经取代的嘧啶和使用方法与流程

经取代的嘧啶和使用方法
1.交叉参考
2.本技术案主张于2020年3月31日提出申请的美国临时申请案第63/002,658号和于2021年3月1日提出申请的美国临时申请案第63/200,310号的权益，其各自以全文引用方式并入本文中。


背景技术：

3.人类纤维变性疾病(例如全身性硬化(ssc)、硬皮病样移植物抗宿主疾病、肾因性全身纤维化和辐射诱发的纤维化，以及心脏、肺、皮肤、肝、膀胱和肾纤维化)构成主要健康问题。由于缺乏可用的治疗，这些疾病通常进展为器官功能障碍，最终导致器官衰竭和死亡，此主要是因此失控的纤维化的病因学机制复杂、异质且难以破译。活化的肌纤维母细胞可负责用无功能的纤维变性组织替代正常组织。因此，负责刺激肌肌纤维母细胞中促纤维变性反应的信号传导路径具有作为靶标用于开发治疗纤维变性疾病的疗法的潜力。
4.正常组织修复涉及经由稳态调节机制的纤维变性反应。然而，不受控制的纤维化可导致细胞外基质(ecm)巨分子在间质空间中的过度沉积，此随时间而变硬。沿导致肌纤维母细胞活化的分子路径(包括(但不限于)转变生长因子-β(tgf-β)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导路径)存在许多位点。在本揭示内容中重要的是涉及转化生长因子-β(tgfβ)、tgf-β受体i(tgf-βri)和tgf-β受体ii(tgf-βrii)的路径。
5.tgf-β信号传导通常由tgf-β配体与tgf-βrii的结合引发。此进而可招募和磷酸化tgf-βri，也称为活化素受体样激酶5(alk5)。一旦磷酸化，alk5通常采取活性构象，并且自由地与smad2或smad3缔合并使其磷酸化。一旦磷酸化，smad 2和3蛋白然后可与smad4形成异二聚体复合物，其可跨越核膜易位并调节smad介导的基因表达，包括(例如)胶原的产生。smad蛋白是细胞内转录调节剂，并且因此可用作tgf-β调节的基因的调节剂，尤其涉及上皮和造血细胞中的细胞周期停滞、间充质细胞增殖和分化的控制、伤口愈合、细胞外基质产生、免疫抑制和诱癌作用。
6.alk5被认为是纤维变性过程中最相关的活化素样激酶(alk)(罗森布鲁姆(rosenbloom)等人，纤维化：方法和方案(fibrosis:methods and protocols),分子生物学方法(methods in molecular biology),2017,第1627卷，第1章，第1-21页)。已开发多种小分子以抑制alk5关于主要与肿瘤学相关的各种治疗适应症的活性(参见英林(yingling)等人，自然综述：药物发现(nature reviews:drug discovery)，2004年12月，第3卷，第1011-1022页)。


