孢类抗生素污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。
附图说明
16.图1是本发明的菌株cw-1生长的群落形态；图2是本发明的菌株cw-1的生长曲线；图3是本发明的菌株cw-1对各种头孢类抗生素的降解曲线图；图4是ph对菌株cw-1降解头孢氨苄的影响；图5是不同初始浓度条件对cw-1降解头孢氨苄的影响；图6是温度对菌株cw-1降解头孢氨苄的影响；图7是本发明的菌剂对实际生活污水的降解效果。
具体实施方式
17.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
18.实施例1菌株的分离、纯化和鉴定：采集南京城东生活污水处理厂的污水，取 1ml于超净台中转接至 100 ml lb液体培养基中，在30℃、150 r/min恒温振荡培养箱中振荡2d，设置不同质量浓度梯度的头孢类抗生素的 lb液体培养基中，每隔2d依次转接培养，直至培养基中头孢类抗生素的质量浓度为50mg/l，得到最终菌液培养液。将上述获得的最终菌液培养液以稀释平板法进行涂布分离，样品用lb固体培养基置于30℃温度下培养，表面形成明显的单菌落后，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并进行划线纯化，培养。最后根据它们各自对头孢类抗生素的降解效果确定出一株能够高效降解头孢类抗生素的菌株。
19.lb液体培养基的具体组分如下：nacl 5.0g、蛋白胨 10.0g、酵母粉 5.0g、去离子水补足至1000 m l，即得到lb液体培养基。在此基础上额外增添1.5%~2%的琼脂粉，即为lb固体培养基，121℃灭菌20 min。
20.该菌株经活化之后，在30℃，150 r/min有氧的条件下，在固体营养培养基制成的平板上生长24h后，能形成直径为0.3~0.5cm淡黄色、微微向上凸起的、不透明的菌落，其菌落图见图1。
21.目前，国内外尚无关于proteus降解β-内酰胺类抗生素的报道。菌株cw-1为一株具有降解β-内酰胺类抗生素功能的新菌株。
22.实施例2菌株cw-1的生长曲线：将待测菌株cw-1接入一只大试管的培养液中，在适宜的培养温度和良好的通气状态下，定时取出此试管，在600纳米波长处测定菌液浓度（od值），在一定的范围内，菌液浓度与光密度值成线性关系。因此，根据菌液的od值可以推知细菌生长繁殖的进程；将所测得的一组od值与其相应的培养时间作图，即可绘制出该菌的生长曲线，如附图2所示。具体步骤如下：（1）菌种预培养：取所筛菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入lb液体培养基中，静置培养12h，得到菌体培养液，备用；lb液体培养基的组分为：nacl5.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、去离子水补足至1000ml，121℃灭菌20 min；（2）接种：吸取1ml菌体培养液转入盛有100ml灭菌lb液体培养基的250ml三角瓶内，充分震荡使其混合均匀；（3）培养：将已接种菌液的三角瓶置摇床30℃、200rmp振荡培养，分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、20h，在相应时间取2ml菌液放入5ml无菌离心管并立即放冰箱中贮存，最后时刻一同比浊测定其光密度值。
23.由图2可见，菌株cw-1在20h达到对数生长期。
24.实施例3菌株cw-1对头孢类抗生素的降解效果：将上述鉴定为变形杆菌的菌株cw-1，以1%的接种量分别接种到含不同头孢类抗生素污染物（头孢氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢霉素）的无机盐降解培养基中，培养基中各污染物的浓度为200 mg/l，培养基组分为nacl 1.0g/l，(nh4)2so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，na2hpo4•
12h2o 3.0862g/l，mgso4•
7h2o 0.2g/l，去离子水（超纯水）补足至1000 ml，ph 7.0，121℃灭菌20 min，然后将装有污染物的培养基分别置于相同温度30℃、相同转速150r/min的条件下培养24h后测定各污染物含量，计算其降解率，结果如图3所示。
25.由图3可以看出，变形杆菌对头孢氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢霉素的降解率在24h均可达到80%以上，降解效果优异。