技术实现要素：

7.迄今为止所开发的alk5抑制剂的主要问题之一是在临床前安全性研究中这些分子与心室或心脏重塑相关，此是由于口服投与的显著全身暴露所致。根据上文，业内需要靶向alk5的小分子和所述化合物在治疗各种疾病(例如癌症和纤维化)中的用途，同时限制不利副作用。本揭示内容提供这些和其它相关优点。本揭示内容的一个目标是在最小全身暴
露的情况下局部递送强效alk5抑制剂，以解决在治疗期间alk5抑制的任何非所要和不需要的全身副作用。因此，在一些方面中，本揭示内容提供用于治疗特发性肺纤维化的吸入、长效和肺选择性的alk5抑制剂。本揭示内容的化合物可用于治疗其它疾病，包括(但不限于)肺纤维化、肝纤维化、肾小球硬化和癌症。本揭示内容的化合物可用作单一疗法或与其它疗法共同给药，无论是通过吸入、经口、静脉内、皮下或局部递送。
8.在某些方面中，本揭示内容提供式(i)化合物：
[0009][0010]
或其医药上可接受的盐，其中：
[0011]
a和b各自独立地选自c
3-12
碳环和3到12元杂环；
[0012]
ra在每次出现时独立地选自：
[0013]
卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)；
[0014]c1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、c
3-12
碳环和3到12元杂环；和
[0015]c3-12
碳环和3到12元杂环，
[0016]
其中ra中的每一c
3-12
碳环和3到12元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、r1、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-6
烯基和c
2-6
炔基；
[0017]
rb在每次出现时独立地选自卤素、-cn、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、-c(o)ch3、-oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2f、-chf2、-cf3、c
3-4
碳环和3到4元杂环；
[0018]
m和n各自独立地是0到3的整数；
[0019]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-12
碳环)和c
0-3
烷基-(3到12元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhch2ch3、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c
(ch3)3、c
3-12
碳环和3到6元杂环；且
[0020]
r2和r3与其连接的氮原子一起形成任选经一或多个r1取代的杂环。
[0021]
式(i)化合物可为式(i-a)化合物：
[0022][0023]
对于式(i)或(i-a)化合物，a可选自c
6-10
芳基和5到10元杂芳基。在一些实施例中，a选自苯基和5到6元杂芳基。在一些实施例中，a选自苯基、二氢茚基、噻唑基、噻吩基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吲唑基、苯并三唑基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并二噁烷基和四氢苯并氮呯基，例如a是苯基。在一些实施例中，a是噻唑基。在一些实施例中，a是噻吩基。在一些实施例中，a是吡啶基。
[0024]
式(i)化合物可为式(i-b)化合物：
[0025][0026]
式(i)化合物可为式(i-c)化合物：
[0027][0028]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，ra在每次出现时可独立地选自：
[0029]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0030]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0031]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0032]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、r1和c
1-6
烷基。
[0033]
在一些实施例中，对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，ra在每次出现时独立地选自：
[0034]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0035]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)or1、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0036]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0037]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2、r1和c
1-6
烷基。
[0038]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，ra在每次出现时可独立地选自：
[0039]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2；
[0040]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2和3到10元杂环；和
[0041]
3到10元杂环，
[0042]
其中ra中的每一3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2和r1。
[0043]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，ra在每次出现时可独立地选自：
[0044]-n(r1)2和-nr1c(o)r1；
[0045]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-6
烷基，其各自经4到8元杂环取代；和
[0046]
4到8元杂环，
[0047]
其中ra中的每一4到8元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-c(o)or1和r1。
[0048]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，ra可为-n(r1)2。在一些实施例中，ra是-nr1c(o)r1。在一些实施例中，ra是经4到8元杂环取代的c
1-6
烷基，其中4到8元杂环经-c(o)or1取代。在一些实施例中，ra是经4到8元杂环取代的-n(r1)-c
1-6
烷基。在一些实施例中，ra是4到8元杂环，其中4到8元杂环任选地经一或多个选自-c(o)or1和r1的取代基取代。
[0049]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，r1在每次出现时可独立地选自氢；和c
1-6
烷基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-8
碳环)和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-8
碳环和3到6元杂环。在一些实施例中，r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环。
[0050]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，m可为1或2，例如m为1。
[0051]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，b可选自c
6-10
芳基和5到10元杂芳基。在一些实施例中，b选自苯基和吡啶基。在一些实施例中，b是吡啶基，例如2-吡啶基。
[0052]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，rb在每次出现时可独立地选自卤素、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、-c(o)ch3、-oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2f、-chf2和-cf3。在一些实施例中，rb在每次出现时独立地选自卤素、-oh、-ch3和-chf2，例如-ch3。
[0053]
对于式(i)、(i-a)、(i-b)或(i-c)化合物，n可为1或2，例如n为1。
[0054]
式(i)化合物可为式(i-d)化合物：
[0055][0056]
式(i)化合物可为式(i-e)化合物：
[0057][0058]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0059]
a选自苯基和5到6元杂芳基；
[0060]
b是吡啶基；
[0061]
ra在每次出现时独立地选自：
[0062]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0063]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)or1、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0064]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0065]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2、r1和c
1-6
烷基；
[0066]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-8
碳环)和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-8
碳环和3到6元杂环；
[0067]
m为1或2；
[0068]
rb选自卤素、-oh、-ch3和-chf2；且
[0069]
n为1。
[0070]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0071]
a是苯基；
[0072]
b是吡啶基；
[0073]
ra在每次出现时独立地选自：
[0074]-n(r1)2和-nr1c(o)r1；
[0075]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-6
烷基，其各自经4到8元杂环取代；和
[0076]
4到8元杂环，
[0077]
其中ra中的每一4到8元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-c(o)or1和r1；
[0078]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0079]
m为1；
[0080]
rb是-ch3；且
[0081]
n为1。
[0082]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0083]
a是苯基；
[0084]
b是吡啶基；
[0085]
ra是经4到8元杂环取代的c
1-6
烷基，其中所述4到8元杂环经-c(o)or1取代；
[0086]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0087]
m为1；
[0088]
rb是-ch3；且
[0089]
n为1。
[0090]
在某些方面中，本揭示内容提供本文所揭示化合物的大体上纯的立体异构体。立体异构体可以至少90％对映异构过量提供。
[0091]
在某些方面中，本揭示内容提供选自表1的化合物。在一些实施例中，本揭示内容提供选自表2的化合物。
[0092]
在某些方面中，本揭示内容提供下式的偶联物：
[0093][0094]
其中：
[0095]a′
是抗体构筑体或靶向部分；
[0096]
l1是连接体；
[0097]d′
是本文所揭示化合物或盐；且
[0098]
p为1到20的整数。
[0099]
在某些方面中，本揭示内容提供包含本文所揭示化合物和医药上可接受的载剂的医药组合物。医药组合物可经调配用于吸入。
[0100]
在某些方面中，本揭示内容提供抑制alk5的方法，其包含使alk5与有效量的本文
所揭示化合物接触。在某些方面中，本揭示内容提供治疗个体的alk5介导的疾病或病况的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的本文所揭示化合物。在实践标的方法中的任一者中，疾病或病况可选自纤维化、脱发和癌症。在一些实施例中，疾病或病况是纤维化。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗纤维化的方法，其包含向患者投与治疗有效量的本文所揭示化合物。纤维化可选自全身性硬化、肾因性全身纤维化、器官特异性纤维化、与癌症相关的纤维化、囊性纤维化和与自体免疫疾病相关的纤维化。任选地，器官特异性纤维化选自心脏纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、门静脉纤维化、皮肤纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜纤维化、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。在一些实施例中，器官特异性纤维化是肠纤维化。任选地，肺纤维化选自特发性肺纤维化(ipf)、家族性肺纤维化(fpf)、间质肺纤维化、与气喘相关的纤维化、与慢性阻塞性肺病(copd)相关的纤维化、二氧化硅诱发的纤维化、石棉诱发的纤维化和化学疗法诱发的肺纤维化。任选地，肺纤维化是特发性肺纤维化(ipf)。在一些实施例中，肺纤维化是由病毒感染诱发。
[0101]
在实践标的方法中的任一者中，疾病或病况可为癌症，任选地其中癌症选自乳癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、神经胶母细胞瘤、黑色素瘤和胰脏癌。在一些实施例中，癌症是肺癌、任选地非小细胞肺癌。本揭示内容的方法可进一步包含投与第二治疗剂。任选地，第二治疗剂是免疫治疗剂，例如pd-1抑制剂或ctla-4抑制剂。在一些实施例中，免疫治疗剂选自派姆单抗(pembrolizumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。本揭示内容的方法可进一步包含投与有效量的辐射。在实践标的方法中的任一者中，本文所揭示化合物或盐可通过吸入投与。
[0102]
在某些方面中，本揭示内容提供用于治疗纤维化的本文所揭示化合物。在某些方面中，本揭示内容提供本文所揭示化合物用于制造用于治疗纤维化的药剂的用途。
[0103]
以引用方式并入
[0104]
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请案都以引用方式并入本文中，其并入程度如同明确地且单独地指出将每一个别出版物或专利申请案以引用方式并入一般。
具体实施方式
[0105]
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与熟习本揭示内容所属技术者通常所理解相同的意义。
[0106]
在本文中根据iupac惯例来命名化学结构，如在软件(珀金埃尔默公司(perkin elmer,inc.)，剑桥(cambridge),马萨诸塞州(ma))中所实施。
[0107]
除非上下文明确指示其它含义，否则说明书和权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括多个指示物。
[0108]
术语“c
x-y”或“c
x-c
y”在连同化学部分(例如烷基、烯基或炔基)一起使用时打算包括在链中含有x到y个碳的基团。举例来说，术语“c
x-y
烷基”是指在链中含有x到y个碳的经取代或未经取代的饱和烃基团，包括直链烷基和具支链烷基。
[0109]“烷基”是指经取代或未经取代的饱和烃基团，包括直链和具支链烷基。烷基可含有1到12个碳原子(例如c
1-12
烷基)，例如1到8个碳原子(c
1-8
烷基)或1到6个碳原子(c
1-6
烷基)。实例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。烷基通过单键连接到分子的其余部分。除非在
本说明书中另外明确陈述，否则烷基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0110]“卤代烷基”是指由一或多个卤素取代的烷基。实例性卤代烷基包括三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基和1,2-二溴乙基。
[0111]“烯基”是指含有至少一个双键的经取代或未经取代的烃基团，包括直链和具支链烯基。烯基可含有2到12个碳原子(例如c
2-12
烯基)、例如2到8个碳原子(c
2-8
烯基)或2到6个碳原子(c
2-6
烯基)。实例性烯基包括乙烯基(ethenyl)(即，乙烯基(vinyl))、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非在本说明书中另外明确陈述，否则烯基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0112]“炔基”是指含有至少一个三键的经取代或未经取代的烃基团，包括直链和具支链炔基。炔基可含有2到12个碳原子(例如c
2-12
炔基)、例如2到8个碳原子(c
2-8
炔基)或2到6个碳原子(c
2-6
炔基)。实例性炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在本说明书中另外明确陈述，否则炔基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0113]“亚烷基”或“亚烷基链”是指经取代或未经取代的二价饱和烃基团，包括直链亚烷基和具支链亚烷基，其含有1到12个碳原子(例如c
1-12
亚烷基)，例如1到8个碳原子(c
1-8
亚烷基)或1到6个碳原子(c
1-6
亚烷基)。实例性亚烷基包括亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚正丁基。类似地，“亚烯基”和“亚炔基”是指分别包含一或多个碳-碳双键或三键的如上文所定义的亚烷基。亚烷基、亚烯基或亚炔基链与分子的其余部分的连接点可经由链的一个碳或任两个碳实现。除非在本说明书中另外明确陈述，否则亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0114]“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”分别是指经取代或未经取代的烷基、烯基和炔基，其中一或多个(例如1、2或3个)碳原子经杂原子(例如o、n、p、si、s或其组合)置换。链中存在的任何氮、磷和硫杂原子可任选地经氧化，并且任何氮杂原子可任选地经季铵化。如果给出，数值范围是指链总长度。举例来说，3到8元杂烷基具有3到8个原子的链长度。与分子的其余部分的连结可经由杂烷基、杂烯基或杂炔基链中的杂原子或碳实现。除非在本说明书中另外明确陈述，否则杂烷基、杂烯基或杂炔基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0115]“亚杂烷基”、“亚杂烯基”和“亚杂炔基”分别是指经取代或未经取代的亚烷基、亚烯基和亚炔基，其中一或多个(例如1、2或3个)碳原子经杂原子(例如o、n、p、si、s或其组合)置换。链中存在的任何氮、磷和硫杂原子可任选地经氧化，并且任何氮杂原子可任选地经季铵化。如果给出，数值范围是指链总长度。举例来说，3到8元亚杂烷基具有3到8个原子的链长度。亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基链与分子的其余部分的连接点可经由亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基链中的一个杂原子或一个碳、或任两个杂原子、任两个碳、或任一个杂原子和任一个碳来实现。除非在本说明书中另外明确陈述，否则亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0116]“碳环”是指饱和、不饱和或芳香族环，其中环的每一原子是碳原子。碳环可包括c
3-10
单环、c
6-12
二环、c
6-12
螺环和c
6-12
桥接环。二环碳环的每一环可选自饱和、不饱和和芳香族环。在一些实施例中，碳环是c
6-12
芳基、例如c
6-10
芳基。在一些实施例中，碳环是c
6-12
环烷
基。在一些实施例中，碳环是c
6-12
环烯基。在实例性实施例中，芳香族环(例如苯基)可稠合到饱和或不饱和环，例如环己烷、环戊烷或环己烯。在化合价容许的情况下，饱和、不饱和及芳香族二环的任何组合都包括在碳环的定义中。实例性碳环包括环戊基、环己基、环己烯基、金刚烷基、苯基、二氢茚基和萘基。除非在本说明书中另外明确陈述，否则碳环任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0117]“杂环”是指包含一或多个杂原子、例如1、2或3个选自o、s和n的杂原子的饱和、不饱和或芳香族环。杂环包括3到10元单环、6到12元二环、6到12元螺环和6到12元桥接环。二环杂环的每一环可选自饱和、不饱和和芳香族环。在化合价容许的情况下，杂环可经由杂环的任何原子(例如杂环的碳或氮原子)连接到分子的其余部分。在一些实施例中，杂环是5到10元杂芳基、例如5或6元杂芳基。在一些实施例中，杂环是3到12元杂环烷基。在实例性实施例中，杂环(例如吡啶基)可稠合到饱和或不饱和环，例如环己烷、环戊烷或环己烯。实例性杂环包括吡咯烷基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、哌啶基、吡啶基、嘧啶基、嗒嗪基、吡嗪基、噻吩基、噁唑基、噻唑基、吗啉基、吲唑基、吲哚基和喹啉基。除非在本说明书中另外明确陈述，否则杂环任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0118]“杂芳基”是指包含至少一个杂原子、例如1、2或3个选自o、s和n的杂原子的5到12元芳香族环。如本文所用，杂芳基环可选自单环或二环(包括稠合、螺环和桥接环系统)，其中环系统中的至少一个环是芳香族。杂芳基中的杂原子可任选地经氧化。一或多个氮原子(如果存在)任选地经季铵化。在化合价容许的情况下，杂芳基可经由杂芳基的任何原子(例如杂芳基的碳或氮原子)连接到分子的其余部分。杂芳基的实例包括(但不限于)氮呯基、苯并咪唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、呋喃基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、嗒嗪基、嗒唑基(pyridazolyl)、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喏啉基、四氢喹啉基、噻二唑基、噻唑基和噻吩基。除非在本说明书中另外明确陈述，否则杂芳基任选地经一或多个取代基(例如本文所述的那些取代基)取代。
[0119]
除非另外陈述，否则氢原子隐含在本文所绘示的结构中以在需要时满足化合价要求。
[0120]
跨越键绘制的波浪线或虚线键在本文中可互换使用，以表示发生键断开或连接的地方。举例来说，在结构中，ra经由单键连接到氟苯基环的对位。如果ra是如中的2-吡啶，那么ra可绘示为或
[0121]
术语“经取代”是指具有置换结构的一或多个碳或杂原子上的氢的取代基的部分。应理解，“取代”或“经取代”包括隐含前提，也就是此取代应与经取代原子和取代基的容许化合价一致，并且所述取代会产生稳定化合物，例如，其不会自发地进行变换(例如通过重排、环化、消除等)。如本文所用，考虑术语“经取代”包括有机化合物的所有容许取代基。广义上，所述容许取代基包括有机化合物的非环状和环状、具支链和无支链、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。对于适当有机化合物来说，所述容许取代基可为一或多个且可相同或不同。出于本揭示内容的目的，杂原子(例如氮)可具有满足杂原子的化合价的本文所
述有机化合物的任何容许取代基。
[0122]
本文所揭示化合物(例如式(i)化合物)任选地由一或多个、例如1、2或3个选自以下的取代基取代：
[0123]
卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)；
[0124]c1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、c
3-12
碳环和3到12元杂环；和
[0125]c3-12
碳环和3到12元杂环，
[0126]
其中每一c
3-12
碳环和3到12元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、r1、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-6
烯基和c
2-6
炔基；
[0127]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-12
碳环)和c
0-3
烷基-(3到12元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhch2ch3、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-12
碳环和3到6元杂环；且
[0128]
r2和r3与其连接的氮原子一起形成任选经一或多个r1取代的杂环。
[0129]
在一些实施例中，本文所揭示化合物(例如式(i)化合物)任选地由一或多个、例如1、2或3个选自以下的取代基取代：
[0130]
卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)；
[0131]c1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、＝o、＝s、＝n(r1)、c
3-12
碳环和3到12元杂环；和
[0132]c3-12
碳环和3到12元杂环，
[0133]
其中每一c
3-12
碳环和3到12元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、＝o、＝s、＝n(r1)、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-6
烯基和c
2-6
炔基；
[0134]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-12
碳环)和c
0-3
烷基-(3到12元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhch2ch3、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-12
碳环和3到6元杂环；且
[0135]
r2和r3与其连接的氮原子一起形成任选经一或多个r1取代的杂环。
[0136]
在一些实施例中，本文所揭示化合物(例如式(i)化合物)任选地由一或多个、例如1、2或3个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、＝o、-oh、-och3和-och2ch3；和c
1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基、1到6元杂烷基、c
3-12
碳环及3到12元杂环，其各自任选地由卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、＝o、-oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-12
碳环或3到6元杂环取代。
[0137]
所属领域技术人员应理解，如果适当，那么取代基自身可经取代。除非特定陈述为“未经取代”，否则在本文中所提到的化学部分应理解为包括经取代的变化形式。举例来说，对“杂芳基”或部分的提及隐含地包括经取代和未经取代的变化形式二者。
[0138]
在二价取代基在本文中由从左到右书写的其常规化学式指定的情形下，其打算涵盖由从右到左书写结构产生的异构体，例如-ch2o-还打算涵盖-och
2-。
[0139]“可选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所述说明包括事件或情况发生的情况以及事件或情况不发生的情况。举例来说，“任选地经取代”基团可未经取代或经取代。
[0140]
本揭示内容的化合物还包括那些化合物、医药上可接受的盐和具有相同类型的活性的活性代谢物的结晶和非晶型，包括(例如)化合物的多晶型、伪多晶型、溶剂合物、水合物、非溶剂化多晶型(包括无水物)、构象多晶型、非晶型和其混合物。
[0141]
本文所述化合物可展现其天然同位素丰度，或一或多个原子可以人工方式在具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于主要在自然界中发现的原子质量或质量数的特定同位素富集。本揭示内容的化合物的所有同位素变化形式(无论具有放射性抑或不具放射性)都涵盖在本揭示内容的范围内。举例来说，氢具有三种天然同位素，表示为1h(氕)、2h(氘)和3h(氚)。氕是自然界中最丰富的氢的同位素。富集氘可提供某些治疗优点，例如延长活体内半衰期和/或暴露，或可提供可用于研究活体内药物消除和代谢途径的化合物。可纳入本揭示内容的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
18
o、
17
o、
35
s、
36
cl和
18
f。尤其关注以下化合物：富含氚或碳-14的式(i)化合物，其可用于(例如)组织分布研究中；尤其在代谢位点处富含氘的本揭示内容的化合物，从而产生(例如)具有较大代谢稳定性的化合物；和富含正电子发射同位素(例如
11
c、
18
f、
15
o和
13
n)的式(i)化合物，其可用于(例如)正电子发射断层扫描(pet)研究中。同位素富集的化合物可通过所属领域技术人员熟知的常规技术来制备。
[0142]
如本文所用，短语“式”或“具有式”或“具有结构”并不打算具有限制性，并且以与通常使用术语“包含”相同的方式使用。举例来说，如果绘示一种结构，那么应理解，除非另有陈述，否则涵盖所有立体异构体和互变异构体形式。
[0143]
本文所述的某些化合物含有一或多个不对称中心且可由此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构体形式，其的不对称中心可根据绝对立体化学定义为(r)-或(s)-。在一些实施例中，为了最优化本揭示内容的化合物的治疗活性以例如治疗纤维化，可
希望碳原子具有特定构象(例如(r,r)、(s,s)、(s,r)或(r,s))或富含具有所述构象的立体异构形式。本揭示内容的化合物可提供为外消旋混合物。另外，除非另外指示，否则本揭示内容涉及外消旋混合物、纯立体异构体(例如对映异构体和非对映异构体)、富含立体异构体的混合物等。在本文中绘示化学结构而无任何立体化学时，应理解，所述结构涵盖所有可能的立体异构体。类似地，在本文中显示或命名特定立体异构体时，所属领域技术人员应理解，除非另外指示，否则在本揭示内容的组合物中可存在少量其它立体异构体，前提是所述其它异构体的存在不会消除所述组合物作为整体的效用。个别立体异构体可通过业内已知的各种方法来获得，包括使用手性合成子或手性试剂制备、使用利用适宜手性固定相或载体的手性色谱拆分、或通过以化学方式将其转化成非对映异构体、通过常规方式(例如色谱或重结晶)分离非对映异构体、然后再生成原始立体异构体。
[0144]
另外，除非另外规定，否则在适用的情形中，本发明的化合物的所有顺式-反式或e/z异构体(几何异构体)、互变异构形式和拓扑异构形式都包括在本发明的范围内。
[0145]
如本文所用，术语“互变异构体”是指平衡存在且容易相互转化的化合物的两种或更多种异构体中的每一者。举例来说，所属领域技术人员应容易地理解，1,2,3-三唑以两种互变异构形式存在：
[0146][0147]
除非另外规定，否则本文所述的化学实体打算包括所有可能的互变异构体，甚至在结构仅绘示其中之一时。
[0148]
术语“医药上可接受的”是指在用于标的组合物和方法时在生物学上或在其它方面可接受的材料。举例来说，术语“医药上可接受的载剂”是指可纳入组合物中且投与给患者而不引起不可接受的生物效应或以不可接受的方式与组合物的其它组分相互作用的材料，例如佐剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。所述医药上可接受的材料通常符合毒理学和制造测试所要求的标准，并且包括由美国食品药品管理局(u.s.food and drug administration)鉴别为适宜非活性成分的那些材料。
[0149]
术语“盐”和“医药上可接受的盐”是指从碱或酸制备的盐。医药上可接受的盐适于投与给患者，例如哺乳动物(例如，对于给定剂量方案，具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。盐可从无机碱、有机碱、无机酸和有机酸形成。另外，在化合物含有碱性部分(例如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(例如羧酸或四唑)时，可形成两性离子且包括在如本文所用的术语“盐”内。衍生自无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。衍生自有机碱的盐包括以下碱的盐：伯胺、仲胺和叔胺，包括经取代的胺、环状胺、天然胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因(caffeine)、胆碱、n,n
’‑
二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。衍生自无机酸的盐包括硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸的盐。衍生自有机酸的盐包括以下酸的盐：脂肪族羟基酸
(例如柠檬酸、葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖醛酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如天门冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、苦杏仁酸、粘酸、烟碱酸、乳清酸、帕莫酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、羟萘甲酸等。
[0150]
术语“治疗有效量”是指当向有需要的个体投与时足以影响治疗的本文所述化合物的量。举例来说，治疗肺纤维化的治疗有效量是(例如)减少、抑制、消除或预防个体中纤维化的形成或治疗肺纤维化的潜在病因所需的化合物的量。治疗有效量可根据预期治疗应用(活体内)或所治疗的个体和疾病病况(例如，个体的体重和年龄、疾病病况的严重程度、投与方式等)而变化，其可容易地由所属领域技术人员来确定。特定剂量将根据所选特定化合物、所遵循的投用方案、其是否与其它化合物组合投与、投与时间、其所投与的组织和携载其的物理递送系统而变化。术语“有效量”是指足以获得所需结果的量，所述结果可能不一定为治疗结果。举例来说，“有效量”可为抑制酶所需的量。
[0151]
如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”)是指用于获得关于个体的疾病、病症或医学病况(例如肺纤维化)的有益或所需结果的方法，其包括(但不限于)以下：(a)预防疾病或医学病况发生，例如预防疾病或医学病况的复发或对易患疾病或医学病况的个体的预防性治疗；(b)改善疾病或医学病况，例如消除个体的疾病或医学病况或使其消退；(c)抑制疾病或医学病况，例如减缓或停止个体的疾病或医学病况的发展；或(d)缓和个体的疾病或医学病况的症状。举例来说，“治疗肺纤维化”将包括防止纤维化发生、改善纤维化、抑制纤维化和缓和纤维化的症状(例如，增加血液中的氧含量或改善肺功能测试)。同样，通过根除或改善一或多种与潜在病症相关的生理症状来实现治疗益处，使得在个体中观察到改良，但个体可能仍受到潜在病症的折磨。
[0152]
如本文所用，术语“治疗效应”涵盖如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防效应包括延迟或消除疾病或病况的出现；延迟或消除疾病或病况的症状的发作；减缓、停止或逆转疾病或病况的进展；或其任一组合。
[0153]
术语“拮抗剂”和“抑制剂”可互换使用，并且其是指具有抑制靶标蛋白(例如alk5)的生物学功能(例如活性、表达、结合、蛋白-蛋白相互作用)的能力的化合物。因此，术语“拮抗剂”和“抑制剂”定义于靶标蛋白的生物学作用的上下文中。尽管本文中的优选拮抗剂特异性地与靶标相互作用(例如结合)，但通过与信号转导路径的其它成员(其中靶标蛋白是成员)相互作用而抑制靶标蛋白的生物活性的化合物也特别地包括在所述定义内。
[0154]
术语“选择性抑制”(“selective inhibition”或“selectively inhibit”)是指生物活性剂经由与靶标直接或间接相互作用，与脱靶信号传导活性相比，优先降低靶标信号传导活性的能力。
[0155]
如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合特定抗原或对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。抗体可为(例如)多克隆、单克隆、遗传工程化或其抗原结合片段，并且另外可为(例如)鼠类、嵌合、人类化、异源偶联物、双特异性、双价抗体、三价抗体或四价抗体。抗原结合片段包括抗原结合结构域且可呈(例如)fab’、f(ab’)2、fab、fv、rigg、scfv、
hcabs(重链抗体)、单一结构域抗体、v
hh
、v
nar
、sdab或纳米抗体的形式。
[0156]
如本文所用的术语“抗原结合结构域”是指与抗原结合的分子的区。抗原结合结构域可为抗体或抗体片段的抗原结合部分。抗原结合结构域可为保留特异性结合抗原的能力的抗体的一或多个片段。抗原结合结构域可为抗原结合片段，并且可识别单一抗原、两个抗原、三个抗原或更多个抗原。如本文所用，关于抗体相互作用的“识别”是指抗体或其部分的抗原结合结构域与抗原之间的缔合或结合。
[0157]“抗体构筑体”是指含有抗原结合结构域和fc结构域(例如，来自fc区内的fc结构域)的分子，例如蛋白质、肽、抗体或其部分。抗体构筑体可识别(例如)一个抗原或多个抗原。
[0158]“靶向部分”是指相对于其它非靶标分子对靶标分子具有选择性亲和力的结构。靶向部分结合到靶标分子。靶向部分可包括抗体、肽、配体、受体或其结合部分。靶标生物分子可为生物受体或细胞的其它结构，例如肿瘤抗原。
[0159]
术语“个体”和“患者”是指动物，例如哺乳动物，例如人类。本文所述的方法可用于人类治疗和兽医应用。在一些实施例中，个体是哺乳动物，并且在一些实施例中，个体是人类。“哺乳动物”包括人类和家畜(例如实验室动物和家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔))和非家畜(例如野生动物)等。
[0160]“前药”打算指在生理条件下或通过溶剂分解可转化为本文所述的生物活性化合物的化合物(例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物)。因此，术语“前药”是指医药上可接受的生物活性化合物的前体。在一些方面中，前药在投与给个体时是无活性的，但例如通过水解在活体内转化为活性化合物。前药化合物通常提供在哺乳动物有机体中的溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见例如邦加德,h.(bundgard,h.),前药设计(design of prodrugs)(1985),第7-9、21-24页(爱思唯尔(elsevier),阿姆斯特丹(amsterdam))；希古契,t.(higuchi,t.)等人，“作为新颖递送系统的前药(pro-drugs as novel delivery systems),”(1987)a.c.s.研讨会系列(a.c.s.symposium series),第14卷；和药物设计中的生物可逆性载剂(bioreversible carriers in drug design),编辑爱德华
·b·
罗氏(edward b.roche),美国制药协会和佩加蒙出版社(american pharmaceutical association and pergamon press))，其每一者都以引用方式全部并入本文中。术语“前药”还打算包括任何共价键结的载剂，当向哺乳动物个体投与此前药时，所述载剂在活体内释放活性化合物。如本文所述，活性化合物的前药通常是通过以下列方式修饰活性化合物中存在的官能团来制备：在常规操作中或在活体内将修饰物解离成母体活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基键结到任何基团的化合物，当向哺乳动物个体投与活性化合物的前药时，所述基团解离而分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括(但不限于)羟基官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物；或活性化合物中胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。
[0161]
术语“活体内”是指在个体体内发生的事件。
[0162]
术语“活体外”是指在个体体外发生的事件。举例来说，活体外分析涵盖在个体外部允许的任何分析。活体外分析涵盖基于细胞的分析，其中使用活的或死的细胞。活体外分析还涵盖其中不采用完整细胞的无细胞分析。
[0163]
本揭示内容还打算涵盖所揭示的化合物的活体内代谢产物。所述产物可由(例如)
所投与化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生，主要是由于酶促过程。因此，本揭示内容包括通过包含向哺乳动物投与本揭示内容的化合物达足以产生其代谢产物的时间段的方法产生的化合物。通常通过向动物(例如大鼠、小鼠、天竺鼠、猴)或人类投与可检测剂量的经放射性标记的本揭示内容的化合物、使代谢发生足够时间及从尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物，来鉴别所述产物。
[0164]
肺功能测试包括检查肺的工作情况如何的测试。例如，肺活量测量法测量肺部能够容纳的空气量以及能够从肺部排空空气的力度。用力呼气容积(fev)是人在用力呼吸期间可呼出的空气量的量度。举例来说，fev1是人在一秒内可从其肺中排出的空气量。用力肺活量(fvc)是fev测试期间呼出的空气的总量。fev1/fvc的比率(也称为气流指数或蒂芬欧-皮内利(tiffeneau-pinelli)指数)是用于评价患者肺功能健康的量度。小于80％的比率指示肺中存在阻塞性缺陷，例如慢性阻塞性肺病(copd)。大于80％的比率指示肺中存在限制性缺陷，例如肺纤维化。限制性肺病中＞80％的比率是由于fev1和fvc两者都降低，但fvc的下降大于fev1的下降，导致高于80％的值。
[0165]
术语“转变生长因子-β”也可称为tgfβ、转变生长因子β-1或tgf-β-1。其还被裂解成潜在相关肽(lap)。
[0166]
术语“tgf-β受体ii”也可称作tβrii、ii型tgf-β受体、tgf-βrii、tgf-β受体-2型、tgfr-2、tgf-βii型受体、转变生长因子-β受体ii型、tgf-β受体ii型或tβr-ii。
[0167]
术语“tgf-β受体i”也可称作tβri、i型tgf-β受体、tgf-βri、tgf-β受体-1型、tgfr-1、53kd的活化素a受体ii型样蛋白激酶、活化素受体样激酶5、alk-5、alk5、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶受体r4、skr4、tgf-βi型受体、转变生长因子-β受体i型、tgf-β受体i型、转变生长因子β受体i、tgf-β受体1或tβr-i。
[0168]
本揭示内容提供能够选择性结合和/或调节alk5的化合物。在一些实施例中，化合物通过与一或多个氨基酸和/或一或多个金属离子结合或相互作用来调节alk5。这些化合物的结合可破坏alk5下游信号传导。
[0169]
在某些方面中，本揭示内容提供式(i’)化合物：
[0170][0171]
或其医药上可接受的盐，其中：
[0172]
a和b各自独立地选自c
3-12
碳环和3到12元杂环；
[0173]
x1选自ch、crd、n和s；
[0174]
x2和x3各自独立地选自ch、cre、n和s；
[0175]
x4选自键、ch、cre、n和s，条件是x2、x3和x4中不超过一者是s；
[0176]
ra、rb、rc、rd和re在每次出现时各自独立地选自：
[0177]
卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)
or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)；
[0178]c1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、c
3-12
碳环和3到12元杂环；和
[0179]c3-12
碳环和3到12元杂环，
[0180]
其中ra、rb、rc、rd和re中的每一c
3-12
碳环和3到12元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、r1、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-6
烯基和c
2-6
炔基；
[0181]
或两个rb基团、两个rc基团或两个re基团可一起任选地形成桥或环；
[0182]
m和n各自独立地是0到3的整数；
[0183]
p为0到2的整数；
[0184]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-12
碳环)和c
0-3
烷基-(3到12元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhch2ch3、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-12
碳环和3到6元杂环；且
[0185]
r2和r3与其连接的氮原子一起形成任选经一或多个r1取代的杂环。
[0186]
在一些实施例中，对于式(i’)化合物，rb、rc、rd和re在每次出现时各自独立地选自卤素、-cn、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、-c(o)ch3、-oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2f、-chf2、-cf3、c
3-4
碳环和3到4元杂环；或两个rc基团或两个re基团可一起任选地形成桥或环。
[0187]
在一些实施例中，对于式(i’)化合物，p是0或1，例如p是0。在一些实施例中，rc选自卤素、-nh2和-ch3。在一些实施例中，x1选自ch和n，例如x1是n。在一些实施例中，x2选自ch、cre、n和s，例如x2是n。在一些实施例中，x2选自ch和cre，其中re选自-cn、-och3和-ch3。在一些实施例中，x3选自ch和cre，例如x3是ch。在一些实施例中，x3是cre，其中re是-och3。
[0188]
在一些实施例中，x4选自键、ch、cre和n，例如x4是ch。在一些实施例中，x4是n。在一些实施例中，x3和x4各自独立地是cre，其中两个re基团形成环、例如5或6元芳基或杂芳基环。非限制性实例(其中x3和x4各自独立地是cre，其中两个re基团形成环)包括：在一些实施例
中，x4是键(即，)。非限制性实例(其中x4是键)包括：是键)包括：
[0189]
在一些实施例中，式(i’)化合物是式(i
’‑
a)、(i
’‑
b)、(i
’‑
c)、(i
’‑
d)或(i
’‑
e)化合物：
[0190][0191]
在某些方面中，本揭示内容提供式(i)化合物：
[0192][0193]
或其医药上可接受的盐，其中：
[0194]
a和b各自独立地选自c
3-12
碳环和3到12元杂环；
[0195]
ra在每次出现时独立地选自：
[0196]
卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)；
[0197]c1-10
烷基、c
2-10
烯基、c
2-10
炔基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、c
3-12
碳环和3到12元杂环；和
[0198]c3-12
碳环和3到12元杂环，
[0199]
其中ra中的每一c
3-12
碳环和3到12元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-no2、-cn、-or1、-sr1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-nr2r3、-s(＝o)r1、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2nr2r3、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-oc(o)r1、-oc(o)or1、-oc(o)n(r1)2、-oc(o)nr2r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-nr1c(o)n(r1)2、-nr1c(o)nr2r3、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、-p(o)(or1)2、-p(o)(r1)2、＝o、＝s、＝n(r1)、r1、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
2-6
烯基和c
2-6
炔基；
[0200]
rb在每次出现时独立地选自卤素、-cn、-nh2、-nhch3、-nhch2ch3、-c(o)ch3、-oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2f、-chf2、-cf3、c
3-4
碳环和3到4元杂环；
[0201]
m和n各自独立地是0到3的整数；
[0202]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-12
碳环)和c
0-3
烷基-(3到12元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-cn、-no2、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhch2ch3、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-12
碳环和3到6元杂环；且
[0203]
r2和r3与其连接的氮原子一起形成任选经一或多个r1取代的杂环。
[0204]
在一些实施例中，式(i)化合物是式(i-a)、(i-b)、(i-c)、(i-d)或(i-e)化合物：
[0205][0206]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)或(i
’‑
a)化合物，a选自c
6-10
芳基和5到10元杂芳基。在一些实施例中，a选自苯基和5到6元杂芳基，例如a是苯基。在一些实施例中，a选自苯基、二氢茚基、噻唑基、噻吩基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吲唑基、苯并三唑基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并二噁烷基和四氢苯并氮呯基。在一些实施例中，a选自苯基、吡啶基、噻唑基和噻吩基。在一些实施例中，a是苯基。在一些实施例中，a是吡啶基。在一些实施例中，a是噻唑基。在一些实施例中，a是噻吩基。
[0207]
在一些实施例中，式(i)化合物是下式化合物：
[0208]
例如
[0209]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)或(i
’‑
a)化合物，m为1或2。在一些实施例中，m为1。在一些实施例中，a是c6芳基或6-元杂芳基，m为1且ra在间位或对位。
[0210]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物，ra在每次出现时独立地选自：
[0211]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0212]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0213]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0214]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：卤素、-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3、r1和c
1-6
烷基。
[0215]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物，ra在每次出现时独立地选自：
[0216]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-s(＝o)2nr2r3、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0217]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)or1、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0218]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0219]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2、r1和c
1-6
烷基。
[0220]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物，ra在每次出现时独立地选自：
[0221]
卤素、-or1、-n(r1)2、-s(＝o)2r1、-s(＝o)2n(r1)2、-nr1s(＝o)2r1、-nr1s(＝o)2n
(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2；
[0222]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2和3到10元杂环；和
[0223]
3到10元杂环，
[0224]
其中ra中的每一3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2和r1。
[0225]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物，ra在每次出现时独立地选自：
[0226]-n(r1)2和-nr1c(o)r1；
[0227]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-6
烷基，其各自经4到8元杂环取代；和
[0228]
4到8元杂环，
[0229]
其中ra中的每一4到8元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-c(o)or1和r1。
[0230]
在一些实施例中，式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物包含式-c(o)or
15
或-oc(o)r
15
的末端酯，其中r
15
包含1到12个碳原子和至少一个碱性胺。在一些实施例中，r
15
的分子量介于30与200g/mol之间。末端酯可为由人类血浆和/或人类肝中存在的一或多种水解酶(例如酯酶)代谢成羧酸和醇。化合物的生物活性可大于羧酸和醇的生物活性。举例来说，化合物可展现比羧酸和醇大至少1个单位或更多个单位的beas2b pic
50
(根据实例46中提供的分析评价)。在一些实施例中，r
15
是-(c
0-4
烷基)(4-到10-元杂环烷基)，其中杂环烷基包含1、2或3个氮原子，并且其中杂环烷基任选地经一或多个选自c
1-4
烷基的取代基取代。
[0231]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物：
[0232]
ra选自其中
[0233]
d和e各自独立地选自3到8元杂环，其各自独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-8
碳环和3到6元杂环。在一些实施例中，d和e各自独立地选自4到6元杂环，其各自独立地任选地经一或多个-ch3取代。在一些实施例中，d和e各自未经取代。
[0234]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物，ra是-n(r1)2，例如，例如在一些实施例中，ra是-nr1c(o)r1，例如
在一些实施例中，ra是经4至8元杂环取代的c
1-6
烷基，其中4至8元杂环经-c(o)or1取代，例如取代，例如取代，例如在一些实施例中，ra是经4到8元杂环取代的-n(r1)-c
1-6
烷基，其中4到8元杂环任选地经取代，例如例如在一些实施例中，ra是4到8元杂环，其中4至8元杂环任选地经一或多个选自-c(o)or1及r1的取代基取代，例如的取代基取代，例如的取代基取代，例如在一些实施例中，ra是-c(o)or1，例如在一些实施例中，ra选自
在一些实施例中，ra选自选自选自在一些实施例中，ra选自
nr1s(＝o)2n(r1)2、-c(o)r1、-c(o)or1、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)n(r1)2、-c(o)n(r1)2、-c(o)nr2r3；
[0244]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-10
烷基，其各自在每次出现时独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-n(r1)2、-c(o)or1、c
3-8
碳环和3到10元杂环；和
[0245]c3-8
碳环和3到10元杂环，
[0246]
其中ra中的每一c
3-8
碳环和3到10元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-or1、-ch2n(r1)2、-n(r1)2、-c(o)r1、-ch2c(o)or1、-c(o)or1、-c(o)n(r1)2、r1和c
1-6
烷基；
[0247]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基、1到6元杂烷基、c
0-3
烷基-(c
3-8
碳环)和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-8
碳环和3到6元杂环；
[0248]
m为1或2；
[0249]
rb选自卤素、-oh、-ch3和-chf2；且
[0250]
n为1。
[0251]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物：
[0252]
a是苯基；
[0253]
b是吡啶基；
[0254]
ra在每次出现时独立地选自：
[0255]-n(r1)2和-nr1c(o)r1；
[0256]c1-6
烷基和-n(r1)-c
1-6
烷基，其各自经4到8元杂环取代；和
[0257]
4到8元杂环，
[0258]
其中ra中的每一4到8元杂环独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-c(o)or1和r1；
[0259]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0260]
m为1；
[0261]
rb是-ch3；且
[0262]
n为1。
[0263]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物：
[0264]
a是苯基；
[0265]
b是吡啶基；
[0266]
ra是经4到8元杂环取代的c
1-6
烷基，其中所述4到8元杂环经-c(o)or1取代；
[0267]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0268]
m为1；
[0269]
rb是-ch3；且
[0270]
n为1。
[0271]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物：
[0272]
a选自苯基和5到6元杂芳基；
[0273]
b是吡啶基；
[0274]
ra选自：
[0275]-c(o)or1；和
[0276]c0-6
烷基-(3到8元杂环)，其中3到8元杂环经-c(o)or1取代；
[0277]
r1是任选地经一或多个选自以下的取代基取代的c
0-3
烷基-(3到8元杂环)：-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2和-c(ch3)3；
[0278]
m为1；
[0279]
rb是-ch3；且
[0280]
n为1。
[0281]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0282]
a是吡啶基；
[0283]
b是吡啶基；
[0284]
ra是-c(o)or1；
[0285]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0286]
m为1；
[0287]
rb是-ch3；且
[0288]
n为1。
[0289]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0290]
a是噻吩基；
[0291]
b是吡啶基；
[0292]
ra是-c(o)or1；
[0293]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
1-6
烷基和c
0-3
烷基-(3到10元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3和3到6元杂环；
[0294]
m为1；
[0295]
rb是-ch3；且
[0296]
n为1。
[0297]
在一些实施例中，对于式(i)化合物：
[0298]
a选自苯基和噻吩基；
[0299]
b是吡啶基；
[0300]
ra是-nr1c(o)r1；
[0301]
r1在每次出现时独立地选自氢；和c
0-3
烷基-(3到8元杂环)，其各自任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-oh、-ch2oh、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2和-c(ch3)3；
[0302]
m为1；
[0303]
rb是-ch3；且
[0304]
n为1。
[0305]
在一些实施例中，对于式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物：
[0306]
a选自苯基和5到6元杂芳基；
[0307]
b选自苯基和吡啶基；
[0308]
ra选自
[0309]
d和e各自独立地选自3到8元杂环，其各自独立地任选地经一或多个选自以下的取代基取代：-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-ch2ch2n(ch3)2、-c(o)ch3、-c(o)oh、-c(o)nh2、＝o、-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、-och3、-och2ch3、-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、c
3-8
碳环和3到6元杂环；
[0310]
m为1；
[0311]
rb选自卤素、-oh、-ch3和-chf2；且
[0312]
n为1。
[0313]
在一些实施例中，ra选自选自选自在一些实施例中，d和e各自独立地选自4到6元杂环，其各自独立地任选地经一或多个-ch3取代。在一些实施例中，d和e各自未经取代。在一些实施例中，a选自苯基、吡啶基、噻唑基和噻吩基。在一些实施例中，a是苯基。在一些实施例中，a是吡啶基。在一些实施例中，a是噻唑基。在一些实施例中，a是噻吩基。
[0314]
在一些实施例中，提供呈大体上纯立体异构体形式的式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物。在一些实施例中，立体异构体是以至少80％对映异构过量、例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％对映异构过量提供。
[0315]
在一些实施例中，本揭示内容提供软alk5抑制剂。如本文所用，术语“软药”或“软alk5抑制剂”是指在进入体循环时转化为可预测代谢物的生物活性化合物，所述可预测代谢物相对于母化合物展现降低的生物活性。软药优选在靶标器官或组织局部发挥其所需治
疗效应，然后在进入体循环时快速转化为可预测代谢物，所述可预测代谢物设计成活性比母体软药低，由此减少生物活性化合物的全身暴露。因此，相对于具有相当生物活性的非软药化合物，软药具有较低的不希望副作用的可能性。优选地，本揭示内容的软药在预期作用部位(例如，肺)处展现良好稳定性，在进入体循环时快速代谢，并且展示比相应代谢物更大的功能活性。
[0316]
在一些实施例中，本文提供的软药展现大于或等于9的alk5 pki，而相应的软药代谢物展现9或更小、例如8或更小的alk5 pki(根据实例45中提供的分析评价)。在一些实施例中，软药和相应软药代谢物的pki的差异为至少0.5，例如至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0。在一些实施例中，本文提供的软药展现大于或等于7的beas2b pic
50
，而相应的软药代谢物展现6或更小的beas2b pic
50
(根据实例46中提供的分析评价)。在一些实施例中，软药和相应软药代谢物的pic
50
的差异为至少1.0，例如至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0。在一些实施例中，软药和相应的软药代谢物展现类似alk5 pki值，但软药在细胞中更有活性(例如，软药展现的beas2b pic
50
比软药代谢物大至少1.0)。
[0317]
在一些实施例中，本揭示内容提供包含酯的软alk5抑制剂。优选地，所述酯抑制alk5活性，而所述酯的相应羧酸展现降低的alk5抑制活性。举例来说，酯和相应酸的alk5 pki的差异可为至少1.0。在一些实施例中，本揭示内容的软药酯例如通过吸入投与肺，并抑制肺中alk5的活性。然而，在离开肺时，酯可容易地水解成相应羧酸，因此减少酯的全身性暴露。
[0318][0319]
在一些实施例中，本揭示内容提供偶联物，其包含直接或经由由连接体连接(例如共价连接)到抗体构筑体或靶向部分的本文所揭示化合物，由此形成偶联物。连接体可为不可裂解的连接体或可裂解的连接体。偶联物可由下式表示：
[0320][0321]
其中a
′
是抗体构筑体或靶向部分；l1是连接体；d
′
是本文所揭示化合物或盐，例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物；且p是1到20的整数。在一些实施例中，p是1到10的整数，例如1到8、2到8、1到6、3到5或1到3。
[0322]
在一些实施例中，偶联物由下式表示：
[0323][0324]
其中a
′
是抗体构筑体或靶向部分；d
′
是本文所揭示化合物或盐，例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物；且p是1到20的整数。在一些实施例中，p是1到10的整数，例如1到8、2到8、1到6、3到5或1到3。
[0325]
因此，本揭示内容的化合物或盐(例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、
以形成化合物-连接体。a
′
或l1可共价连接到化合物的任何位置，只要化合价允许。本文所揭示的连接体l1可包含约10到约500个原子，例如10到400个原子、10到300个原子、30到400个原子或30到300个原子。
[0332]
抗体、抗体构筑体或靶向部分的靶标可取决于偶联物的所需治疗应用。通常，靶标是存在于希望将alk5抑制剂递送于其中的细胞(例如t细胞)的表面上的分子，并且抗体优选在结合到靶标时内化。对于其中偶联物打算通过降低tgf-β活性来刺激免疫系统的应用，可希望生成与t细胞表面分子结合的抗体、抗体构筑体或靶向部分。不希望受任何特定理论限制，认为alk5抑制剂至t细胞的递送可活化cd4