26.实施例4ph对菌株cw-1降解效果的影响：在不同ph的条件下，按1%（v/v）的接种量，将菌种cw-1的菌悬液接种至含200 mg/l头孢氨苄的降解培养基中，降解培养基的组分为nacl 1.0g/l，(nh4)2so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，na2hpo4•
12h2o 3.0862g/l，mgso4•
7h2o 0.2g/l，去离子水（超纯水）补足至1000 m l，ph 7.0，121℃灭菌20 min，；置于相同温度30℃、相同转速150r/min的条件下，进行培养24h，筛选出最佳的ph范围，结果如附图4所示。
27.由图4可以看出，ph在6~10范围内，菌株cw-1对浓度为200 mg/l的头孢氨苄的降解率能达到80%以上，效果显著，并且耐碱，在ph 11的条件下也有30%以上的降解率。
28.实施例5不同初始浓度对菌株cw-1降解效果的影响：
在头孢氨苄污染物不同污染物初始浓度的条件下，按1%（v/v）的接种量，将菌种cw-1的菌悬液分别接入降解培养基，降解培养基的组分为nacl 1.0g/l，(nh4)2so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，na2hpo4•
12h2o 3.0862g/l，mgso4•
7h2o 0.2g/l，去离子水（超纯水）补足至1000 m l，ph 7.0，121℃灭菌20 min，；置于相同温度30℃、相同转速150r/min的条件下，进行培养24h，观察不同的头孢氨苄污染物初始浓度对其降解的影响，结果如附图5所示。
29.由图5可以看出，菌株cw-1对浓度为200mg/l头孢氨苄的降解率在24h能达到85%以上，48h内能达到100%降解，对于浓度为500mg/l头孢氨苄的降解率在48h后，降解率可达90%以上，60h能达到100%，这可以说明菌株cw-1能耐受更高浓度的头孢氨苄，并能对高浓度的头孢氨苄进行降解。
30.实施例6温度对菌株cw-1降解效果的影响：将上述鉴定为变形杆菌的菌株cw-1，以1%的接种量接种至含头孢氨苄的无机盐培养基中，初始浓度为200 mg/l，ph为7，分别置于15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，150r/min摇床中培养，24h后测定污染物含量，计算其降解率，结果如图6所示。
31.由图6可以看出，在15~45℃范围内，ph为7.0，菌株cw-1对头孢氨苄的降解率均可以达到75%以上；在20~45℃范围内，ph为7.0，降解率均可以达到80%以上。可见，该菌株在15℃或者45℃的条件下，依然能保持优异的降解效果。
32.实施例7菌剂对实际生活污水的降解：处理水质来源为模拟的头孢类抗生素生产污水处理厂进水，处理量为20l，将变形杆菌制备的菌剂按照1%体积比的投加量投加到污水中，污水ph 7-8，对照组接种活性污泥，隔24h后取样测定计算其降解率，结果如图7所示。
33.模拟含头孢氨苄废水：头孢氨苄200 mg/l，氯化钠20g/l，nh4so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso4
.
7h2o 0.2g/l。
34.模拟含头孢克洛废水：头孢克洛200 mg/l，氯化钠20g/l，nh4so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso4
.
7h2o 0.2g/l。
35.模拟含头孢噻肟废水：头孢噻肟200 mg/l，氯化钠20g/l，nh4so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso4
.
7h2o 0.2g/l。
36.模拟含头孢霉素废水：头孢霉素200 mg/l，氯化钠20g/l，nh4so
4 1.0g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso4
.
7h2o 0.2g/l。
37.如图7所示，活性污泥对废水中污染物的降解效果不明显，去除率仅在10%左右，而投加cw-1生产的菌剂，可以有效去除废水中的头孢类抗生素，24h后降解率均在80%以上。因此，菌株cw-1可以运用到含头孢类抗生素的工业废水处理中。
38.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。