和/或cd8

t细胞活性并抑制调节性t细胞活性，两者均有助于肿瘤的免疫耐受。因此，本揭示内容的偶联物中结合到t细胞表面分子的抗体、抗体构筑体或靶向部分(a')可用于治疗各种癌症，例如下文描述的那些。在一些实施例中，a
′
结合到cd4

t细胞、cd8

t细胞、t
reg
细胞或其任一组合。在一些实施例中，a
′
结合到泛t细胞表面分子，例如cd1、cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd7、cd8、cd25、cd28、cd70、cd71、cd103、cd184、tim3、lag3、ctla4或pd1。结合到t细胞表面分子且据信内化的抗体的实例包括okt6、okt11、okt3、okt4、okt8、7d4、okt9、cd28.2、ucht1、m290、fr70、派姆单抗、尼沃鲁单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)和多斯塔利单抗(dostarlimab)。
[0333]
本文所揭示的抗体、抗体构筑体或靶向部分可包含特异性结合到肿瘤抗原或与纤维化发病机理相关的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域特异性结合到t细胞、b细胞、星形细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、apc、纤维母细胞、纤维细胞或与纤维化发病机理相关的细胞上的抗原。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向ctla4、pd-1、ox40、lag-3、gitr、garp、cd25、cd27、pd-l1、tnfr2、icos、41bb、cd70、cd73、cd38或vtcn1。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向pdgfrβ、整联蛋白αvβ1、整联蛋白αvβ3、整联蛋白αvβ6、αvβ8、内皮唾液酸蛋白(endosialin)、fap、adam12、lrrc15、mmp14、pdpn、cdh11、f2rl2、asgr1或asgr2。
[0334]
本文所述的化学实体可根据本文的一或多个阐释性方案和/或业内已知的技术合成。本文所用的材料有市售或是通过业内通常已知的合成方法制备。这些方案不限于实例中或通过任何特定取代基列示的化合物，其用于阐释性目的。尽管在方案1和2及实例1-44中描述且绘示各种步骤，但在一些情形下，所述步骤可以与方案1和2及实例1-44中所示的顺序不同的顺序实施。可对这些合成反应方案进行各种修改，并且将所述修改建议给参考本揭示内容的所属领域技术人员。除非另有指示，否则每一方案中的编号或r基团通常具有与本文别处定义的相同的含义。
[0335]
除非指定相反含义，否则本文所述的反应是在大气压下、通常在-10℃到200℃的温度范围内进行。此外，除非另有说明，否则反应时间和条件打算指近似值，例如在约大气压下在约-10℃到约110℃的温度范围内、在约1到约24小时的时段内进行；反应过夜进行，平均为约16小时时段。
[0336]
通常，本揭示内容的化合物可通过以下反应方案制备：
[0337]
方案1
[0338][0339]
在一些实施例中，式1i的化合物可根据方案1制备。举例来说，亚氨酸酯1b可由腈1a经由平纳反应(pinner reaction)形成，然后在氯化铵存在下转化为脒1c。可利用3-甲氧基丙烯酸甲基酯(1d)进行环化，以产生嘧啶酮1e，其可用氧氯化磷处理，以产生氯嘧啶1f。氯嘧啶1f可与2-氯嘧啶-4-胺(1g)进行c-n偶合反应、任选地pd催化的偶合反应(例如布赫瓦尔德-哈特维希(buchwald-hartwig)胺化)，以提供杂芳基胺1h。任选地，1h可经历一或多个偶合反应和任选地一或多个保护基团操作，以提供式1i的化合物。
[0340]
方案2
[0341][0342]
在一些实施例中，式2f的化合物可根据方案2制备。举例来说，可将硝基化合物2a还原为胺2b。然后，胺可与双(2-氯嘧啶-4-基)胺(2c)进行c-n偶合反应、任选地pd催化的偶合反应(例如布赫瓦尔德-哈特维希胺化)，以提供杂芳基胺2d。取代反应可提供杂芳基碘2e，其可经历亲核芳香族取代反应和任选地一或多个保护基团操作，以提供式2f的化合物。
[0343]
在一些实施例中，本揭示内容的化合物(例如表1或2中给出的式的化合物)是根据方案1和2、实例1-44中概述的一般途径中的一者或通过业内通常已知的方法来合成。在一些实施例中，实例性化合物可包括(但不限于)选自表1的化合物或其盐。
[0344]
表1
[0345]
[0346]
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354]
[0355]
[0356]
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[0358]
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[0360]
[0361]
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[0370]
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[0386]
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[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
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[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400]
[0401]
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[0403]
[0404]
[0405]
[0406]
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[0418]
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[0423]
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[0426]
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[0428]
[0429]
[0430]
[0431]
[0432]
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438]
[0439]
[0440][0441]
[0442]
在一些实施例中，实例性化合物可包括(但不限于)选自表2的化合物或其盐。
[0443]
表2
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448]
[0449]
[0450][0451]
[0452]
方法
[0453]
在一些方面中，本揭示内容提供抑制tgfβ信号传导的方法，其包含使细胞与有效量的本文所揭示化合物(例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物)接触。在一些实施例中，本揭示内容提供抑制alk5的方法，其包含使alk5与有效量的本文所揭示化合物接触。alk5或tgfβ信号传导的抑制可通过业内已知的多种方法评价。非限制性实例包括显示(a)alk5激酶活性的降低；(b)tgfβ/tgfβ-rii复合物与alk5之间结合亲和力的降低；(c)tgfβ信号传导路径下游的磷酸化细胞内信号传导分子的含量的降低，例如psmad2或psmad3含量的降低；(d)alk5与下游信号传导分子(例如smad2和smad3)的结合降低；和/或(e)atp含量的增加或adp含量的降低。试剂盒和市售分析可用于测定上述中的一或多者。
[0454]
在一些方面中，本揭示内容提供治疗个体的alk5介导的疾病或病况的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，疾病或病况选自纤维化和癌症。在一些实施例中，疾病或病况是肺纤维化，例如特发性肺纤维化或病毒诱发的纤维化。在一些实施例中，疾病或病况是肠纤维化。在一些实施例中，疾病或病况是脱发。在一些实施例中，疾病是神经退化疾病，例如阿兹海默氏病(alzheimer’s disease)。在一些实施例中，本揭示内容提供逆转衰老症状的方法。举例来说，所述方法可增强神经发生，减少神经炎症，改善认知性能，使肝组织再生和降低p16含量。
[0455]
在一些方面中，本揭示内容提供治疗纤维化的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，纤维化是由alk5介导。在一些实施例中，纤维化选自全身性硬化、全身性纤维化、器官特异性纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、门静脉纤维化、皮肤纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜纤维化、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。在一些实施例中，纤维化是肺纤维化，例如特发性肺纤维化(ipf)、家族性肺纤维化(fpf)、间质肺纤维化、与气喘相关的纤维化、与慢性阻塞性肺病(copd)相关的纤维化、二氧化硅诱发的纤维化、石棉诱发的纤维化或化学疗法诱发的肺纤维化。在一些实施例中，纤维化是特发性肺纤维化(ipf)。在一些实施例中，纤维化是tgf-β介导的肺纤维化。在一些实施例中，患者经诊断患有急性呼吸窘迫综合症(ards)。在一些实施例中，纤维化是急性纤维化。在一些实施例中，纤维化是慢性纤维化。
[0456]
在一些方面中，本揭示内容提供治疗由病毒感染诱发的肺纤维化的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。肺纤维化可由以下各者诱发：红病毒、依赖病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、哺乳动物腺病毒、α疱疹病毒亚科、水痘病毒、γ疱疹病毒亚科、β疱疹病毒亚科、玫瑰疹病毒、正痘病毒、副痘病毒、软疣痘痘病毒、正嗜肝dna病毒、肠病毒、鼻病毒、肝病毒、口疮病毒、杯状病毒、星状病毒、α病毒、风疹病毒、黄病毒、c型肝炎病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、a型流感病毒、b型流感病毒、c型流感病毒、副粘液病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、肺炎病毒、水疱病毒、狂犬病病毒、布尼亚病毒(bunyavirus)、汉坦病毒(hantavirus)、内罗病毒(nairovirus)、白蛉病毒(phlebovirus)、冠状病毒、沙粒病毒、blv-htlv-反转录病毒、慢病毒亚科、泡沫病毒亚科或纤丝病毒。在一些实施例中，纤维化病毒诱发的纤维化，例如病毒诱发的肺纤维化。在一些实施例中，纤维化选自ebv诱发的肺纤维化、cmv诱发的肺纤维化、疱疹病毒诱发的肺纤维化和冠状病毒诱发的肺纤维化、在一些实施例中，纤维化选自ebv诱发的肺纤维化、cmv诱发的肺纤维化、hhv-6诱发的肺纤维化、
hhv-7诱发的肺纤维化、hhv-8诱发的肺纤维化、h5n1病毒诱发的肺纤维化、sars-cov诱发的肺纤维化、mers-cov诱发的肺纤维化和sars-cov-2诱发的肺纤维化。在一些实施例中，肺纤维化是冠状病毒诱发的肺纤维化。在一些实施例中，肺纤维化是sars-cov-2诱发的肺纤维化。在一些实施例中，肺纤维化是covid-19诱发的肺纤维化。
[0457]
在一些方面中，本揭示内容提供治疗急性肺损伤(ali)的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗急性呼吸窘迫综合症(ards)的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。ards可处于早期急性损伤期或纤维增生期。在一些实施例中，ards是纤维增生性ards。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗由ards导致的纤维化的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。由ards导致的纤维化可为肺纤维化。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗由ali导致的纤维化的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。由ali导致的纤维化可为肺纤维化。
[0458]
在一些方面，本揭示内容提供治疗肠纤维化的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，肠纤维化由alk5介导。在一些实施例中，化合物以有效延迟一或多种与肠纤维化相关的特征的进展、降低其发病率或降低其程度的量投与。在一些实施例中，化合物以有效逆转确立的纤维化的量以单剂量或以多个剂量投与。
[0459]
在一些方面中，本揭示内容提供治疗癌症的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，癌症由alk5介导。在一些实施例中，癌症选自乳癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、神经胶母细胞瘤、黑色素瘤和胰脏癌。在一些实施例中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌。在一些方面中，本揭示内容提供治疗癌症(例如非小细胞肺癌)的方法，其包含向患者投与有效量的本文所揭示化合物和免疫治疗剂。在一些实施例中，癌症是iii期非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述方法进一步包含向患者投与辐射。在一些实施例中，免疫治疗剂是pd-1抑制剂或ctla-4抑制剂。在一些实施例中，免疫治疗剂选自阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、尼沃鲁单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、bgb-a317、曲美目单抗(tremelimumab)和伊匹单抗(ipilimumab)。在一些实施例中，免疫治疗剂选自派姆单抗和德瓦鲁单抗。
[0460]
本文所述化合物(包括式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物)是限制tgfβ的活性的alk5抑制剂。tgfβ是参与整个身体中纤维变性疾病的起始和发展的若干因素之一。因此，本揭示内容的化合物预期可通过投与治疗有效量的本文所揭示化合物用于治疗、预防和/或减少患者的纤维化。通过抑制alk5，所述化合物预期增强在遭受细胞外基质过度沉积的身体区域中纤维化的形成。下文描述那些区域。
[0461]
全身性纤维变性疾病
[0462]
全身性硬化(ssc)是一种自体免疫病症，其影响皮肤和内脏器官并导致自体抗体产生、小血管的血管内皮活化和由纤维母细胞功能障碍引起的组织纤维化。转化生长因子β(tgf-β)已被鉴别为ssc中病理性纤维发生的调节剂(艾尔斯,n.b.(ayers,n.b.)等人，生物医学研究杂志(journal of biomedical research),2018,32(1),第3-12页)。根据作者，“理解tgf-β路径在全身性硬化的病理学中所起的基本作用可为治疗和更好地了解此种严重疾病提供潜在出路”。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗ssc的方法，其包含向个体投
与有效量的本文所揭示化合物。
[0463]
多灶性纤维硬化(mf)和特发性多灶性纤维硬化(imf)是以在不同部位的纤维性病灶为特征的病症，并且包括腹膜后纤维化、纵隔纤维化和里德尔甲状腺炎(riedel’s thyroiditis)。多灶性纤维硬化和特发性多灶性纤维硬化二者都被视为igg4相关纤维化/疾病的结果，并且认为tgf-β是参与纤维化的起始和发展的一个因素(帕尔达利,e.(pardali,e.)等人，国际分子科学杂志(int.j.mol.sci.),18,2157,第1-22页)。在一些实例中，本发明提供治疗多灶性纤维硬化或特发性纤维硬化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示的化合物。
[0464]
在一些实施例中，本揭示内容提供治疗肾因性全身纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示的化合物。肾因性全身纤维化是主要发生在有或没有透析的晚期肾衰竭的人中的罕见疾病。在由凯利(kelly)等人(美国皮肤病学会杂志(j.am.acad.dermatol.),2008,58,6,第1025-1030页)实施的研究中，显示tgf-β以及smad 2/3似乎与肾因性全身纤维化中所见的纤维化相关。
[0465]
硬皮病样移植物抗宿主病(gvhd)是同种异体造血干细胞移植的普遍并发症，其在同种异体骨髓移植后两到三个月出现。所述疾病导致自体抗体的产生以及皮肤和内部器官的纤维化。使用鼠类皮肤gvhd模型，已显示tgf-β中和抗体可抑制早期皮肤和肺病的进展(麦考密克,l.l.(mccormick,l.l.)等人，免疫学杂志(j.immunol.),1999,163,第5693-5699页)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗硬皮病gvhd的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0466]
器官特异性纤维变性疾病
[0467]
心脏纤维化是指由于心脏纤维母细胞的异常增殖导致的心脏瓣膜的异常增厚，所述异常增殖导致心脏肌肉中ecm的过量沉积。纤维母细胞分泌胶原，其用作心脏的结构支持。然而，当胶原蛋白在心脏中过度分泌时，壁和瓣膜增厚可导致组织在三尖瓣和肺动脉瓣上堆积。此又导致柔性的损失，并最终导致瓣膜功能障碍，从而导致心脏衰竭。心脏纤维化的具体类型是j.迪茨(j.diez)(临床高血压杂志(j.clin.hypertens.),2007年7月9(7)日,第546-550页)描述的高血压相关的心脏纤维化。根据迪茨，心脏组织组成的变化在患有左心室肥大的高血压患者中发生，并导致心脏组织的结构重塑。一种变化涉及i型和iii型胶原分子的合成与降解之间平衡的破坏，从而导致胶原纤维在心脏组织中过度累积。其它类型的心脏纤维化包括心肌梗塞后和查加斯病(chagas disease)诱发的心肌纤维化。在查加斯病中，转变生长因子β1(tgf-β1)已参与查加斯病的生理病理学，其中动物模型表明tgf-β1路径在感染期间上调(阿劳霍-豪尔赫,t.c.(araujo-jorge,t.c.)等人，临床药理学与治疗学(clin.pharmacol.ther.),2012,92(5),第613-621页；克鲁维,e.(curvo,e.),纪念奥斯瓦尔多克鲁兹(mem inst oswaldo cruz),2018,第113(4)卷,e170440,第1-8页)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗各种形式的心脏纤维化(例如高血压相关的心脏纤维化、心肌梗塞后或查加斯病诱发的心肌纤维化)的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0468]
肾纤维化涵盖与tgf-β的异常表达和活性相关的多种病症，包括(但不限于)糖尿病性和高血压性肾病变、尿路阻塞诱发的肾纤维化、炎症性/自体免疫诱发的肾纤维化、马兜铃酸肾病变、进行性肾纤维化和多囊肾病。如上文所论述，纤维化涉及ecm的过量累积，当
正常组织经瘢痕组织替代时，此又导致功能丧失(韦恩,t.a.(wynn,t.a.),临床研究杂志(j clin invest.),2007,117,第524-529页)。早在2005年，alk5抑制剂便在肾病模型中进行研究(拉平,n.j.(laping,n.j.),当代药理学观点(current opinion in pharmacology),2003,3,第204-208页)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗肾纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0469]
一种特别难治的纤维化疾病是特发性肺纤维化(ipf)。ipf是慢性、进行性且致命性纤维变性肺病，其存活仅通过肺移植得以改善。目前的口服疗法(例如尼达尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone))已显示减缓疾病的进展，但具有导致患者停药和缺乏顺从性的不良效应。尽管有针对各种路径的其它疗法在开发中，但ipf患者的需求仍未得以满足。
[0470]
尽管alk5是纤维变性疾病路径中重要和已知的组分，但alk5抑制剂在ipf中的效能由于全身性不良效应、尤其心脏中的不良效应而尚未实现。因此，本揭示内容的一个目标是开发具有高肺选择性和快速清除的alk5抑制剂。本揭示内容的一个优选实施例是用本文所述的化合物、例如通过每天一次或两次投与具有最小全身暴露的可吸入alk5抑制剂来治疗患有特发性肺纤维化的患者。吸入的alk5抑制剂可作为单一疗法投与或与其它口服可用的ipf疗法共同给药投用。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗特发性肺纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，化合物通过吸入投与。
[0471]
家族性肺纤维化是其中两个或更多个家族成员已确诊ipf的遗传性疾病。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗家族性肺纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0472]
肺纤维化是与病毒感染(例如sars和covid-19)相关的典型临床特征。已显示sars介导的tgf-β信号传导促进纤维化并阻断sars-cov感染的宿主细胞的凋亡(赵,x.(zhao,x.)等人，生物化学杂志(j.biol.chem.),2008,283(6),第3272-3280页)。在感染sars-cov-2的患者中类似地观察到tgf-β表达增加，最终导致肺纤维化的发展。由sars-cov-2介导的tgf-β信号传导可促进成纤维母细胞增殖和肌纤维母细胞分化，并阻断宿主细胞细胞凋亡。(熊,y.(xiong,y.)等人,新兴微生物和感染(emerging microbes&infections),2020,9(1),第761-770页)。预计本揭示内容的化合物抑制由病毒感染介导的增加的tgf-β信号传导，并预防、停止、减缓或逆转与感染相关的肺纤维化的进展。因此，在一些实施例中，本揭示内容提供治疗由病毒感染诱发的肺纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。在一些实施例中，肺纤维化由sars-cov或sars-cov-2诱发。在一些实施例中，化合物通过吸入投与。
[0473]
慢性肺病(例如间质性肺病(ild)、慢性阻塞性肺病(copd)和特发性肺纤维化(ipf))可导致肺高血压(ph)。肺高血压是特征在于肺中高血压的进行性疾病。世界卫生组织(world health organization,who)已定义ph的五种分类(who第i组：肺动脉高血压(pah)；who第ii组：由左心病引起的肺高血压；who第iii组：由肺疾病及/或缺氧引起的肺高血压；who第iv组：慢性血栓栓塞性肺高血压(cteph)；及who第v组：具有不清楚多因素机制的肺高血压)。tgf-β信号传导已涉及ph的发病机理。此外，在严重ph的野百合碱(mct)中抑制alk5显示以剂量依赖方式减弱ph的发展并减少肺血管重塑，即通过降低rv收缩压、降低rv舒张压、增加心搏出量并减少rv肥大(宰曼a.l.(zaiman,a.l.)等人，美国呼吸与重症监
护医学杂志(am.j.respir.crit.care med.),2008,177,第896-905页)。预计本揭示内容的化合物抑制肺组织中的tgf-β信号传导，并预防、停止、减缓或逆转ph的进展，特别是在who第iii组ph中。因此，在一些实施例中，本揭示内容提供治疗肺高血压的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。肺高血压可为who第iii组肺高血压，例如肺纤维化相关的肺高血压(ph-pf)或间质性肺病相关的肺高血压(ph-ild)。在一些实施例中，化合物通过吸入投与。
[0474]
其它类型的间质性肺病包括(但不限于)(1)由细菌、病毒或真菌引起之间质性肺炎；(2)通常与自体免疫病况(例如类风湿性关节炎或硬皮病)相关的非特异性间质性肺炎；(3)由吸入灰尘、霉菌或其它刺激物引起的过敏性肺炎；(4)隐源性组织化肺炎；(5)急性间质性肺炎；(6)脱屑性间质性肺炎；(7)类肉瘤病；(8)药物诱发之间质性肺病；和(9)进行性纤维化间质性肺病(pf-ild)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗间质性肺病的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0475]
转变生长因子(tgf)-β(1)和活化素-a二者都参与气喘中的气道重塑(卡里亚瓦萨姆,h.h.(kariyawasam,h.h.),过敏反应与临床免疫学杂志(j allergy clin immunol.),2009年9月,124(3),第454-462页)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗气喘的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0476]
慢性阻塞性肺病(copd)是一种特征在于由气道炎症和肺气肿引起的可逆性差和进行性气流受限的肺部病症，而ipf与扩散能力受损相关(基洛西m.(chilosi,m.)等人，呼吸研究(respir.res.),2012,13(1),3,第1-9页)。然而，两种疾病都展现肺泡实质的进行性损失，导致呼吸功能的严重损害。与肺气肿相关的纤维化是已知的，并且研究已展现tgf-β1参与慢性窦病、肺纤维化、气喘和copd(杨,y.c.(yang,y.c.)等人，过敏反应(allergy),2012,67,第1193
–
1202页)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗copd的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0477]
导致纤维化的其它类型的肺损伤包括二氧化硅诱发的尘肺病(硅肺病)、石棉诱发的肺纤维化(石棉沉着病)和化学治疗剂诱发的肺纤维化。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗损伤诱发的纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0478]
在一些实施例中，本揭示内容提供治疗肝纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。当肝反复或连续受损时，例如在患有慢性肝炎的患者中，肝中发生纤维化。tgf-β信号传导参与疾病进展的所有阶段，从因炎症和纤维化的最初肝损伤到肝硬化和癌症(法夫雷加特,i.(fabregat,i.)等人，febs杂志(the febs j.),2016,283(12),第2219-2232页)。
[0479]
相关病况包括由特发性非硬化性门静脉高血压(incph)引起的纤维化。此疾病的病因不确定，其特征在于门静脉周围纤维化和累及门静脉的小支和中支。根据中沼(nakanuma)等人，患有硬皮症和incph的患者之间的门静脉小血管和皮肤表现是类似的(中沼y.,肝脏病学研究(hepatol.res.),2009,39,第1023-1031页)。转变生长因子-β(tgf-β)和结缔组织生长因子(其分别是纤维化相关的和血管内皮生长因子)在血清、皮肤和门静脉中增加，表明这些可为incph中的门静脉闭塞的机制。此外，北尾(kitao)等人基于这些发现提出内皮间充质转换(endmt)理论(北尾,a.等人，美国病理学杂志(am.j.pathol.),2009,175,第616-626页)。血清中tgf-β的增加可用作endmt的强效诱发物。在一些实施例中，本揭
示内容提供治疗incph的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0480]
其它类型的肝纤维化包括酒精性和非酒精性肝纤维化、c型肝炎诱发的肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化或胆管炎和寄生虫诱发的肝纤维化(血吸虫病)。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗酒精性肝纤维化、非酒精性肝纤维化、c型肝炎诱发的肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管炎或寄生虫诱发的肝纤维化(血吸虫病)的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示的化合物。
[0481]
原发性胆管炎(pbc)和原发性硬化性胆管炎(psc)是两种类型的慢性肝病，其通常导致肝硬化和肝衰竭。患有pbc或psc的患者的肝生检通常揭示炎症和纤维化。整联蛋白αvβ6的抑制会抑制啮齿类动物的胆汁纤维化，所述整联蛋白αvβ6已显示结合并活化上皮细胞上的tgfβ1。(帕戈,z-w.(peng,z-w.)等人，肝脏病学(hepatology),2016,63,第217-232页)。因此，还预计tgf-β路径的抑制会抑制pbc和psc二者中的纤维化过程。预计本揭示内容的化合物抑制肝组织中的tgf-β信号传导，并预防、停止、减缓或逆转pbc和psc的进展。因此，在一些实施例中，本揭示内容提供治疗原发性胆管炎或原发性硬化性胆管炎的方法，其包含向个体投与有效量的本文所述的化合物。在一些实施例中，本揭示内容提供任选地在患有pbc或psc的个体中治疗肝纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所述的化合物。
[0482]
纤维变性皮肤病况包括(但不限于)肥厚性结瘢、瘢瘤和局部或全身性硬化(硬皮症)。如先前所论述，tgf-β是结缔组织累积的强效刺激物，并参与硬皮症和其它纤维变性病症的发病机理(拉科斯,g.(lakos,g.)lakos,g.等人，美国病理学杂志,2004,165(1),第203-217页)。拉科斯等人展现smad3作为正常皮肤纤维母细胞中促纤维变性tgf-β反应的关键细胞内信号转换因子起作用，并发现在硬皮症的小鼠模型中tgf-β/smad3信号传导的靶向破坏调节皮肤纤维化。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗皮肤纤维化的方法，包其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0483]
肠纤维化是炎症性肠病(ibd)的常见并发症，并且是严重临床问题。tgf-β已被暗示为肠纤维化的主要驱动因子。此外，tgf-β1信号传导通过诱发肠平滑肌中的胰岛素样生长因子i(igf-i)和机械生长因子(mgf)产生而有助于纤维狭窄性克隆氏病(crohn’s disease)中的狭窄形成。(拉泰拉,g.(latella,g.)、里德,f.(rieder,f.),胃肠病学现代观念(curr.opin.gastroenterol.),2017,33(4),第239-245页)。因此，tgf-β信号传导的抑制可减缓、停止或逆转肠中纤维化的进展。然而，对患有ibd的患者所关注的不良副作用(例如炎症和赘瘤形成)可能是由tgf-β信号传导的全身性抑制所引起。本发明的一个目标是开发对胃肠道具有高选择性和快速清除的alk5抑制剂。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗肠纤维化的方法，其包括向个体投与有效量的本文所述的化合物，例如通过每天投与一次或两次具有最小全身性暴露的口服alk5抑制剂。在一些实施例中，个体患有炎症性肠病，例如克隆氏病或结肠炎。治疗效能的程度可为相对于个体的起始状况(例如，基线梅奥(mayo)评分、基线lichtiger评分、或一或多种症状的严重程度或发病率)，或相对于参照群体(例如，未治疗的群体、或用不同药剂治疗的群体)。肠纤维化的严重程度可使用任何适宜方法(例如延迟增强mri、超音弹性成像、剪切波弹性成像、磁化mri或通过直接检测巨分子(例如胶原))来评价。优选地，用本揭示内容的化合物治疗降低纤维化的严重程度，例如从严重纤维化到中度或轻度纤维化。在一些实施例中，治疗增加肠组织弹性、降低组织硬度和/或降
低胶原含量。在一些实施例中，治疗预防肌纤维母细胞累积、抑制促纤维变性因子的表达和/或抑制纤维变性组织的累积。
[0484]
涉及tgf-β路径的其它类型的器官特异性纤维化或纤维变性疾病包括(但不限于)辐射诱发的纤维化(各种器官)、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜硬化、弥漫性筋膜炎、杜普伊特伦氏病(dupuytren’s disease)、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗辐射诱发的纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜硬化、弥漫性筋膜炎、杜普伊特伦氏病、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化或视网膜纤维化的方法，其包含向个体投与有效量的本文所揭示化合物。
[0485]
尽管本揭示内容的目标的一是局部或以靶向方式治疗纤维性疾病和肺病，但本文所述的化合物还可用于全身性治疗患者。可全身治疗的疾病包括(例如)肿瘤疾病，例如神经胶母细胞瘤、胰脏癌和肝细胞癌、转移到肺的乳癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、囊性纤维化和其它形式的原发性癌亚型的转移。一些上述疾病还可局部治疗。
[0486]
本文所揭示化合物可治疗的其它纤维变性疾病包括血管性水肿、抗衰老和脱发。脱发包括全秃、普秃、雄激素性脱发、斑秃、弥漫性脱发、产后脱发和牵引性脱发。
[0487]
其它适应症
[0488]
在某些方面，本揭示内容提供逆转一或多种衰老症状的方法，其包含向个体投与alk5抑制剂。所述方法可进一步包含投与mapk路径的活化剂，例如催产素。所述方法可在以下中的一或多者中有效：增强海马体中的神经发生、减少神经炎症、改善认知能力、减少肝肥大、减少肝纤维化和减少p16

细胞数量。在一些实施例中，本文所述的方法增加干细胞活性。干细胞活性的增加可允许个体在海马体中产生新肌肉纤维和/或形成新神经元。用alk5抑制剂(例如本文所述的化合物)的治疗可预防或减缓年龄相关疾病(例如阿兹海默氏病)的发作。(参见梅赫迪普尔,m.(mehdipour,m.)等人老化(aging)2018,10,5628-5645)。
[0489]
医药组合物
[0490]
在一些方面中，本揭示内容提供医药组合物。医药组合物可包含本文所揭示化合物(例如式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物)和医药上可接受的载剂。在一些实施例中，医药组合物经调配用于口服投与。在一些实施例中，医药组合物经调配用于吸入。在一些实施例中，医药组合物包含本文所揭示化合物和额外治疗剂。下文描述所述治疗剂的非限制性实例。
[0491]
医药组合物通常包括至少一种医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和至少一种式(i)、(i’)、(i-a)、(i
’‑
a)、(i-b)、(i
’‑
b)、(i-c)、(i
’‑
c)、(i-d)、(i
’‑
d)、(i-e)或(i
’‑
e)化合物、或表1或2中提供化合物，本文描述为活性剂。活性剂可以适于特定投与模式的任何形式(例如游离碱、游离酸或医药上可接受的盐)提供。另外，本揭示内容的方法和医药组合物包括使用n-氧化物、结晶型(例如多形体)以及具有类似活性的这些化合物的代谢物。本文所述化合物的所有互变异构体均包括在本揭示内容的范围内。另外，本文所述的化合物涵盖与医药上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)的非溶剂化以及溶剂化形式。
[0492]
适宜投与途径包括(但不限于)经口、静脉内、直肠、阴道、气溶胶、肺、鼻、经粘膜、局部、经皮、经耳、经眼和非经肠投与模式。此外，仅作为实例，非经肠递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴管内和鼻内注射。
[0493]
在某些实施例中，本文所述的化合物以局部而非全身方式投与，例如，通常在贮库
制剂或持续释放调配物中经由将化合物直接注射到器官中。在一些实施例中，长效调配物通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射投与。在一些实施例中，本文所述的化合物以快速释放调配物、延长释放调配物或中间释放调配物的形式提供。在一些实施例中，本文所述的化合物以雾化调配物的形式提供。在一些实施例中，本文所述的化合物通过吸入局部投与到肺。
[0494]
本揭示内容的化合物在宽剂量范围内有效。举例来说，在成人的治疗中，可将每天0.01到1000mg、0.5到100mg、1到50mg或5到40mg的剂量投与到有需要的个体。确切的剂量将取决于投与途径、化合物投与的形式、要治疗的个体、要治疗的个体的体重和主治医师的偏好和经验。
[0495]
本揭示内容的化合物可以单一剂量投与。在一些实施例中，本揭示内容的化合物以多剂量投与，例如每天约一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。在一些实施例中，投药是约一月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。在一些实施例中，本揭示内容的化合物和额外治疗剂一起投与约每天一次到约每天6次。在一些实施例中，投与持续超过约6、10、14、28天、两个月、六个月或超过约一年。在一些实施例中，只要需要即维持投药时间表。本揭示内容的化合物可持续长期投与，例如用于治疗慢性效应。
[0496]
本揭示内容的医药组合物通常含有治疗有效量的本揭示内容的化合物。然而，熟习此技术者将认识到，医药组合物可含有多于治疗有效量的例如散装组合物，或少于治疗有效量的例如设计用于共同投与以实现治疗有效量的个别单位剂量。
[0497]
通常，本揭示内容的医药组合物含有约0.01到约95重量％的活性剂；包括例如约0.05到约30重量％以及约0.1重量％到约10重量％的活性剂。
[0498]
任何常规载剂或赋形剂可用于本揭示内容的医药组合物中。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择将取决于用于治疗特定患者的投与模式或医学病况或疾病状态的类型。另外，用于本揭示内容的医药组合物中的载剂或赋形剂可有市售。常规调配技术阐述于雷明顿：药学科学及实践(remington:the science and practice of pharmacy),第20版,利平科特
·
威廉姆斯和怀特(lippincott williams&white),巴尔的摩(baltimore),马里兰州(maryland)(2000)；和h.c.安塞尔(h.c.ansel)等人，药物剂型和药物递送系统(pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems),第7版,利平科特
·
威廉姆斯和怀特,巴尔的摩,马里兰州(1999)。
[0499]
可用作医药上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)下列物质：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，例如微晶纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可油和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无致热原水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和医药组合物中所使用的其它无毒相容性物质。
[0500]
医药组合物通常是通过将活性剂与医药上可接受的载剂和一或多种可选成分彻底充分混合或掺和来制备。然后可使用常规程序和设备将所得均匀掺和的混合物成形或加载到片剂、胶囊、丸剂等中。
[0501]
在一个方面中，医药组合物适于吸入投与。用于吸入投与的医药组合物通常呈气溶胶或粉末的形式。所述组合物通常使用吸入器递送装置(例如干粉吸入器(dpi)、定剂量吸入器(mdi)、雾化吸入器或类似的递送装置)投与。
[0502]
在特定实施例中，医药组合物是通过使用干粉吸入器吸入投与。所述干粉吸入器通常以自由流动的粉末形式投与医药组合物，在吸入期间，所述粉末分散在患者的气流中。为了获得自由流动的粉末组合物，治疗剂通常与适宜赋形剂(例如乳糖、淀粉、甘露醇、右旋糖、聚乳酸(pla)、聚乳酸-共-乙交酯(plga)或其组合)一起调配。通常，将治疗剂微粉化并与适宜载剂组合以形成适于吸入的组合物。
[0503]
用于干粉吸入器的代表性医药组合物包含乳糖和微粉化形式的本文所揭示化合物。例如，可通过将干磨的乳糖与治疗剂组合且然后将组分干混来制备所述干粉组合物。然后通常将组合物装载到干粉分配器中，或装载到与干粉递送装置一起使用的吸入筒或胶囊中。
[0504]
适于通过吸入投与治疗剂的干粉吸入器递送装置业内有所描述，并且所述装置的实例有市售。举例来说，代表性干粉吸入器递送装置或产品包括aeolizer(诺华(novartis))；airmax(爱华克斯(ivax))；clickhaler(伊诺威达生物医药(innovata biomed))；碟式吸入器(葛兰素史克(glaxosmithkline))；diskus/accuhaler(葛兰素史克)；ellipta(葛兰素史克)；easyhaler(奥利昂制药(orion pharma))；eclipse(安内特(aventis))；flowcaps(好利安(hovione))；handihaler(勃林格殷格翰(boehringer ingelheim))；pulvinal(凯西(chiesi))；rotahaler(葛兰素史克)；skyehaler/certihaler(斯基制药(skyepharma))；twisthaler(先灵葆雅(schering-plough))；turbuhaler(阿斯利康(astrazeneca))；ultrahaler(安内特)；等。
[0505]
本揭示内容的医药组合物可通过使用定剂量吸入器吸入投与。所述定剂量吸入器通常使用压缩的推进气体排出测量量的治疗剂。因此，使用定剂量吸入器投与的医药组合物通常包含治疗剂在液化推进剂中的溶液或悬浮液。可采用任何适宜液化推进剂，包括氢氟烷烃(hfa)，例如1,1,1,2-四氟乙烷(hfa 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷(hfa 227)；和氯氟烃，例如ccl3f。在具体实施例中，推进剂是氢氟烷烃。在一些实施例中，氢氟烷烃调配物含有共溶剂，例如乙醇或戊烷；和/或表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油。
[0506]
在定剂量吸入器中使用的代表性医药组合物包含约0.01重量％到约5重量％的本揭示内容的化合物；约0重量％到约20重量％的乙醇；和约0重量％到约5重量％的表面活性剂；其余为hfa推进剂。所述组合物通常通过将冷却或加压的氢氟烷烃添加到含有治疗剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的适宜容器中来制备。为了制备悬浮液，将治疗剂微粉化，并且然后与推进剂组合。然后将组合物装载到气溶胶罐中，所述气溶胶罐通常形成定剂量吸入器装置的一部分。
[0507]
适于通过吸入投与治疗剂的定剂量吸入器装置在业内有所描述，并且所述装置的实例有市售。举例来说，代表性定剂量吸入器装置或产品包括aerobid吸入器系统(森林制药(forest pharmaceuticals))；定喘乐吸入气溶胶(atrovent inhalation aerosol)(勃林格殷格翰)；氟替卡松(葛兰素史克)；吡布特罗(maxair)吸入器(3m)；舒喘灵(proventil)吸入器(schering)；沙美特罗吸入气溶胶(葛兰素史克)；等。
[0508]
本揭示内容的医药组合物可通过使用雾化吸入器吸入投与。所述雾化器装置通常产生高速气流，其使医药组合物喷射为携带至患者的呼吸道中的薄雾。因此，当调配用于雾化吸入器时，治疗剂可溶解于适宜载剂中以形成溶液。或者，治疗剂可经微粉化或纳米研磨并与适宜载剂组合以形成悬浮液。
[0509]
用于雾化吸入器的代表性医药组合物包含溶液或悬浮液，所述溶液或悬浮液包含约0.05μg/ml到约20mg/ml的本揭示内容化合物和与雾化调配物相容的赋形剂的。在一个实施例中，溶液具有约3到约8的ph。
[0510]
适于通过吸入投与治疗剂的喷雾器装置在业内有所描述，并且所述装置的实例有市售。举例来说，代表性喷雾器装置或产品包括softmist
tm
吸入器(勃林格殷格翰)；肺递送系统(阿拉迪姆公司(aradigm corp.))；pari lc可再用雾化器或pari快速雾化器系统(德国百瑞(pari gmbh))；等。
[0511]
本揭示内容的医药组合物可制备成打算口服投与的剂型。适用于口服投与的医药组合物可呈以下形式：胶囊、片剂、丸剂、菱形片剂、扁囊剂、糖衣锭、粉剂、颗粒剂；或于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油或油包水液体乳液；或酏剂或糖浆；等；其各自含有预定量的本揭示内容的化合物作为活性成分。
[0512]
当打算以固体剂型口服投与时，本揭示内容的医药组合物通常包含活性剂和一或多种医药上可接受的载剂，例如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或另一选择为，所述固体剂型也可包含：填充剂或增量剂、粘合剂、保湿剂、溶液阻滞剂、吸收加速剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂、着色剂及缓冲剂。释放剂、润湿剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于本发明的医药组合物中。
[0513]
替代调配物可包括控制释放调配物、用于口服投与的液体剂型、经皮贴剂和非经肠调配物。制备所述替代调配物的常规赋形剂和方法描述于例如雷明顿的参考文献中，见上。
[0514]
下列非限制性实例阐释本揭示内容的代表性医药组合物。
[0515]
干粉组合物
[0516]
将本揭示内容的微粉化化合物(1g)与研磨的乳糖(25g)掺和。然后将所述掺和的混合物以足以提供每剂量约0.1mg到约4mg化合物的量装载到可剥离泡罩包的个别泡罩中。使用干粉吸入器投与泡罩的内容物。
[0517]
干粉组合物
[0518]
将本揭示内容的微粉化化合物(1g)与研磨的乳糖(20g)掺和以形成具有1:20的化合物对研磨的乳糖的重量比的散装组合物。将掺和的组合物装入能够递送每剂量约0.1mg到约4mg化合物的干粉吸入装置中。
[0519]
定剂量吸入器组合物
[0520]
将本揭示内容的微粉化化合物(10g)分散在通过将卵磷脂(0.2g)溶解在去矿物质水(200ml)中制备的溶液中。将所得悬浮液喷雾干燥，并且然后微粉化以形成包含平均直径小于约1.5μm的颗粒的微粉化组合物。然后将微粉化组合物装载到含有加压1,1,1,2-四氟乙烷的定剂量吸入器筒中，当通过定剂量吸入器投与时，所述微粉化组合物的量足以提供每剂量约0.1mg到约4mg的化合物。
[0521]
雾化器组合物
[0522]
代表性雾化器组合物如下。将本揭示内容的化合物(2g游离碱当量)溶解在含有80ml反渗透水、0.1-1重量％无水柠檬酸和0.5-1.5当量盐酸的溶液中，然后添加氢氧化钠以将ph调整到3.5-5.5。此后，添加4-6重量％的d-甘露糖醇，并且溶液补充到100ml。然后将溶液经由0.2μm过滤器过滤，并在使用前在室温下储存。使用每剂量提供约0.1mg到约4mg的化合物的雾化器装置投与所述溶液。
[0523]
试剂盒
[0524]
在某些方面中，本揭示内容提供试剂盒，其包含一或多个单位剂量的本文所述的化合物或医药组合物，任选地其中试剂盒进一步包含使用化合物或医药组合物的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括载剂、包装或容器，其经分隔以容纳一或多个容器，例如小瓶、管等，每一容器包含用于本文所述方法的单独元件之一。适宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。
[0525]
本文提供的制品可含有包装材料。用于包装医药产品的包装材料包括在例如美国专利第5,323,907号、第5,052,558号和第5,033,252号中发现的那些。医药包装材料的实例包括(但不限于)泡罩包、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶和适合于所选调配物和预期投与和治疗模式的任何包装材料。举例来说，容器可包括一或多种本文所述的化合物，任选地在组合物中或与本文揭示的另一试剂组合。容器可任选地具有无菌输液埠(例如，容器是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述试剂盒可任选地包含化合物和与其在本文所述方法中的使用有关的鉴别说明或标记或说明书。
[0526]
在一些实施例中，试剂盒包括一或多个容器，每一容器具有一或多种从商业和使用者立场考虑对于使用本文所述化合物所所需的不同材料(例如任选地呈浓缩形式的试剂和/或装置)。所述材料的非限制性实例包括(但不限于)缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、载剂、包装、容器、小瓶和/或管、列示内容物的标记和/或使用说明和具有使用说明的包装插页。通常还将包括一套说明书。标记任选地在容器上或与容器相关联。举例来说，当形成标记的字母、数字或其它字符粘贴、模制或蚀刻到容器本身上时，标记位于容器上，当标记存在于还容纳容器的接收器或载剂内时，标记与容器相关联，例如，作为包装插入物。此外，标记用于指示内容物将用于特定治疗应用。此外，标记指示诸如在本文所述的方法中使用内容物的说明。在某些实施例中，医药组合物存在于包装或分配器装置中，其含有一或多个含有本文提供的化合物的单位剂型。包装可包含金属或塑料箔，例如泡罩包。在一些实施例中，包装或分配器装置附有投与说明书。任选地，包装或分配器附有与容器相关的由管理医药的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映机构对用于人或兽医投与的药物形式的批准。所述公告是(例如)由美国食品药品管理局批准用于处方药物的标记或经批准产品插页。在一些实施例中，制备含有调配于相容的医药载剂中的本文提供的化合物的组合物，置于适当容器中，并标记用于治疗所指示的病况。
[0527]
组合疗法
[0528]
本揭示内容的化合物和医药组合物可与一或多种治疗剂组合使用，所述治疗剂通过相同机制或不同机制起作用以治疗疾病。一或多种药剂可在单独组合物中或在相同组合物中依序或同时投与。用于组合疗法的有用药剂种类包括(但不限于)用于治疗心脏、肾、肺、肝、皮肤、免疫和肿瘤病况的化合物。
[0529]
在实践标的方法中的任一者中，alk5抑制剂和第二治疗剂可依序投与，其中在两
个不同时间点将两种药剂引入个体。两个时间点可相隔超过2小时、1天或更多天、1周或更多周、1个月或更多个月，或根据本文揭示的任何间歇方案时间表。
[0530]
在一些实施例中，alk5抑制剂和第二治疗剂同时投与。两种药剂可形成相同组合物的一部分，或两种药剂可以一或多个单位剂量提供。
[0531]
在一些实施例中，alk5抑制剂或第二治疗剂非经肠、经口、吸入、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、肌内、脂质体、经由导管或支架局部递送、皮下、脂肪内或鞘内投与。如本文所用，alk5抑制剂和第二治疗剂的组合的治疗有效量是指alk5抑制剂和第二治疗剂的组合，其中所述组合足以影响预期应用，包括(但不限于)如本文定义的疾病治疗。标的方法中还考虑组合使用亚治疗量的alk5抑制剂和第二治疗剂以治疗预期疾病病况。组合的个别组分尽管以亚治疗量存在，但在预期应用中协同地产生有效效应和/或减少副作用。
[0532]
投与的alk5抑制剂和第二治疗剂的量可根据预期应用(活体外或活体内)或个体和所治疗的疾病状况(例如个体的体重和年龄、疾病状况的严重程度)、投与方式等而变化，其可由所属领域技术人员容易地确定。
[0533]
测量alk5的免疫反应和/或生物效应的抑制可包含对生物样品(例如来自个体的样品)实施分析。根据分析，可选择多种样品中的任一者。样品的实例包括(但不限于)血液样品(例如血浆或血清)、呼出的呼吸冷凝物样品、支气管肺泡灌洗液、痰样品、尿液样品和组织样品。
[0534]
可监测用alk5抑制剂和第二治疗剂治疗的个体以确定治疗的有效性，并且可基于个体对治疗的生理反应调整治疗方案。举例来说，如果alk5抑制的生物效应的抑制高于或低于阈值，那么可分别降低或增加投药的量或频率。或者，可关于免疫反应调整治疗方案。所述方法可进一步包含如果确定疗法有效，那么继续所述疗法。所述方法可包含如果确定疗法有效，那么维持、渐减、减少或停止疗法中一或多种化合物的投与量。所述方法可包含如果确定化合物无效，那么增加疗法中一或多种化合物的投与量。或者，所述方法可包含如果确定治疗无效，那么停止治疗。在一些实施例中，如果生物效应的抑制高于或低于阈值，例如缺乏反应或不良反应，那么中断alk5抑制剂和第二治疗剂的治疗。生物效应可为各种生理指标中的任一者的变化。
[0535]
可与本文所揭示化合物组合使用的特定药剂包括(但不限于)(尼达尼布)和(吡非尼酮)。在一些实施例中，本文所揭示化合物与吡非尼酮组合投与，任选地其中吡非尼酮通过吸入投与。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗个体的纤维化(例如特发性肺纤维化)的方法，其包含向个体投与alk5抑制剂(例如表1中揭示的化合物)和尼达尼布或吡非尼酮。在一些实施例中，本揭示内容提供治疗个体的癌症(例如肺癌)的方法，其包含向个体投与alk5抑制剂(例如表1中揭示的化合物)和尼达尼布或吡非尼酮。
[0536]
在一些实施例中，本揭示内容提供治疗有需要的个体的增殖性病症(例如肺癌)的方法，其包含向所述个体投与alk5抑制剂和免疫治疗剂。tgf-β已显示调节淋巴细胞分化、抑制t细胞增殖和增强肿瘤生长。此外，tgf-β已显示阻止免疫疗法抗性患者中免疫系统的最优活化(参见洛菲克,s.(s.),肿瘤学杂志(j.oncolo.)2018,1-9；其以全文引用的方式并入本文中)。不希望受任何特定理论限制，本发明者预计alk5的抑制可增强特定免疫疗法的效能。因此，预计用免疫治疗剂(例如德瓦鲁单抗或派姆单抗)和alk5抑制剂(例如本揭示内容的化合物)的治疗可改善患有癌症的个体(例如患有非小细胞肺癌的个体)的临床
结果。预计所述组合产生协同效应。还预计协同组合用于放射疗法、免疫疗法和alk5抑制的三重组合。另外，alk5抑制剂即使当局部投与(例如，通过吸入投与肺)时，还可刺激局部和全身免疫反应，允许治疗局部递送部位以外的组织中的原发性或转移性肿瘤。举例来说，吸入的alk5抑制剂可与免疫治疗剂组合投与以治疗黑色素瘤、肾细胞癌、结肠癌或乳癌。
[0537]
在一些实施例中，alk5抑制剂和免疫治疗剂依序或同时投与。在一些实施例中，alk5抑制剂和免疫治疗剂在治疗增殖性疾病中比单独的任一药剂更有效。在一些实施例中，alk5抑制剂和免疫治疗剂在治疗增殖性病症中产生协同效应。协同效应可为在相当条件下大于以相当的量单独使用的任一药剂的治疗效应。协同效应可为大于通过将单独的每一药剂的效应相加所预计结果的治疗效应。在一些实施例中，增殖性病症是癌症病况。在一些实施例中，癌症病况是肺癌，例如非小细胞肺癌。
[0538]
术语“免疫治疗剂”是指诱发、增强、抑制或以其它方式修饰免疫反应的任何药剂。此包括将活性剂投与给个体、或对个体实施任何类型的介入或过程，目标是修饰免疫反应。免疫治疗剂可(例如)通过刺激增强内源性宿主免疫反应的机制或克服抑制内源性宿主免疫反应的机制来增加或增强个体中存在的免疫反应的有效性或功效。
[0539]“免疫反应”是指免疫系统的细胞(包括例如b淋巴细胞、t淋巴细胞、自然杀手(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性球、肥大细胞、骨髓衍生的阻抑细胞、树突细胞和嗜中性球)以及由这些细胞中的任一者或肝产生的可溶性巨分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或消除来自个体身体的入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其它异常细胞、或在自体免疫或病理性炎症的情形下正常人类细胞或组织。
[0540]
在一个实施例中，免疫治疗剂可包含pd-1抑制剂。在另一实施例中，免疫治疗剂可包含ctla-4抑制剂。在另一实施例中，免疫治疗剂可包含b7抑制剂。
[0541]
实例性pd-1抑制剂：适用于标的方法的pd-1抑制剂可选自多种类型的分子。举例来说，pd-1抑制剂可为生物或化学化合物，例如有机或无机分子、肽、肽模拟物、抗体或抗体的抗原结合片段。适用于标的方法的一些实例性试剂类别详述于以下部分中。用于本揭示内容的pd-1抑制剂可为业内已知的任何pd-1抑制剂，并且可包括在投与患者时导致患者中pd-1路径的抑制的任何实体。pd-1抑制剂可通过任何生物化学机制抑制pd-1，包括破坏pd-1/pd-l1、pd1/pd-l2和pd-l1/cd80相互作用中的任一或多者。
[0542]
在一些实施例中，pd-1抑制剂是抑制pd-1与其配体结合配偶体结合的分子。在特定方面中，pd-1配体结合配偶体是pd-l1和/或pd-l2。在另一实施例中，pd-1抑制剂是抑制pd-l1与其结合配偶体结合的分子。在特定方面中，pd-l1结合配偶体是pd1和/或cd80。在另一实施例中，pd-1抑制剂是抑制pd-l2与其结合配偶体结合的分子。在特定方面中，pd-l2结合配偶体是pd1。抑制剂可为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
[0543]
在一些实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-1抗体。在一些其它实施例中，抗pd-1抗体能够抑制pd-1与pd-l1之间的结合。在另一实施例中，抗pd-1抗体能够抑制pd-1与pd-l2之间的结合。在一些实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-l1抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体能够抑制pd-l1与pd-1之间和/或pd-l1与cd80之间的结合。在一些实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-l2抗体。在一些其它实施例中，抗pd-l2抗体能够抑制pd-1与pd-l2之间的结合。在另一实施例中，pd-1抑制剂是尼沃鲁单抗或派姆单抗。在一些实施例中，pd-1抑制剂选自阿替珠单抗、阿维鲁单抗、尼沃鲁单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗和bgb-a317。
[0544]
pd-1路径的抑制可增强患者中对癌细胞的免疫反应。pd-1与pd-l1之间的相互作用损害t细胞反应，如通过肿瘤浸润淋巴细胞(til)的减少和t细胞受体介导的增殖的减少所表达，导致t细胞无反应性、衰竭或细胞凋亡，和癌细胞的免疫逃避。此免疫抑制可通过使用pd-1抑制剂(包括例如抗pd-1和/或抗pd-l1抗体)抑制pd-l1与pd-1之间的局部相互作用而逆转。pd-1抑制剂可改善或恢复抗肿瘤t细胞功能。
[0545]
适用于本揭示内容的抗pd-1抗体可使用业内熟知的方法产生。实例性pd-1抑制剂包括(但不限于)：尼沃鲁单抗(bms936558)、派姆单抗(mk-3475)、匹利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、amp-514、bms-936559、rg7446(mpdl3280a)、mdx-1106(美达莱公司(medarex inc.))、msb0010718c、medi4736及hengrui mab005(wo 15/085847)。其它pd-1抗体和其它pd-1抑制剂包括以下中描述的那些：wo 04/056875、wo 06/121168、wo 07/005874、wo 08/156712、wo 09/014708、wo 09/114335、wo 09/101611、wo 10/036959、wo 10/089411、wo 10/027827、wo 10/077634、wo 11/066342、wo 12/145493、wo 13/019906、wo 13/181452、wo 14/022758、wo 14/100079、wo 14/206107、wo 15/036394、wo 15/085847、wo 15/112900、wo 15/112805、wo 15/112800、wo 15/109124、wo 15/061668、wo 15/048520、wo 15/044900、wo 15/036927、wo 15/035606；美国公开案第2015/0071910号；和美国专利第7,488,802号、第7,521,051号、第7,595,048号、第7,722,868号、第7,794,710号、第8,008,449号、第8,354,509号、第8,383,796号、第8,652,465号和第8,735,553号；所有所述专利都以引用方式并入本文中。一些抗pd-1抗体可从(例如)abcam(ab137132)、biolegend(eh12.2h7,rmp 1-14)和affymetrix ebioscience(j105,j116,m1h4)商业购得。
[0546]
实例性ctla-4抑制剂：适用于标的方法的ctla-4抑制剂可选自多种类型的分子。举例来说，ctla-4抑制剂可为生物或化学化合物，例如有机或无机分子、肽、肽模拟物、抗体或抗体的抗原结合片段。适用于标的方法的一些实例性试剂类别详述于以下部分中。用于本揭示内容的ctla-4抑制剂可为业内已知的任何ctla-4抑制剂，并且可包括在投与患者时导致患者中ctla-4路径的抑制的任何实体。ctla-4抑制剂可通过任何生化机制抑制ctla-4，包括破坏ctla-4/cd80和ctla-4/cd86相互作用中的一者或两者。
[0547]
在一些实施例中，ctla-4抑制剂是抑制ctla-4与其配体结合配偶体结合的分子。在特定方面中，ctla-4配体结合配偶体是cd80和/或cd86。在另一实施例中，ctla-4抑制剂是抑制cd80与其结合配偶体结合的分子。在特定方面中，cd80结合配偶体是ctla-4。在另一实施例中，ctla-4抑制剂是抑制cd86与其结合配偶体结合的分子。在特定方面中，cd86结合配偶体是ctla-4。抑制剂可为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
[0548]
在一些实施例中，ctla-4抑制剂是抗ctla-4抗体。在一些其它实施例中，抗ctla-4抗体能够抑制ctla-4与cd80之间的结合。在另一实施例中，抗ctla-4抗体能够抑制ctla-4与cd86之间的结合。在一些实施例中，ctla-4抑制剂是抗cd80抗体。在一些实施例中，抗cd80抗体能够抑制ctla-4与cd80之间的结合。在一些实施例中，ctla-4抑制剂是抗cd86抗体。在一些其它实施例中，抗cd86抗体能够抑制ctla-4与cd86之间的结合。在另一实施例中，ctla-4抑制剂是曲美目单抗或伊匹单抗。
[0549]
ctla-4路径的抑制可增强患者中对癌细胞的免疫反应。ctla-4与其天然配体cd80和cd86的一之间的相互作用将负调节信号递送到t细胞。此免疫抑制可通过使用ctla-4抑制剂(包括例如抗ctla-4抗体、抗cd80抗体或抗cd86抗体)抑制cd80或cd86与ctla-4之间的
局部相互作用而逆转。ctla-4抑制剂可改善或恢复抗肿瘤t细胞的功能。
[0550]
适用于本揭示内容的抗ctla-4抗体可使用业内熟知的方法产生。实例性ctla-4抑制剂包括(但不限于)曲美目单抗和伊匹单抗(也称为10d1或mdx-010)。其它ctla-4抗体和其它ctla-4抑制剂包括以下中描述的那些：wo98/042752,wo00/037504,wo01/014424和wo04/035607；美国公开案第2002/0039581号、第2002/086014号和第2005/0201994号；美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第5,977,318号、第6,051,227号、第6,207,156号、第6,682,736号、第6,984,720号、第7,109,003号、第7,132,281号、第7,605,238号、第8,143,379号、第8,318,916号、第8,435,516号、第8,784,815号和第8,883,984号；欧洲专利第1212422号；赫维茨(hurwitz)等人,美国国家科学院院刊(pnas)1998,95(17):10067-10071；卡马乔(camacho)等人，临床肿瘤学杂志(jclinoncology)2004,22(145):摘要编号2505(抗体cp675206)；和莫克尔(mokyr)等人，癌症研究1998,58:5301-5304；其各自以引用方式并入本文中。
[0551]
本文还提供医药组合物，其包含本揭示内容的化合物或其医药上可接受的盐和一或多种其它治疗剂。治疗剂可选自上文指定的药剂种类和选自上文描述的具体药剂的清单。在一些实施例中，医药组合物适于递送到肺。在一些实施例中，医药组合物适于吸入或雾化投与。在一些实施例中，医药组合物是干粉或液体组合物。
[0552]
此外，在方法方面，本揭示内容提供治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，其包含向哺乳动物投与本揭示内容的化合物或其医药上可接受的盐和一或多种其它治疗剂。
[0553]
当在组合疗法中使用时，药剂可调配成单一医药组合物，或药剂可以同时或在不同时间通过相同或不同投与途径投与的单独组合物提供。所述组合物可单独包装或可作为试剂盒一起包装。试剂盒中的两种或更多种治疗剂可通过相同投与途径或通过不同投与途径投与。
[0554]
实例
[0555]
以下实例是出于阐释本揭示内容的各个实施例的目的给出且不打算以任何方式限制本揭示内容。本发明实例以及本文所述的方法和组合物目前代表优选实施例，具有实例性，并且不打算限制本揭示内容的范围。所属领域技术人员将了解其中的变化和如由权利要求书的范围界定的本揭示内容的精神内涵盖的其它用途。
[0556]
除非另外指示，否则下列缩写具有下列含义且本文使用且未定义的任何其它缩写具有其公认的标准含义：
[0557]
acoh＝乙酸
[0558]
acona＝乙酸钠
[0559]
acn＝乙腈
[0560]
atm＝大气压
[0561]
binap＝(
±
)-2,2
′‑
双(二苯基膦基)-1,1
′‑
联萘
[0562]
boc2o＝二碳酸二-叔丁基酯
[0563]
(bpin)2＝双(频哪醇合)二硼
[0564]
brettphos＝2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2
′
,4
′
,6
′‑
三异丙基-1,1
’‑
联苯
[0565]
brettphospdg4＝甲烷磺酸n-经取代的2-氨基联苯钯前触媒
[0566]
bsa＝牛血清白蛋白，部分v
[0567]
cp*rucl(pph3)2＝五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(ii)
[0568]
d＝天
[0569]
dast＝二乙基氨基三氟化硫
[0570]
dcc＝n,n
’‑
二环己基碳化二亚胺
[0571]
dce＝1,2-二氯乙烷
[0572]
dcm＝二氯甲烷(dichloromethane或methylenechloride)
[0573]
dhp＝二氢吡喃
[0574]
diad＝偶氮二甲酸二异丙基酯
[0575]
dibah＝二异丁基氢化铝
[0576]
dipea或diea＝n,n-二异丙基乙胺
[0577]
dma或dmac＝二甲基乙酰胺
[0578]
dmap＝4-二甲基氨基吡啶
[0579]
dmeda＝1,2-双(甲基氨基)乙烷
[0580]
dmf＝n,n-二甲基甲酰胺
[0581]
dmp＝戴斯-马丁过碘烷(dess-martinperiodinane)
[0582]
dmso＝二甲基亚砜
[0583]
dppa＝二苯基磷酰基叠氮化物
[0584]
dppf＝1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁
[0585]
dtt＝二硫苏糖醇
[0586]
edci＝n-乙基-n
′‑
(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐
[0587]
edta＝乙二胺四乙酸
[0588]
egta＝乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸
[0589]
etoh＝乙醇
[0590]
etoac或ea＝乙酸乙酯
[0591]
g＝克
[0592]
h＝小时
[0593]
hatu＝六氟磷酸n,n,n',n'-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑1-基)脲鎓盐
[0594]
hepes＝4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸
[0595]
hobt＝羟基苯并三唑
[0596]
i-probpin＝2-异丙基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷
[0597]
ipa或i-proh＝异丙醇
[0598]
khmds＝双(三甲基硅基)酰胺钾
[0599]
lah＝氢化铝锂
[0600]
lda＝二异丙基酰胺锂
[0601]
lihdms＝六甲基二硅氮烷锂盐
[0602]
m-cpba＝间-氯过苯甲酸
[0603]
mecn＝乙腈
[0604]
meoh＝甲醇
[0605]
min＝分钟
[0606]
mtbe＝甲基叔丁基醚
[0607]
nahdms＝六甲基二硅氮烷钠盐
[0608]
nbs＝n-溴琥珀酰亚胺
[0609]
n-buli＝正丁基锂
[0610]
pd(dppf)cl2＝[1,1
′‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)
[0611]
pd(oac)2＝乙酸钯(ii)
[0612]
pd(pph3)4＝四(三苯基膦)钯(0)
[0613]
pd/c＝活性碳载钯，10％载量
[0614]
pd2(dba)3＝三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
[0615]
pe＝石油醚
[0616]
phn2＝苯重氮离子
[0617]
ptsa＝对甲苯磺酸
[0618]
rt、rt或r.t.＝室温
[0619]
ruphos＝2-二环己基膦基-2’,6
’‑
二异丙氧基联苯
[0620]
ruphospdg2＝氯(2-二环己基膦基-2
′
,6
′‑
二异丙基-1,1
′‑
联苯)[2-(2
′‑
氨基-1,1
′‑
联苯)]钯(ii)
[0621]
ruphospdg4＝布赫瓦尔德(buchwald)第四代palladacycle的配体
[0622]
semcl＝氯化2-(三甲基硅基)乙氧基甲基
[0623]
sio2＝二氧化硅(silicondioxide或silica)
[0624]
sphospdg3＝甲烷磺酸(2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯)]钯(ii)
[0625]
stab＝三乙酰氧基硼氢化钠
[0626]
tbab＝四丁基溴化铵
[0627]
tbscl＝叔丁基二甲基氯硅烷
[0628]
t-buok＝叔丁醇钾
[0629]
t-buona＝叔丁醇钠
[0630]
tea、et3n＝三乙胺
[0631]
tfa＝三氟乙酸
[0632]
tfaa＝三氟乙酸酐
[0633]
thf＝四氢呋喃
[0634]
tms＝四甲基硅烷
[0635]
toscl＝对甲苯磺酰氯
[0636]
tris-hcl＝三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
[0637]
tween-20＝聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯
[0638]
xantphos＝4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨
[0639]
xphospdg4＝布赫瓦尔德第四代palladacycle
[0640]
除非另有说明，否则所有材料(例如试剂、起始材料和溶剂)都购自商业供应商，例如西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich)、flukariedel-de等，并且不经进一步纯化即使用。
[0641]
除非另有说明，否则反应在氮气氛下运行。通过薄层色谱(tlc)、分析型高效液相色谱(分析型hplc)及质谱来监测反应进程，其细节在具体实例中给出。
[0642]
反应按照每一制备中特定描述进行；通常，通过萃取和其它纯化方法(例如温度和溶剂依赖性结晶和沉淀)来纯化反应混合物。另外，通常通过制备型hplc通常使用microsorb c18和microsorb bds管柱填料和常规洗脱液来纯化反应混合物。通常通过液相色谱质谱(lcms)监测反应进程。通常通过核奥佛豪瑟效应频谱(nuclear overhauser effect spectroscopy，noe)进行异构体的表征。通常通过质谱和/或1h-nmr光谱进行反应产物的表征。对于nmr测量，将样品溶解于氘化溶剂(cd3od、cdcl3或dmso-d6)中，并在标准观察条件下用varian gemini 2000仪器(400mhz)获得1h-nmr光谱。通常使用电喷雾离子化方法(esms)用应用生物系统(applied biosystems)(福斯特城(foster city),加利福尼亚州(ca))型号api 150ex仪器或安捷伦(agilent)(帕洛阿尔托(palo alto),加利福尼亚州)型号1200lc/msd仪器执行化合物的质谱鉴别。
[0643]
实例1：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(475)的合成.
[0644][0645]
步骤a：6-甲基甲基吡啶亚胺甲酯(1-2)的制备.于0℃下向1-1(50.0g,423.3mmol)于meoh(300ml)中的溶液中添加25％于meoh中的naome(100ml,465mmol)。然后将反应物于25℃下搅拌16h。在真空中浓缩反应混合物并将粗制残余物溶解于etoac中。向溶液中添加盐水且观察到白色固体沉淀。过滤悬浮液并分离滤液的有机层。用盐水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，以产生粗制残余物1-2(58.0g)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。c8h
10
n2o的[m h]

计算值150.18,实验值151.05。
[0646]
步骤b：6-甲基2-脒基吡啶氯化氢(1-3)的制备.向1-2(58.0g,386.6mmol)于etoh(250ml)和h2o(25ml)中的溶液中添加nh4cl(22.9g,425.02mmol)且将反应物于80℃下搅拌16h。将反应物浓缩至干燥。将粗制残余物在etoac中研磨且然后过滤以去除非极性杂质。用过量etoh处理固体沉淀且过滤。浓缩滤液以获得所需产物1-3的hcl盐(55.0g)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。c7h9n3的[m h]

计算值135.17,实验值136.10。
[0647]
步骤c：2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4(3h)-酮(1-5)的制备.向1-3(55.0g,407.4mmol)和1-4(46.4ml,427.7mmol)于etoh(385ml)中的溶液中添加k2co3(112.4g,814.8mmol)。将反应物于80℃下搅拌16h。将反应物冷却到25℃，经由硅藻土垫过滤并浓缩，以产生粗产物。将粗产物用4n hcl酸化且与etoac一起研磨，然后过滤，以产生1-5的hcl盐
(65.0g)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
10
h9n3o的[m h]

计算值187.20,实验值187.17。
[0648]
步骤d：4-氯-2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶(1-6)的制备.向1-5(10.0g,53.41mmol,hcl盐)于1,4-二噁烷(70ml)中的溶液中添加pocl3(15.0ml,160.25mmol)。将反应物于90℃下搅拌16h，然后浓缩至干燥。将粗制残余物倾倒到冰冷水上。通过饱和nahco3将ph调整到8。然后用etoac萃取混合物。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩，以产生粗产物。将粗制残余物在戊烷中研磨且过滤，以产生1-6(5.0g)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
10
h8cln3的[m h]

计算值205.65,实验值206.09。
[0649]
步骤e：2-氯-n-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-4-胺(1-8)的制备.于0℃下向1-6(3.0g,14.63mmol)和1-7(2.26g,17.56mmol)于dmf(15ml)中的溶液中添加固体粉碎的naoh(1.17g,29.26mmol)。将反应物于25℃下搅拌16h。将反应物倾倒到冰冷水上且固体沉淀。通过过滤收集固体并干燥。将粗制残余物与醚和acn一起研磨，以产生1-8(3.5g)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
14h11
cln6的[m h]

计算值298.73,实验值298.94。
[0650]
步骤f：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(475)的制备.向1-8(250mg,0.84mmol)于1,4-二噁烷(10ml)中的溶液中添加1-9(298mg,1.67mmol)、pd2(dba)3(77mg,0.08mmol)、xantphos(48mg,0.08mmol)、cs2co3(545mg,1.67mmol)且将所得混合物于100℃下在n2下加热6h。在真空中浓缩反应混合物。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％氢氧化铵的乙腈于水中的梯度(25到55％)纯化残余物，以获得白色固体状标题化合物(62mg)。c
24h24
n8o的[m h]

计算值440.51,实验值441.4。
[0651]
实例2：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(418)的合成.
[0652][0653]
将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(20mg,0.067mmol)、2-1(30mg,0.100mmol)、碳酸铯(32.7mg,0.100mmol)、brettphos(3.59mg,6.69μmol)和brettphos pd g4(6.16mg,6.69μmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于25℃下搅拌2h。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到30％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(27.2mg)。c
24h25
n9的[m h]

计算值439.53,实验值440.2。
[0654]
实例3：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2,4-二胺(121)的合成.
[0655]
[0656]
将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(20mg,0.067mmol)、3-1(30mg,0.100mmol)、碳酸铯(32.7mg,0.100mmol)、brettphos(3.59mg,6.69μmol)和brettphos pd g4(6.16mg,6.69μmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于25℃下搅拌2h。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到30％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(28.6mg)。c
23h24n10
的[m h]

计算值440.52,实验值441.3。
[0657]
实例4：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)嘧啶-2,4-二胺(86)的合成.
[0658][0659]
步骤a：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(4-1)的制备.向1-8(238mg,0.797mmol)的小瓶中添加氨溶液(7n，于meoh中)(4ml,28.0mmol)。将所得悬浮液于80℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。通过硅胶色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化粗制残余物，以产生褐色固体状4-1(108mg)。c
13h13
n7的[m h]

计算值279.31,实验值280.0。
[0660]
步骤b：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)嘧啶-2,4-二胺(86)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的4-1(24.41mg,0.087mmol)、4-2(20mg,0.058mmol)、叔丁醇钠(11.20mg,0.117mmol)、brettphos(6.26mg,0.012mmol)和brettphos pd g4(10.73mg,0.012mmol)的小瓶于110℃下加热1h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)且于50℃下加热2h。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(17.2mg)。c
22h23n11
的[m h]

计算值441.50,实验值442.2。
[0661]
实例5：(r)-(4-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-2-基)甲醇(403)的合成.
[0662][0663]
步骤a：(r)-2-(羟基甲基)-4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(5-3)的制备.将5-1(98mg,0.694mmol)、5-2(150mg,0.694mmol)和dipea(1.21ml,6.94mmol)于dmf(3ml)中的溶液于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化粗制残余物，以产生橙色油状5-3(157mg)。c
16h23
n3o5的[m h]

计算值337.38,实验值338.4。
[0664]
步骤b：(r)-4-(4-氨基苯基)-2-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(5-4)的制备.将5-3(157mg,0.465mmol)的溶液吸收于乙醇(3ml)中，并且添加pd/c(9.90mg,9.31μmol)且在h2气氛下吹扫反应混合物且于25℃下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中浓缩且粗制残余物5-4(140mg)直接用于下一步骤。c
16h25
n3o3的[m h]

计算值307.40,实验值308.0。
[0665]
步骤c：(r)-(4-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-2-基)甲醇(403)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1.5ml)中的1-8(25mg,0.084mmol)、5-4(25.7mg,0.084mmol)、碳酸铯(35.4mg,0.109mmol)、brettphos(2.25mg,4.18μmol)和brettphos pd g4(3.85mg,4.18μmol)的小瓶加热到110℃并保持16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(226μl)和dcm(118μl)且于45℃下搅拌30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(10.2mg)。c
25h27
n9o的[m h]

计算值469.55,实验值470.1。
[0666]
实例6：n2-(4-((氮杂环丁-3-基甲基)氨基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(537)的合成.
[0667][0668]
步骤a：3-(((4-氨基苯基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(6-2)的制备.将5-1(65mg,0.461mmol)、6-1(86mg,0.461mmol)和dipea(805μl,4.61mmol)于dmf(1ml)中的溶液于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱使用etoac于己烷中的梯度(0到60％)纯化粗产物，以产生橙色油状3-(((4-硝基苯基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(53mg,37％产率)。c
15h21
n3o4的[m h]

计算值307.35,实验值308.6。将橙色油状物(53mg,0.172mmol)吸收于乙醇(3ml)中，并且添加pd/c(2.42mg,0.017mmol)且在h2气氛下吹扫反应混合物且于25℃下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中浓缩，以提供作为粗制残余物的6-2(44mg,92％产率)，其不经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
15h23
n3o2的[m h]

计算值277.37,实验值277.2。
[0669]
步骤b：n2-(4-((氮杂环丁-3-基甲基)氨基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(537)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1.62ml)中的1-8(48mg,0.162mmol)、6-2(44mg,0.159mmol)、碳酸铯(211mg,0.647mmol)、brettphos(35mg,0.065mmol)和brettphos pd g4(60mg,0.065mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1.24ml)和dcm(1.04ml)且于45℃下搅拌30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(10.7mg)。c
24h25
n9的[m h]

计算值439.53,实验值440.1。
[0670]
实例7：n2-(4-((氮杂环丁-3-基甲基)(甲基)氨基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(202)的合成.
[0671][0672]
步骤a：3-(((4-氨基苯基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(7-2)的制备.将5-1(65mg,0.461mmol)、7-1(92mg,0.461mmol)和dipea(805μl,4.61mmol)于dmf(1ml)中的溶液于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱使用etoac于己烷中的梯度(0到60％)纯化粗产物，以产生橙色油状3-((甲基(4-硝基苯基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(118mg,80％产率)。c
16h23
n3o4的[m h]

计算值321.38,实验值322.2。将橙色油状物(118mg,0.367mmol)吸收于乙醇(3ml)中，并且添加pd/c(2.42mg,0.017mmol)且在h2气氛下吹扫反应混合物且于25℃下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中浓缩，并且粗制残余物7-2(113mg)直接用于下一步骤。c
16h25
n3o2的[m h]

计算值291.40,实验值291.2。
[0673]
步骤b：n2-(4-((氮杂环丁-3-基甲基)(甲基)氨基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(202)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1.62ml)中的1-8(97mg,0.323mmol)、7-2(113mg,0.159mmol)、碳酸铯(211mg,0.647mmol)、brettphos(35mg,0.065mmol)和brettphos pd g4(60mg,0.065mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1.24ml)和dcm(1.04ml)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(45.5mg)。c
25h27
n9的[m h]

计算值453.55,实验值454.2。
[0674]
实例8：(r)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(吡咯烷-3-基氨基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(278)的合成.
[0675][0676]
步骤a：(r)-3-((4-氨基苯基)氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(8-2)的制备.将5-1(100mg,0.709mmol)、8-1(132mg,0.709mmol)和dipea(1.24ml,7.09mmol)于dmf(3ml)中的溶液于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱使用etoac于己烷中的梯度(0到60％)纯化粗产物，以产生黄色油状(r)-3-((4-硝基苯基)氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(130mg,60％产率)。c
15h21
n3o4的[m h]

计算值307.35,实验值308.5。将黄色油状物(130mg,0.423mmol)吸收于乙醇(3ml)中，添加pd/c(4.55mg,0.032mmol)且在h2气氛下吹扫反应混合物且于25℃下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中浓缩，以获得粗制残余物8-2(100mg)，其不经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
15h23
n3o2的[m h]

计算值277.37,实验值277.3。
[0677]
步骤b：(r)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(吡咯烷-3-基氨基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(278)的制备.将脱气1,4-二噁烷(4ml)中的1-8(45mg,0.151mmol)、8-2(50.1mg,0.181mmol)、碳酸铯(98mg,0.301mmol)、brettphos(8.09mg,0.015mmol)和
brettphos pd g4(13.87mg,0.015mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(580μl)和dcm(485μl)且将所得混合物于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(30.7mg)。c
24h25
n9的[m h]

计算值439.53,实验值440.1。
[0678]
实例9：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(108)的合成.
[0679][0680]
将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(30mg,0.100mmol)、9-1(21mg,0.121mmol)、碳酸铯(42.5mg,0.131mmol)、brettphos(2.70mg,5.02μmol)和brettphos pd g4(4.62mg,5.02μmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(12.7mg)。c
20h18
n8o2s的[m h]

计算值434.48,实验值435.0。
[0681]
实例10：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(5-吗啉基噻唑-2-基)嘧啶-2,4-二胺(555)的合成.
[0682][0683]
将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(20mg,0.067mmol)、10-1(24.8mg,0.134mmol)、碳酸铯(43.6mg,0.134mmol)、brettphos(7.19mg,0.013mmol)和brettphos pd g4(12.33mg,0.013mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(7.7mg)。c
21h21
n9os的[m h]

计算值447.52,实验值448.2。
[0684]
实例11：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(吡咯烷-3-基甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(489)的合成.
[0685][0686]
步骤a：(e)-3-(4-溴亚苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(11-3)的制备.于0℃下向11-1(2.0g,10.8mmol)于dmf(40ml)中的溶液中添加nah(561mg,14.0mmol)。将反应混合物于0℃下搅拌30min，然后添加dmf(10ml)中的11-2(6.1g,11.9mmol)。将反应混合物于65℃下加热12h。将混合物倾倒到h2o(400ml)中，用ea(200ml x3)萃取白色悬浮液，用饱和nacl(200ml x3)洗涤合并的有机相，经固体na2so4干燥，并且在减压下浓缩。通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(0到5％)纯化残余物，以产生无色油状11-3(800mg)。
[0687]
步骤b：(e)-3-(4-((二苯基亚甲基)氨基)亚苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(11-5)的制备.在n2气氛下向11-3(800mg,2.36mmol)、11-4(472mg,3.60mmol)和tbuona(364mg,3.78mmol)于甲苯(15ml)中的混合物中添加pd2(dba)3(65mg,0.071mmol)和binap(147mg,0.236mmol)。将反应混合物用n2脱气若干次，然后于90℃下加热4h。在减压下浓缩反应混合物。通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(0到10％)纯化残余物，以产生黄色油状11-5(800mg)。
[0688]
步骤c：(e)-3-(4-氨基亚苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(11-6)的制备.在n2气氛下向11-5(800mg,1.31mmol)于meoh(10ml)中的混合物中添加honh2·
hcl(200mg,2.89mmol)和naoac(323mg,3.94mmol)。将反应混合物于50℃下加热12h。将反应混合物用h2o(10ml)稀释且在etoac(10ml x3)中萃取产物，将合并的有机层经na2so4干燥且在减压下浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.225％甲酸的乙腈于水中的梯度(30到60％)纯化残余物，以产生浅黄色油状11-6(150mg)。c
16h22
n2o2的[m h]

计算值274.36,实验值275.2。
[0689]
步骤d：3-(4-氨基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(11-7)的制备.向11-6(250mg,0.911mmol)于meoh(15ml)中的溶液中添加pd/c(30mg,10％)。将反应混合物用h2脱气若干次，然后于20℃下搅拌1h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在减压下浓缩滤液。通过制备型hplc色谱使用具有0.225％甲酸的乙腈于水中的梯度(23到53％)纯化残余物，以产生黄色固体状11-7(100mg)。c
16h24
n2o2的[m na]

计算值299.37,实验值299.2。
[0690]
步骤e：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(吡咯烷-3-基甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(489)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(30mg,0.100mmol)、11-7(33.3mg,0.121mmol)、碳酸铯(65.4mg,0.201mmol)、xantphos(11.62mg,0.020mmol)和pd(oac)2(4.51mg,0.020mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到50％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(24.9mg)。c
25h26
n8的[m h]

计算值438.54,实验值439.2。
[0691]
实例12：n2-(3-异丙基-2,3,4,5-四氢-1h-苯并[d]氮呯-7-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(223)的合成.
[0692][0693]
步骤a：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(2,3,4,5-四氢-1h-苯并[d]氮呯-7-基)嘧啶-2,4-二胺(12-2)的制备.将脱气1,4-二噁烷(586μl)中的1-8(35mg,0.117mmol)、12-1(46.1mg,0.176mmol)、碳酸铯(76mg,0.234mmol)、brettphos(12.58mg,0.023mmol)和brettphos pd g4(21.57mg,0.023mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(468μl)和dcm(348μl)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到30％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(76mg)。c
24h24
n8的[m h]

计算值424.51,实验值425.1。
[0694]
步骤b：n2-(3-异丙基-2,3,4,5-四氢-1h-苯并[d]氮呯-7-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(223)的制备.将dmf(276μl)中的12-2(18mg,0.028mmol)、2-溴丙烷(10.18mg,0.083mmol)和diea(48.2μl,0.276mmol)的小瓶于110℃下加热8h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(2.3mg)。c
27h30
n8的[m h]

计算值466.59,实验值467.3。
[0695]
实例13：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)嘧啶-2,4-二胺(175)的合成.
[0696][0697]
将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(25mg,0.075mmol)、13-1(28mg,0.112mmol)、碳酸铯(48.6mg,0.149mmol)、brettphos(8.01mg,0.015mmol)和brettphos pd g4(13.73mg,0.015mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于25℃下搅拌1h。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(16.7mg)。c
23h22
n8的[m h]

计算值410.49,实验值411.1。
[0698]
实例14：n2-(4-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(221)的合成.
[0699][0700]
步骤a：8-(4-氨基苯基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁基酯(14-2)的
制备.将5-1(75mg,0.532mmol)、14-1(124mg,0.585mmol)和碳酸钾(147mg,1.063mmol)于dmf(1.77ml)中的溶液于80℃下加热16h。在真空中浓缩反应物。通过硅胶色谱使用具有2.5％三乙胺的meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化粗产物，以产生橙色固体状8-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁基酯(68mg,39％产率)。c
17h23
n3o4的[m h]

计算值333.39,实验值334.0。将橙色固体(68mg,0.204mmol)吸收于乙醇(1.61ml)中，并且添加pd/c(51.4mg,0.097mmol)且在h2气氛下吹扫反应混合物且于25℃下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中浓缩，以产生粗制残余物14-2(55mg)，其直接用于下一步骤。c
15h25
n3o2的[m h]

计算值303.41,实验值304.0。
[0701]
步骤b：n2-(4-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(221)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1.5ml)中的1-8(25mg,0.084mmol)、14-2(25.4mg,0.084mmol)、碳酸铯(35.4mg,0.109mmol)、brettphos(2.25mg,4.18μmol)和brettphos pd g4(3.85mg,4.18μmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(226μl)和dcm(188μl)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(3.6mg)。c
26h27
n9的[m h]

计算值465.57,实验值466.1。
[0702]
实例15：n2-(1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-5-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(277)的合成.
[0703][0704]
步骤a：2,3-二氢-1h-茚-2-甲酸乙酯(15-2)的制备.向15-1(10g,61.6mmol)于乙醇(300ml)中的混合物中添加h2so4(36ml)。将混合物于75℃下加热48h。浓缩反应混合物且将残余物分配在etoac(200ml)与h2o(200ml)之间。将反应混合物通过5n naoh aq.碱化到ph＝11，然后分离有机层。用etoac(200ml x2)萃取水层且合并所有有机层且经na2so4干燥。在真空中浓缩，产生无色油状15-2(10.5g)。
[0705]
步骤b：2-烯丙基-2,3-二氢-1h-茚-2-甲酸乙酯(15-4)的制备.于-78℃下向15-2(6.0g,31.5mmol)于thf(120ml)中的溶液中逐滴添加nahmds(38ml,37.8mmol)、将反应混合物于-78℃下在n2下搅拌1h，然后于-78℃下添加15-3(4.6g,37.8mmol)。将反应混合物于-78℃下搅拌2h。将反应混合物用饱和nh4cl aq(120ml)稀释，然后用etoac(150ml x3)萃取。
将合并的有机层在真空中浓缩且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(0到2％)纯化，以获得无色油状15-4(6.5g)。
[0706]
步骤c：2-(2-氧代乙基)-2,3-二氢-1h-茚-2-甲酸乙酯(15-5)的制备.将15-4(6.5g,28.2mmol)于dcm(80ml)中的溶液冷却到-78℃。使o3鼓泡通过溶液达15min，此时浅蓝色持续存在。然后逐滴添加tea(5.7g,56.4mmol)且将混合物于25℃下搅拌1.75h。将反应混合物用饱和nahco
3 aq(150ml)稀释，然后用dcm(150ml x3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，过滤且在真空中浓缩，以获得浅黄色油状15-5(6.0g)，其直接用于下一步骤。
[0707]
步骤d：1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-2'-酮(15-6)的制备.向15-5(1.0g,4.30mmol)于meoh(25ml)和acoh(25ml)中的溶液中添加nh4oac(16.6g,215.0mmol)，将混合物于25℃下搅拌4h。然后添加nacnbh3(405mg,6.45mmol)且将混合物于25℃下搅拌12h。将反应混合物用饱和nahco
3 aq(250ml)稀释且用dcm(150ml x3)萃取。用na2so4干燥合并的有机层并在真空中浓缩。将残余物溶解于甲苯(10ml)中且于110℃下加热2h。在真空中浓缩反应混合物且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(10到100％)纯化，以获得白色固体状15-6(160mg)。
[0708]
步骤e：5-硝基-1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-2'-酮(15-7)的制备.将15-6(900mg,4.80mmol)于hno3(20ml,70％)中的溶液于0℃下搅拌2h。将反应混合物用h2o(30ml)稀释且用dcm(30ml x3)萃取。在真空中浓缩合并的有机层且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(10到80％)纯化，以获得浅黄色固体状15-7(700mg)。
[0709]
步骤f：5-硝基-1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷](15-8)的制备.向15-7(100mg,0.43mmol)于thf(4ml)中的溶液中添加b2h
6-me2s(0.8ml,8.60mmol)，然后将混合物于45℃下加热16h。将反应混合物用meoh(50ml)淬灭，然后在真空中浓缩且通过利用具有0.05％hcl的水中的乙腈的制备型hplc色谱纯化，以获得浅黄色油状15-8(50mg)。c
12h14
n2o2的[m h]

计算值218.26,实验值219.1。
[0710]
步骤g：5-硝基-1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-1'-甲酸叔丁基酯(15-9)的制备.向15-8(217mg,0.99mmol)、dmap(61mg,0.50mmol)和tea(1.0g,9.90mmol)于thf(10ml)中的溶液中添加boc2o(648mg,2.97mmol)，然后将反应混合物于45℃下加热2h。将反应混合物用h2o(20ml)稀释且用etoac(20ml x3)萃取。在真空中浓缩合并的有机层且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(0到20％)纯化，以获得浅黄色油状15-9(250mg)。
[0711]
步骤h：5-氨基-1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-1'-甲酸叔丁基酯(15-10)的制备.向15-9(40mg,0.12mmol)于meoh(3ml)中的溶液中添加pd/c(10mg,10％)，然后将所得混合物于25℃下在h2气氛(15psi)下搅拌2h。过滤反应混合物并在真空中浓缩。残余物通过制备型hplc色谱(乙腈于水中，含有0.225％甲酸)纯化，然后在0℃下通过添加饱和nahco3水溶液将水相调整到ph＝8，并将产物在0℃下在dcm(10ml x3)中萃取。合并的有机层在0℃下用盐水(30ml x3)洗涤，经na2so4干燥并在真空中浓缩，以获得黄色固体状15-9(35mg)。c
17h24
n2o2的[m na]

计算值311.38,实验值311.1。
[0712]
步骤i：n2-(1,3-二氢螺[茚-2,3'-吡咯烷]-5-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(277)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(25mg,0.075mmol)、15-10(28mg,0.112mmol)、碳酸铯(48.6mg,0.149mmol)、brettphos(8.01mg,0.015mmol)和brettphos pd g4(13.73mg,0.015mmol)的小瓶加热到110℃并保持16h。在真
空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(16.7mg)。c
23h22
n8的[m h]

计算值410.49,实验值411.1。
[0713]
实例16：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(1-(2-吗啉基乙基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺(84)的合成.
[0714][0715]
步骤a：4-(2-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)乙基)吗啉(16-3)的制备.向16-1(0.5g,4.42mmol)于dmf(5.0ml)中的搅拌溶液中添加k2co3(1.83g,13.26mmol)和16-2(1.06g,5.52mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌16h。将反应混合物用冰冷水稀释且用etoac(50ml x3)萃取。将合并的有机层用冰冷水、盐水洗涤且经无水na2so4干燥，过滤且在减压下浓缩，以获得粘性液体状粗制残余物16-3(550mg)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
[0716]
步骤b：1-(2-吗啉基乙基)-1h-吡唑-4-胺(16-4)的制备.向16-3(500mg,2.2mmol)于etoac(25ml)中的溶液中添加10％pd/c(50mg)。将反应混合物于25℃下在h2气囊压力下搅拌16h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在减压下浓缩滤液，以得到粘性液体状粗制残余物16-4(275mg)。粗产物未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
[0717]
步骤c：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(1-(2-吗啉基乙基)-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2,4-二胺(84)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1ml)中的1-8(20mg,0.067mmol)、16-4(20mg,0.100mmol)、碳酸铯(43.6mg,0.134mmol)、brettphos(7.19mg,0.013mmol)和brettphos pd g4(12.33mg,0.013mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于25℃下搅拌16h。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到20％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(10mg)。c
23h26n10
o的[m h]

计算值458.53,实验值459.2。
[0718]
实例17：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(1-(氧杂环丁-3-基)-1h-吡唑-4-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(538)的合成.
[0719][0720]
步骤a：n2-(4-溴苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(17-2)的制备.将乙醇(8ml)中的1-8(485mg,1.624mmol)和17-1(559mg,3.25mmol)的小瓶
于80℃下加热16h。通过真空过滤收集来自反应混合物的沉淀，以产生粗制残余物17-2(620mg)，其不经进一步纯化即直接用于下一步骤。c
20h16
brn7的[m h]

计算值434.30,实验值436.2。
[0721]
步骤b：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(1-(氧杂环丁-3-基)-1h-吡唑-4-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(538)的制备.将脱气1,4-二噁烷(461μl)和h2o(115μl)中的17-2(25mg,0.058mmol)、17-3(21.6mg,0.086mmol)、磷酸钾(36.7mg,0.173mmol)、乙酸钯(ii)(2.58mg,0.012mmol)和dppf(5.46mg,0.012mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(5.4mg)。c
26h23
n9o的[m h]

计算值477.53,实验值478.1。
[0722]
实例18：n2-(4-(1-(2-(甲基氨基)乙基)-1h-吡唑-4-基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(347)的合成.
[0723][0724]
步骤a：(2-(4-(4-氨基苯基)-1h-吡唑-1-基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯(18-2)的制备.将脱气1,4-二噁烷(1218μl)和h2o(304μl)中的18-1(96mg,0.274mmol)、17-1(39.3mg,0.228mmol)、碳酸钾(95mg,0.685mmol)和pd(dppf)cl2(33.4mg,0.046mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(10到50％)纯化残余物，以得到18-2的tfa盐(32mg)。c
17h24
n4o2的[m h]

计算值316.41,实验值317.2。
[0725]
步骤b：n2-(4-(1-(2-(甲基氨基)乙基)-1h-吡唑-4-基)苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(347)的制备.将脱气1,4-二噁烷(418μl)中的1-8(25mg,0.084mmol)、18-2(34.4mg,0.109mmol)、碳酸铯(54.5mg,0.167mmol)、brettphos(8.98mg,0.017mmol)和brettphos pd g4(15.41mg,0.017mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(226μl)和dcm(188μl)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(26.9mg)。c
26h26n10
的[m h]

计算值478.56,实验值479.2。
[0726]
实例19：n4-(2-(3-甲基-1h-吲唑-4-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(19-6)的合成.
[0727][0728]
步骤a：双(2-氯嘧啶-4-基)胺(19-2)的制备.将19-1(11.5g,77.2mmol)、1-7(10.0g,77.2mmol)和cs2co3(50.3g,154mmol)于dmf(300ml)中的悬浮液于80℃下加热16h。过滤反应混合物且在真空中浓缩滤液且通过制备型hplc色谱使用具有0.1％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到55％)纯化，以得到黄色固体状19-2(4.5g)。c8h5cl2n5的[m h]

计算值242.06,实验值242.1。
[0729]
步骤b：n4-(2-氯嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(19-3)的制备.向19-2(2.0g,8.26mmol)于1,4-二噁烷(80m1)中的悬浮液中添加1-9(982mg,5.51mmol)、cs2co3(3.6g,11.0mmol)、pd(oac)2(123mg,0.551mmol)和xantphos(319mg,0.551mmol)。将反应混合物在真空下脱气且用n2吹扫3次。将反应混合物于100℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(10到50％)纯化，以获得黄色固体状19-3(690mg)。c
18h18
cln7o的[m h]

计算值383.84,实验值384.0。
[0730]
步骤c：n4-(2-碘嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(19-4)的制备.于0℃下向19-3(690mg,1.80mmol)和nai(1.6g,10.8mmol)于chcl3(10ml)中的溶液中添加hi/h2o(20ml,45％)且于25℃下搅拌72h。将混合物通过naoh溶液(2m)碱化到ph＝8且用etoac(30ml x2)萃取。在真空中浓缩有机层且通过制备型hplc色谱使用具有0.225％甲酸的乙腈于水中的梯度(10到35％)纯化，以得到白色固体状19-4(720mg)。c
18h18
in7o的[m h]

计算值475.29,实验值475.8。
[0731]
步骤d：n4-(2-(3-甲基-1h-吲唑-4-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(19-6)的制备.向含有化合物19-4(20mg,0.042mmol)的小瓶中添加19-5(15mg,0.084mmol)，然后添加碳酸钠(22.30mg,0.210mmol)和pd(dppf)cl2(6.16mg,0.0084mmol)。将所得混合物用n2吹扫，然后添加脱气的水(1ml)和1,4-二噁烷(1ml)。将小瓶加盖并于80℃下加热16h。然后冷却反应物且在真空中浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化所得残余物，以得到标题化合物的tfa盐(3.5mg)。c
26h25
n9o的[m h]

计算值479.55,实验值480.1。
[0732]
实例20：n4-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(426)的合成.
[0733][0734]
步骤a：3-氟-6-碘-2-甲基吡啶(20-2)的制备.向20-1(2.0g,10.5mmol)于mecn(10ml)中的溶液中添加nai(4.8g,31.5mmol)和hi aq.(2.5ml,47％，于h2o中)。将混合物在微波下于135℃下加热1h。将反应物倾倒到冷饱和nahco3(300ml)中。用etoac(150ml x3)萃取所得混合物。将有机层用饱和na2so3(200ml x3)洗涤且在真空中浓缩至干燥，以产生白色固体状粗制残余物20-2(2.0g)，其直接用于下一步骤。c6h5fin的[m h]

计算值237.02,实验值237.9。
[0735]
步骤b：3-氟-6-碘-2-甲基吡啶1-氧化物(20-3)的制备.向20-2(10g,42.2mmol)于甲苯(200ml)中的溶液中逐份添加mcpba(17.1g,84.4mmol,85％纯度)。将混合物于25℃下搅拌2h。将反应混合物倾倒到冰饱和nahco
3 aq.(500ml)中。用etoac(500ml x5)萃取所得混合物。将合并的有机层用na2so
3 aq.(1000ml x3)洗涤，浓缩至干燥且通过管柱(pe/ea＝20/1到1/1)纯化，以产生黄色固体状20-3(4.67g)。c6h5fino的[m h]

计算值253.01,实验值253.9。
[0736]
步骤c：(3-氟-6-碘吡啶-2-基)甲醇(20-4)的制备.将20-3(10.5g,41.49mmol)分批添加到tfaa(100ml)中。将反应混合物于35℃下搅拌16h。将反应混合物倾倒到冰nahco3水溶液(500ml)中。用etoac(200ml x3)萃取所得混合物。将合并的有机层浓缩至干燥，以产生粗产物。将此粗产物溶解于dcm(80ml)和h2o(80ml)中。然后添加k2co3(22.9g,165.97mmol)。将反应混合物于40℃下加热16h。将反应混合物倾倒到冰水(300ml)中。用etoac(200ml x3)萃取所得混合物。将合并的有机层浓缩至干燥且通过管柱(pe/ea＝100/1到10/1)纯化，以获得浅黄色固体状20-4(7.3g)。c6h5fino的[m h]

计算值253.01,实验值253.9。
[0737]
步骤d：3-氟-6-碘吡啶甲醛(20-5)的制备.向20-4(7.3g,28.9mmol)于dcm(160ml)中的溶液中添加dmp(24.5g,57.8mmol)。将混合物于25℃下搅拌2h。将反应物倾倒到冷饱和nahco3(500ml)中。用etoac(200ml x5)萃取混合物。将有机层在真空中浓缩至干燥且通过管柱(pe/ea＝100/1到10/1)纯化，以获得浅黄色固体状20-5(6.5g)。
[0738]
步骤e：2-(二氟甲基)-3-氟-6-碘吡啶(20-6)的制备.于-20℃下向20-5(6.5g,25.9mmol)于dcm(100ml)中的溶液中逐滴添加dast(7.5g,46.6mmol)。将反应混合物缓慢升温且于20℃下再搅拌2h。将反应混合物用饱和nahco
3 aq.(500ml)中和，然后将所得混合物用etoac(150ml x3)萃取。将合并的有机层浓缩至干燥且通过硅胶管柱色谱(pe/ea＝100/1到10/1)纯化，以获得浅粉色固体状20-6(6.5g)。c6h3f3in的[m h]

计算值273.00,实验值273.9。
[0739]
步骤f：(6-(二氟甲基)-5-氟吡啶-2-基)硼酸(20-8)的制备.于0℃下向20-6(1.8g,6.59mmol)和b(opr-i)3(2.5g,13.4mmol)于thf(70ml)中的溶液中逐滴添加i-prmgcl(16.5ml,32.9mmol,2.0m/l)。将反应混合物设备升温且于25℃下搅拌16h。将反应混合物用h2o(100ml)淬灭。将所得反应混合物用mtbe(50ml x3)萃取。冻干水相，以产生粗产物。于25℃下将此粗产物与etoac(100ml x3)一起研磨2h。再次冻干母液，并且然后添加到h2o(50ml)中且用mtbe(50ml x3)和pe(50ml x3)萃取。再次冻干水相，以产生白色固体状粗制残余物20-8(720mg)，其直接用于下一步骤。c6h5bf3no2的[m h]

计算值190.92,实验值191.3。
[0740]
步骤g：n4-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-吗啉基苯基)嘧啶-2,4-二胺(426)的制备.向含有19-6(20mg,0.042mmol)的小瓶中添加20-8(16mg,0.084mmol)，然后添加碳酸钠(22.30mg,0.210mmol)和pd(dppf)cl2(6.16mg,0.0084mmol)。将所得混合物用n2吹扫，然后添加脱气的水(1ml)和1,4-二噁烷(1ml)。将小瓶加盖并于80℃下加热16h。然后冷却反应物且在真空中浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(15到75％)纯化所得残余物，以得到标题化合物的tfa盐(4.7mg)。c
24h21
f3n8o的[m h]

计算值494.48,实验值495.0。
[0741]
实例21：n4-(2-(5-氯-2,4-二氟苯基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(556)的合成.
[0742][0743]
步骤a：4-(4-((4-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(21-1)的制备.向19-2(2.6g,10.8mmol)于1,4-二噁烷(72ml)中的悬浮液中添加2-1(2.0g,7.21mmol)、cs2co3(4.7g,14.2mmol)、pd(oac)2(162mg,0.721mmol)和xantphos(417mg,0.721mmol)。将反应混合物在真空下脱气且用n2吹扫3次。将混合物于100℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物且通过硅胶管柱色谱使用etoac于pe中的梯度(20到50％)纯化，以获得黄色固体状21-1(730mg)。c
23h27
cln8o2的[m h]

计算值482.97,实验值483.4。
[0744]
步骤b：n4-(2-氯嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(21-2)的制备.向21-1(730mg,1.51mmol)于dcm(8ml)中的溶液中添加tfa(1.0g,15.1mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌3h。在真空中浓缩反应混合物且通过饱和nahco3溶液将残余物碱化到ph＝8。过滤反应混合物且在真空中干燥滤液，以获得白色固体状21-2(520mg)，其直接用于下一步骤。c
18h19
cln8的[m h]

计算值382.86,实验值383.2。
[0745]
步骤c：n4-(2-碘嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(21-3)的制备.于0℃下向21-2(520mg,1.36mmol)和nai(1.2g,8.15mmol)于chcl3(10ml)中的溶液中添加hi/h2o(20ml,45％)且将所得混合物于25℃下搅拌7天。于0℃下将反应混合物通过饱和nahco3溶液碱化到ph＝8，用饱和na2so3溶液(20ml)洗涤且用etoac(30ml x3)萃取。在真空中浓缩有机层且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％hcl的乙腈于水中的梯度(10到40％)纯化，以获得黄色固体状21-3(120mg)。c
18h19
in8的[m h]

计算值474.31,实验值475.83
[0746]
步骤d：n4-(2-(5-氯-2,4-二氟苯基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(556)的制备.向含有化合物21-3(10mg,0.021mmol)的小瓶中添加21-4(8.08mg,0.042mmol)，然后添加碳酸钠(11.17mg,0.105mmol)和pd(dppf)cl2(3.09mg,0.0042mmol)。将所得混合物用n2吹扫，然后添加脱气的水(290μl)和1,4-二噁烷(290μl)。将小瓶加盖并于110℃下加热1h。然后冷却反应物且在真空中浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(15到75％)纯化所得残余物，以得到标题化合物的tfa盐(5.7mg)。c
24h21
clf2n8的[m h]

计算值494.94,实验值495.1。
[0747]
实例22：4-甲基-3-(4-((2-((4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)苯酚(255)的合成.
[0748][0749]
步骤a：甲基(1-(4-硝基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁基酯(22-2)的制备.向5-1(4.0g,18.7mmol)于dmf(60ml)中的溶液中添加22-1(2.6g,18.7mmol)和k2co3(5.2g,37.3mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌15h。过滤反应物且用etoac(80ml x2)洗涤滤饼。将滤液倾倒到250ml h2o中。用etoac(150ml x3)萃取混合物。将有机相用饱和nacl(100ml x3)洗涤，经na2so4干燥且在真空中浓缩至干燥，以产生粗产物。通过管柱(pe:ea＝50:1到3:1)纯化粗产物，以产生黄色固体状22-2(5.8g)。
[0750]
步骤b：(1-(4-氨基苯基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯(22-3)的制备.向22-2(5.7g,16.99mmol)于meoh(80ml)中的溶液中添加pd/c(500mg,10％)。在h2气球下于25℃下将反应混合物搅拌15h。经由硅藻土垫过滤反应混合物且在真空中去除溶剂到干燥，以产生浅粉色固体状粗制残余物22-3(4.5g)，其直接用于下一步骤。
[0751]
步骤c：(1-(4-((4-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯(22-4)的制备.将19-3(95mg,0.393mmol)、22-3(100mg,0.327mmol)、pd(oac)2(7mg,0.033mmol)、xantphos(19mg,0.033mmol)和cs2co3(213mg,
0.655mmol)于1,4-二噁烷(9ml)中的悬浮液在n2下于120℃下在微波下加热3h。过滤反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.1％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(15到45％)纯化滤液，以产生褐色固体状22-4(400mg)。c
25h31
cln8o2的[m h]

计算值511.03,实验值511.4。
[0752]
步骤d：n4-(2-氯嘧啶-4-基)-n2-(4-(4-(甲基氨基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(22-5)的制备.将22-4(400mg,0.783mmol)于hcl/ea(25ml,4m)中的悬浮液于0℃下搅拌1h。在真空中去除溶剂，以产生粉色固体状粗制残余物22-5(500mg)，其直接用于下一步骤。c
20h23
cln8的[m h]

计算值410.91,实验值410.3。
[0753]
步骤e：n4-(2-碘嘧啶-4-基)-n2-(4-(4-(甲基氨基)哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(22-6)的制备.向22-5(400mg,0.973mmol)于chcl3(5ml)中的悬浮液中添加hi/h2o(30ml,45％，于h2o中)。将反应混合物于25℃下搅拌11天。于0℃下将反应物倾倒于100ml冰水中。向溶液中添加15g na2so3。用饱和nahco3将溶液的ph调整到8。用etoac(50ml x6)萃取溶液。用na2so4干燥有机层且在真空中浓缩至干燥，以产生粗制残余物。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％hcl的乙腈于水中的梯度(7到37％)纯化残余物，以产生黄色固体状22-6的hcl盐(180mg)。c
20h23
in8的[m h]

计算值502.36,实验值503.2。
[0754]
步骤f：4-甲基-3-(4-((2-((4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)苯酚(255)的制备.向含有化合物22-6(15mg,0.026mmol)的小瓶中添加22-7(12mg,0.079mmol)，随后添加碳酸钠(13.91mg,0.131mmol)和pd(dppf)cl2(3.85mg,0.0052mmol)。用n2吹扫所得混合物，然后添加脱气的水(0.5ml)和1,4-二噁烷(1ml)。将小瓶加盖并于100℃下加热16h。然后冷却反应物且在真空中浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化所得残余物，以得到标题化合物的tfa盐(14.5mg)。c
31h37
n9o的[m h]

计算值551.70,实验值552.2。
[0755]
实例23：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基甲基)噻唑-2-基)嘧啶-2,4-二胺(287)的合成.
[0756][0757]
步骤a：4-((2-氨基噻唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁基酯(23-3)的制备.向23-1(150mg,0.807mmol)和23-2(100mg,0.673mmol)于dmf(2.7ml)中的溶液中添加diea(0.59ml,3.36mmol)。将反应混合物于110℃下加热1h。在真空中浓缩反应混合物且通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化，以获得黄色油状23-3(120mg)。c
13h22
n4o2s的[m h]

计算值298.41,实验值299.4。
[0758]
步骤b：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(4-(哌嗪-1-基甲基)噻唑-2-基)嘧啶-2,4-二胺(287)的制备.将脱气1,4-二噁烷(3.3ml)中的1-8(100mg,0.335mmol)、23-3(120mg,0.402mmol)、碳酸铯(218mg,0.669mmol)、xantphos(38.7mg,0.067mmol)和pd(oac)2(15.03mg,0.067mmol)的小瓶于110℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(903μl)和dcm(754μl)且于45℃下搅拌30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(124mg)。c
22h24n10
s的[m h]

计算值460.56,实验值461.2。
[0759]
实例24：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(5-(哌嗪-1-基甲基)噻吩-3-基)嘧啶-2,4-二胺(94)的合成.
[0760][0761]
步骤a：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-甲酸甲酯(24-2)的制备.在n2气氛下向1-8(800mg,5.09mmol)于1,4-二噁烷(10ml)中的溶液中添加24-1(1.21g,4.07mmol)。然后添加cs2co3(3.30g,10.18mmol)。将反应混合物用n2吹扫5min，然后添加pd2(dba)3(233mg,0.25mmol)和binap(317mg,0.05mmol)，然后于110℃下在密封小瓶中加热6h。将反应混合物用etoac稀释，经由硅藻土垫过滤，并且浓缩，以获得粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到3％)纯化残余物，以获得黄色固体状24-2(820mg)。c
20h17
n7o2s的[m h]

计算值419.46,实验值420.12。
[0762]
步骤b：(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-基)甲醇(24-3)的制备.在n2气氛下于0℃下向24-2(800mg,1.90mmol)于无水thf(10ml)中的溶液中添加lah(1.90ml,3.81mmol)。将反应物于25℃下搅拌2h。将反应混合物冷却到-30℃且用饱和氯化铵溶液淬灭，用etoac稀释且经由硅藻土床过滤，然后浓缩，以得到粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到8％)纯化残余物，以获得灰白色固体状24-3(300mg)。c
19h17
n7os的[m h]

计算值391.45,实验值392.15。
[0763]
步骤c：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-甲醛(24-4)的制备.于25℃下向24-3(250mg,0.63mmol)于dcm(8ml)中的溶液中添加mno2(1.39g,15.98mmol)。将所得悬浮液于25℃下搅拌16h。将反应混合物用dcm稀释，经由硅藻土床过滤，并且浓缩，以获得粗制残余物，通过用二乙醚和acn洗涤对其进行纯化，以获得黄色固体状24-4(180mg)。c
19h15
n7os的[m h]

计算值389.44,实验值390.27。
[0764]
步骤d：n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)-n2-(5-(哌嗪-1-基甲基)噻吩-3-基)嘧啶-2,4-二胺(94)的制备.向24-4(75mg,0.193mmol)于dma(800μl)中的搅拌溶液中添加23-1(30mg,0.161mmol)，然后添加stab(102mg,0.483mmol)。于25℃下将反应混合物搅拌16h。在真空中浓缩反应混合物。向反应混合物中添加dcm(400μl)和tfa(400μl)且将所得混合物于45℃下加热30min。在真空中去除tfa。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到15％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(29.6mg)。c
23h25
n9s的[m h]

计算值459.58,实验值460.2。
[0765]
实例25：n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-1-(哌啶-3-基)甲烷磺酰胺(106)的合成.
[0766][0767]
向dmf(1ml)中的17-2(20mg,0.054mmol)和25-1(24mg,0.081mmol)的小瓶中添加diea(0.028ml,0.162mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(1ml)且于50℃下加热1h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(10.3mg)。c
26h29
n9o2s的[m h]

计算值531.64,实验值532.1。
[0768]
实例26：n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-甲酰胺(228)的合成.
[0769][0770]
向17-2(25mg,0.067mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加cdi(12.04mg,0.074mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加23-1(13.83mg,0.074mmol)且于25℃下搅拌16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(11.8mg)。c
25h26n10
o的[m h]

计算值482.55,实验值483.1。
[0771]
实例27：n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-4-甲酰胺(14)的合成.
[0772][0773]
向17-2(12mg,0.032mmol)和27-1(14.86mg,0.065mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(18.48mg,0.049mmol)和diea(0.017ml,0.097mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌16h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(1ml)和dcm(1ml)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(19.7mg)。c
26h27
n9o的[m h]

计算值481.56,实验值482.1。
[0774]
实例28：3-(羟基甲基)-n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氮杂环丁烷-3-甲酰胺(209)的合成.
[0775]
[0776]
向17-2(20mg,0.054mmol)和28-1(18.73mg,0.081mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(30.8mg,0.081mmol)和diea(0.028ml,0.162mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌1h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(229μl)和dcm(191μl)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(35.1mg)。c
25h25
n9o2的[m h]

计算值483.54,实验值484.0。
[0777]
实例29：n-(3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-3-甲酰胺(443)的合成.
[0778][0779]
步骤a：n2-(3-氨基苯基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(29-2)的制备.向1-8(400mg,1.34mmol)和29-1(144mg,1.34mmol)于ipa(10ml)中的混合物中添加hcl(0.5ml)。将反应混合物在80℃下搅拌16h。过滤反应混合物。在真空中浓缩滤液且通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到5％)纯化，以产生黄色固体状29-2(280mg)。c
20h18
n8的[m h]

计算值370.42,实验值371.2。
[0780]
步骤b：n-(3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-3-甲酰胺(443)的制备.向29-2(20mg,0.054mmol)和29-3(18.73mg,0.081mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(30.8mg,0.081mmol)和diea(0.028ml,0.162mmol)且将所得混合物于25℃下搅拌1h。在真空中浓缩反应混合物。向残余物中添加tfa(229μl)和dcm(191μl)且于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化残余物，以得到标题化合物的tfa盐(35.1mg)。c
25h25
n9o2的[m h]

计算值483.54,实验值484.0。
[0781]
实例30：n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-基)哌啶-4-甲酰胺(452)的合成.
[0782][0783]
步骤a：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-甲酸(30-1)的制备.将24-2(1.3g,3.10mmol)和naoh(1.2g,31.0mmol)于meoh(30ml)和h2o(15ml)中的混合物于50℃下加热2h。将反应混合物用acoh酸化到ph＝7且过滤。在真空中干燥滤饼，以获得黄色固体状30-1(1.2g)。c
19h15
n7o2s的[m h]

计算值405.44,实验值406.0。
[0784]
步骤b：n2-(5-异氰酸基噻吩-3-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(30-3)的制备.于0℃下向30-1(1.0g,2.46mmol)和tea(1.5g,14.8mmol)于thf(20ml)中的溶液中添加30-2(2.1g,22.3mmol)。将反应混合物于0℃下搅拌6h。然后于0℃下添加h2o(5.0ml)中的nan3(1.0g,15.4mmol)。将反应混合物于20℃下搅拌12h。在真空中浓缩反应混合物。用h2o(50ml x2)洗涤残余物且在真空中干燥滤饼，以获得白色固体状30-3(900mg)。c
19h14
n8os的[m h]

计算值402.44,实验值403.0。
[0785]
步骤c：n2-(5-氨基噻吩-3-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(30-4)的制备.将30-3(800mg,1.19mmol)于hcl(10ml,6.0m)中的溶液于50℃下搅拌12h。在真空中浓缩反应混合物。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％hcl的乙腈于水中的梯度(0到32％)纯化残余物，以获得白色固体状30-4(120mg)。c
18h16
n8s的[m h]

计算值376.44,实验值377.1。
[0786]
步骤d：n-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-基)哌啶-4-甲酰胺(452)的制备.将30-4(20mg,0.053mmol)、27-1(18.27mg,0.080mmol)、hatu(30.3mg,0.080mmol)和diea(28.0μl,0.159mmol)于dmf(1ml)中的溶液于25℃下搅拌1h。在真空中浓缩反应混合物。向反应混合物中添加dcm(200μl)和tfa(225μl)且将混合物于45℃下加热30min。在真空中去除tfa且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化粗制混合物，以得到标题化合物的tfa盐(26.9mg)。c
24h25
n9os的[m h]

计算值487.59,实验值488.0。
[0787]
实例31：(r)-2-(5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(哌嗪-1-基)苯基)乙酸仲丁基酯(13)的合成.
[0788][0789]
步骤a：2-(2-氟-5-硝基苯基)乙酸甲基酯(31-2)的制备.于0℃下在n2气氛下向
31-1(10g,50.25mmol)于meoh(70ml)中的搅拌溶液中添加h2so4(5.3ml,100mmol)。将反应混合物回流16h。在减压下去除溶剂且使用碳酸氢盐溶液小心地淬灭且用etoac萃取。经无水硫酸钠干燥有机层且在减压下浓缩，以获得粗产物31-2(10g).c9h8fno4的[m na]

计算值236.15,实验值236.31。
[0790]
步骤b：4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(31-3)的制备.向31-2(5.0g,23.47mmol)于dma(70ml)中的搅拌溶液中添加dipea(12.61ml,70.41mmol)，然后添加23-1(4.3g,23.47mmol)。将反应混合物于100℃下加热16h。然后将反应混合物用水稀释且用etoac(100ml x3)萃取。将合并的有机层用冰冷水、之后盐水再次洗涤且经无水na2so4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过硅胶管柱色谱使用丙酮于己烷中的梯度(20到25％)纯化获得的粗制残余物，以获得白色固体状31-3(4.05g)。c
18h25
n3o6的[m h]

计算值379.41,实验值380.34。
[0791]
步骤c：2-(2-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)乙酸(31-4)的制备.向31-3(1.0g,2.63mmol)于thf(5ml)和h2o(5ml)中的搅拌溶液中添加lioh
·
h2o(540mg,13.19mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌16h，然后用水稀释且用ph～3下的etoac萃取。用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥且在减压下浓缩，以产生粗制残余物。通过沉淀并与acn、二乙醚和己烷一起研磨纯化残余物，以获得黄色固体状31-4(600mg)。c
17h23
n3o6的[m h]

计算值365.39,实验值366.16。
[0792]
步骤d：(r)-4-(2-(2-(仲丁氧基)-2-氧代乙基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(31-6)的制备.于0℃下向31-4(550mg,1.50mmol)于dcm(20m1)中的搅拌溶液中添加31-5(0.37ml,3.01mmol)和dmap(18mg,0.15mmol)，然后添加edc
·
hcl(573mg,3.01mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌16h，然后用水稀释且使用etoac萃取三次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥且在真空下浓缩，以获得粗制化合物，通过硅胶管柱色谱使用etoac于己烷中的梯度(10到15％)对其进行纯化，以获得31-6(400mg)。c
21h31
n3o6的[m h]

计算值421.49,实验值422.10。
[0793]
步骤e：(r)-4-(4-氨基-2-(2-(仲丁氧基)-2-氧代乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(31-7)的制备.向31-6(400mg,0.95mmol)于ipa(10ml)和thf(4ml)中的搅拌溶液中添加10％pd/c(400mg)且在h2气囊压力下经受氢化。将反应混合物于25℃下搅拌1h，然后经由硅藻土床过滤且用meoh洗涤。在真空下浓缩滤液，以得到粗制残余物31-7(350mg)，其不经任何纯化即用于下一步骤。c
21h33
n3o4的[m h]

计算值391.51,实验值392.13。
[0794]
步骤f：(r)-4-(2-(2-(仲丁氧基)-2-氧代乙基)-4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(31-8)的制备.在n2气氛下向31-7(344mg,0.88mmol)于1,4-二噁烷(10ml)中的溶液中添加1-8(175mg,0.587mmol)和cs2co3(381mg,1.17mmol)。将反应混合物用n2脱气10min，然后添加brettphos(63mg,0.117mmol)和brettphos pd g4(54mg,0.058mmol)，然后于110℃下加热16h。将反应混合物用etoac稀释且经由硅藻土床过滤。用冷水稀释滤液且用乙酸乙酯(25ml x2)萃取。将有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，以得到粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到3％)纯化残余物，以获得31-8(200mg)。c
35h43
n9o4的[m h]

计算值653.79,实验值654.17。
[0795]
步骤g：(r)-2-(5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨
基)-2-(哌嗪-1-基)苯基)乙酸仲丁基酯(13)的制备.于0℃下向31-8(200mg,0.306mmol)于dcm(5ml)中的搅拌溶液中添加tfa(1ml)。将反应混合物于25℃下搅拌，然后在减压下浓缩且进一步与二乙醚一起研磨，以得到米白色固体状标题化合物(205mg)。c
30h35
n9o2的[m h]

计算值553.67,实验值554.32。
[0796]
实例32：(r)-1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌啶-4-甲酸1-甲基吡咯烷-3-基酯(414)的合成.
[0797][0798]
步骤a：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(32-2)的制备.向1-8(3.5g,11.74mmol)和32-1(2.3g,15.27mmol)于正丁醇(35ml)中的搅拌溶液中添加ptsa(1.11g,5.87mmol)且将所得混合物于110℃下加热3h。将反应混合物浓缩至干燥且使用二乙醚研磨，以得到呈ptsa盐形式的32-2(4.1g)。c
22h19
n7o2的[m h]

计算值413.44,实验值414.15。
[0799]
步骤b：(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)甲醇(32-3)的制备.于0℃下向32-2(4.1g,9.92mmol)于thf(50ml)中的搅拌溶液中逐滴添加lah(15.0ml,29.71mmol)。将反应混合物于0℃下搅拌2h，然后在冷却下用水:thf(6:18ml)淬灭，然后添加15％naoh(15ml)。然后将其经由硅藻土床过滤且分离有机层且浓缩，以得到粗制残余物。通过硅胶管柱色谱纯化残余物，以获得32-3(3.0g)。c
21h19
n7o的[m h]

计算值385.43,实验值386.14。
[0800]
步骤c：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲醛(32-4)的制备.于25℃下向32-3(3.0g,7.8mmol)于dma(30ml)中的搅拌溶液中添加mno2(20.4g,234mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌6h，然后过滤并浓缩滤液，以得到粗制残余物。将获得的残余物与acn一起研磨，以获得32-4(2.2g)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。c
21h17
n7o的[m h]

计算值383.42,实验值384.16。
[0801]
步骤d：1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌啶-4-甲酸叔丁基酯(32-6)的制备.向32-4(2.1g,5.48mmol)于dma:dce(10:20ml)中的搅拌溶液中添加32-5(1.52g,8.22mmol)，然后添加stab(3.48g,16.44mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌16h。将反应混合物用水稀释且用10％meoh:dcm萃取，以获得粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到5％)纯化残余物，以获得32-6(1.4g)。c
31h36
n8o2的[m h]

计算值552.68,实验值553.33。
4的tfa盐(440mg)。c
27h28
n8o2的[m h]

计算值496.58,实验值497.1。
[0809]
步骤d：(r)-1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌啶-3-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(400)的制备.将33-4(75mg,0.104mmol)、33-5(38.8mg,0.207mmol)、edci(39.7mg,0.207mmol)和dmap(1.27mg,10.4μmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(279μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(62.1mg)。c
31h35
n9o2的[m h]

计算值565.68,实验值566.1。
[0810]
实例34：1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)氮杂环丁烷-3-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(88)的合成.
[0811][0812]
步骤a：1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)氮杂环丁烷-3-甲酸(34-2)的制备.向33-1(262mg,0.65mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加34-1(204mg,1.30mmol)和diea(0.567ml,3.25mmol)且将所得混合物于55℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物，以产生粗制残余物。向残余物中直接添加dcm(2ml)和tfa(2ml)且于55℃下加热1h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到30％)纯化，以得到34-2的tfa盐(118mg)。c
25h24
n8o2的[m h]

计算值468.52,实验值469.0。
[0813]
步骤b：1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)氮杂环丁烷-3-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(88)的制备.将34-2(23mg,0.033mmol)、33-5(9.27mg,0.050mmol)、hatu(18.83mg,0.050mmol)、dmap(0.40mg,3.3μmol)和diea(23.0μl,0.132mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(127μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到40％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(24.0mg)。c
29h31
n9o2的[m h]

计算值537.63,实验值538.2。
[0814]
实例35：(r)-1-((2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-基)甲基)哌啶-3-甲酸(s)-1-甲基吡咯烷-3-基酯(508)的合成.
[0815][0816]
步骤a：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-甲酸甲酯(35-2)的制备.向1-8(3.6g,12.2mmol)于1,4-二噁烷(100ml)中的悬浮液中添加35-1(2.5g,15.8mmol)、cs2co3(8.0g,24.4mmol)、pd2(dba)3(1.1g,1.22mmol)和binap(760mg,1.22mmol)。将反应混合物在真空下脱气且用n2吹扫3次。将反应混合物于110℃下加热12h。在真空中浓缩反应混合物，以产生残余物。通过制备型hplc色谱使用具有0.1％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(12到42％)纯化残余物，以得到35-2的tfa盐(1.7g)。c
19h16
n8o2s的[m h]

计算值420.45,实验值421.0。
[0817]
步骤b：(2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-基)甲醇(35-3)的制备.于0℃下向35-2(50mg x16,0.119mmol x16)于thf(1ml x16)中的溶液中添加lah(9mg x16,0.238mmol x16)。将混合物于25℃下搅拌20min。将反应混合物用罗谢尔盐溶液(rochelle salt solution)(100ml)稀释且用dcm(200ml x3)萃取，将有机层经na2so4干燥，过滤且在真空中浓缩。通过制备型hplc色谱使用具有0.225％甲酸的乙腈于水中的梯度(10到35％)纯化残余物，以获得黄色固体状35-3(86mg)。c
18h16
n8os的[m h]

计算值392.44,实验值393.1。
[0818]
步骤c：n2-(4-(氯甲基)噻唑-2-基)-n4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)嘧啶-2,4-二胺(35-4)的制备.于0℃下向35-3(101mg,0.257mmol)于dcm(6ml)中的溶液中逐滴添加socl2(92mg,0.771mmol)。将反应混合物于25℃下搅拌2h。在真空中浓缩反应混合物。通过研磨纯化残余物，以产生黄色固体状35-4(50mg)。c
18h15
cln8os的[m h]

计算值410.88,实验值411.0。
[0819]
步骤d：(r)-1-((2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-基)甲基)哌啶-3-甲酸(35-6)的制备.向35-4(200mg,0.487mmol)、35-5(162mg,0.730mmol)和diea(425μl,2.434mmol)于dcm(7.8ml)中的溶液中于55℃下加热2h。向反应混合物中添加tfa(938μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物。通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到75％)纯化残余物，以得到35-6的tfa盐(253mg)。c
24h25
n9o2s的[m h]

计算值503.59,实验值504.0。
[0820]
步骤e：(r)-1-((2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-基)甲基)哌啶-3-甲酸(s)-1-甲基吡咯烷-3-基酯(508)的制备.将35-6(25mg,0.034mmol)、35-7(5.18mg,0.051mmol)、edci(9.83mg,0.051mmol)和dmap(0.84mg,6.83μmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(132μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸
的乙腈于水中的梯度(2到50％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(18.2mg)。c
29h34n10
o2s的[m h]

计算值586.72,实验值587.1。
[0821]
实例36：(r)-2-(1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-2-基)乙酸1-甲基吡咯烷-3-基酯(103)的合成.
[0822][0823]
步骤a：2-(4-(叔丁氧基羰基)-1-(4-硝基苯基)哌嗪-2-基)乙酸(36-2)的制备.向5-1(1.0g,7.09mmol)和36-1(2.195g,8.51mmol)于acn(12ml)和水(3ml)中的溶液中添加碳酸钾(4.9g,35.46mmol)，然后添加18-冠-6(93mg,0.354mmol)。将反应混合物于90℃下加热48h。浓缩反应混合物且用水(10ml)稀释粗制混合物。用etoac洗涤水层且使用饱和柠檬酸溶液将水层的ph调整到约4且用dcm(5ml x2)萃取。浓缩有机层，以得到黄色固体状36-2的粗制残余物(750mg)。c
17h23
n3o6的[m h]

计算值365.39,实验值366.22。
[0824]
步骤b：3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(36-3)的制备.向36-2(700mg,1.91mmol)于acn(7ml)和meoh(3ml)中的溶液中添加己烷中的tms-chn2(2m)(5.8ml 11.5mmol)且将反应混合物于25℃下搅拌3h。向反应混合物中添加过量甲醇且于25℃下搅拌15min，然后蒸馏出残余溶剂，以获得粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用etoac于己烷中的梯度(0到15％)纯化残余物，以产生黄色固体状36-3(700mg)。c
18h25
n3o6的[m h]

计算值379.41,实验值380.03。
[0825]
步骤c：4-(4-氨基苯基)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(36-4)的制备.向36-3(1.3g,3.43mmol)于thf:ipa(20ml,1:1)中的溶液中添加10％pd/c(1.3g)，然后将所得悬浮液于25℃下在h2气氛下搅拌3h。经由硅藻土床过滤反应混合物且用etoac洗涤残余物。然后在减压下蒸发有机层，以得到粗产物36-4(1.3g)，其直接用于下一步骤。c
18h27
n3o4的[m h]

计算值349.43,实验值350.10。
[0826]
步骤d：3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(36-5)的制备.向1-8(1.2g,4.02mmol)和36-4(1.6g,4.83mmol)于1,4-二噁烷(15ml)中的搅拌溶液中添加cs2co3(2.62g,8.05mmol)且将反应混合物用n2吹扫30min。向反应混合物中添加brettphos pd g4(0.370g,0.40mmol)，然后用n2重复吹扫5min。将反应混合物于110℃下加热3h。经由硅藻土床过滤反应混合物，用5％meoh:dcm洗涤，并且浓缩，以获得粗制残余物。通过硅胶管柱色谱
使用etoac于pe中的梯度(0到100％)纯化残余物，以产生白色固体状36-5(1.18g)。
[0827]
步骤e：2-(4-(叔丁氧基羰基)-1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-2-基)乙酸(36-6)的制备.向36-5(1.4g,2.29mmol)于meoh(10ml)、thf(5ml)和水(2.5ml)中的搅拌溶液中添加lioh
·
h2o(0.48g,11.45mmol)且将反应混合物于25℃下搅拌16h。通过使用柠檬酸水溶液将反应混合物的ph调整到约3-4。使用10％meoh:dcm从水层萃取所需酸。将有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，以得到残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(5到10％)纯化残余物，以产生灰白色固体状36-6(1.12g)。c
31h35
n9o4的[m h]

计算值597.68,实验值598.32。
[0828]
步骤f：(r)-2-(1-(4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-2-基)乙酸1-甲基吡咯烷-3-基酯(103)的制备.将36-6(30mg,0.050mmol)、36-7(7.62mg,0.075mmol)、edci(14.43mg,0.075mmol)和dmap(1.20mg,10.0μmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(193μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到50％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(11.4mg)。c
31h36n10
o2的[m h]

计算值580.70,实验值581.1。
[0829]
实例37：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-2-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(96)的合成.
[0830][0831]
将30-1(50mg,0.123mmol)、33-5(34.6mg,0.185mmol)、edci(35.5mg,0.185mmol)和dmap(3.01mg,0.025mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(475μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到30％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(22.8mg)。c
23h22
n8o2s的[m h]

计算值474.54,实验值475.1。
[0832]
实例38：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-3-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(142)的合成.
[0833][0834]
步骤a：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-3-甲酸甲酯(38-2)的制备.将1-8(1.6g,5.36mmol)、38-1(842mg,5.36mmol)和浓hcl(0.6ml)于ipa(16ml)中的溶液于80℃下加热12h。然后将反应混合物冷却到25℃，用ipa稀
释且过滤，以获得灰白色固体状38-2的hcl盐(900mg)。c
20h17
n7o2s的[m h]

计算值419.46,实验值420.17。
[0835]
步骤b：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-3-甲酸(38-3)的制备.向38-2(900mg,2.14mmol)于meoh(6ml)、thf(4ml)和水(2ml)中的搅拌溶液中添加koh(240mg,4.29mmol)且搅拌所得混合物且于65℃下加热3h。浓缩反应混合物且用水稀释且用3n hcl酸化到(ph 4-5)直到浅褐色固体沉降，将其过滤且用乙腈和二乙醚洗涤，以得到浅褐色固体状所需化合物38-3(215mg)。c
19h15
n7o2s的[m h]

计算值405.44,实验值406.03。
[0836]
步骤c：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻吩-3-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(142)的制备.将38-3(25mg,0.062mmol)、33-5(17.32mg,0.092mmol)、edci(17.73mg,0.092mmol)和dmap(1.50mg,0.012mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(238μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到50％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(17.3mg)。c
23h22
n8o2s的[m h]

计算值474.54,实验值475.1。
[0837]
实例39：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-甲酸哌啶-4-基酯(148)的合成.
[0838][0839]
步骤a：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-甲酸(39-1)的制备.将35-2(1.0g,2.38mmol)和naoh(1.9g,47.6mmol)于meoh(30ml)和h2o(30ml)中的悬浮液于60℃下加热5h。在真空中浓缩反应混合物以去除meoh并通过2m hcl酸化到ph＝6～7。过滤反应混合物。用h2o(50ml)洗涤滤饼且冻干，以获得黄色固体状39-1(600mg)。c
18h14
n8o2s的[m h]

计算值406.42,实验值407.0。
[0840]
步骤b：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-4-甲酸哌啶-4-基酯的制备(148).将39-1(25mg,0.062mmol)、39-2(18.57mg,0.092mmol)、edci(17.69mg,0.092mmol)和dmap(1.50mg,0.012mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。添加tfa(351μl)且将反应混合物于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(9.2mg)。c
23h23
n9o2s的[m h]

计算值489.56,实验值490.0。
[0841]
实例40：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-5-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(338)的合成.
[0842][0843]
步骤a：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-5-甲酸乙酯(40-2)的制备.向1-8(600mg,2.013mmol)和40-1(519mg,3.019mmol)于1,4-二噁烷(12ml)中的搅拌溶液中添加碳酸铯(1.3g,4.026mmol)且吹扫15min。然后添加pd2(dba)3(184mg,0.201mmol)和binap(250mg,0.402mmol)。然后将反应混合物于110℃下加热3h。将反应混合物用dcm中的10％meoh稀释，经由硅藻土床过滤并浓缩，以得到粗制残余物。通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到5％)纯化残余物，以产生40-2(430mg)。c
20h18
n8o2s的[m h]

计算值434.48,实验值435.10。
[0844]
步骤b：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-5-甲酸(40-3)的制备.向40-2(300mg,0.69mmol)于1,4-二噁烷:水(9.0:0.5ml)中的溶液中添加6n hcl(1.5ml)。将反应混合物于90℃下加热12h。将反应混合物完全浓缩至干燥。使用meoh、dcm、二乙醚和acn研磨所得残余物，以得到所需化合物，经由制备型hplc色谱对其进一步纯化，以获得40-3(70mg)。c
18h14
n8o2s的[m h]

计算值406.42,实验值407.18。
[0845]
步骤c：2-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)噻唑-5-甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(338)的制备.将40-3(15mg,0.037mmol)、33-5(10.37mg,0.055mmol)、edci(10.61mg,0.055mmol)和dmap(0.90mg,7.38μmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(142μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到50％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(5.7mg)。c
25h24
n8o2s的[m h]

计算值475.53,实验值476.0。
[0846]
实例41：3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(178)的合成.
[0847][0848]
步骤a：3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)烟碱酸甲基酯(41-2)的制备.向1-8(600mg,2.01mmol)和41-1(304mg,2.01mmol)于ipa(10ml)中的
混合物中添加hcl(0.5ml)。将反应混合物于80℃下加热16h。将反应混合物用h2o(30ml)淬灭且过滤。将滤饼蒸发到干燥，以产生白色固体状41-2(820mg)。c
22h19
n7o2的[m h]

计算值413.44,实验值414.2。
[0849]
步骤b：3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(41-3)的制备.将41-2(780mg,1.87mmol)于etoh(10ml)和aq.naoh(10ml)中的混合物于80℃下加热16h。在真空中浓缩反应混合物以去除etoh。向残余物中添加hcl以调整ph到5，然后过滤混合物。用h2o(30ml)洗涤滤饼且将残余物蒸发到干燥，以产生黄色固体状41-3(530mg)。c
21h17
n7o2的[m h]

计算值399.41,实验值399.9。
[0850]
步骤c：3-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(178)的制备.将41-3(25mg,0.063mmol)、33-5(17.58mg,0.094mmol)、edci(18.00mg,0.094mmol)和dmap(1.53mg,0.013mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(240μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到50％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(29.5mg)。c
25h24
n8o2的[m h]

计算值468.52,实验值469.1。
[0851]
实例42：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(33)的合成.
[0852][0853]
步骤a：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(42-1)的制备.将32-2(780mg,1.87mmol)于etoh(10ml)和aq.naoh(10ml)中的混合物于80℃下搅拌16h。在真空中浓缩反应混合物以去除etoh。向残余物中添加hcl以调整ph到5，然后过滤混合物。用h2o(30ml)洗涤滤饼且将残余物蒸发到干燥，以产生黄色固体状42-1(530mg)。c
21h17
n7o2的[m h]

计算值399.41,实验值399.9。
[0854]
步骤b：4-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(33)的制备.将42-1(25mg,0.063mmol)、33-5(17.58mg,0.094mmol)、edci(18.00mg,0.094mmol)和dmap(1.53mg,0.013mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液于25℃下搅拌16h。向反应混合物中添加tfa(240μl)且于45℃下加热30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到65％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(21.1mg)。c
25h24
n8o2的[m h]

计算值468.52,实验值469.1。
[0855]
实例43：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(545)的合成.
[0856][0857]
步骤a：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶甲酸甲酯(43-2)的制备.将脱气1,4-二噁烷(4.2ml)中的1-8(250mg,0.837mmol)、44-1(127mg,0.837mmol)、碳酸铯(545mg,1.674mmol)、brettphos(44.9mg,0.084mmol)和brettphos pd g4(77mg,0.084mmol)的小瓶加热到110℃并保持16h。在真空中浓缩反应混合物且通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化，以获得橙色油状43-2(164mg)。c
21h18
n8o2的[m h]

计算值414.43,实验值415。
[0858]
步骤b：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶甲酸(43-3)的制备.将43-2(164mg,0.396mmol)和lioh(24.73mg,1.033mmol)于thf(1291μl)、meoh(861μl)和h2o(430μl)的3:2:1混合物中的溶液加热到65℃并保持3h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到30％)纯化，以得到43-3的tfa盐(129mg)。c
20h16
n8o2的[m h]

计算值400.40,实验值401.1。
[0859]
步骤c：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶甲酸氮杂环丁-3-基甲基酯(545)的制备.将43-3(20mg,0.039mmol)、33-5(10.92mg,0.058mmol)、hatu(22.17mg,0.058mmol)和diea(27.2μl,0.156mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液加热到50℃并保持1h。向反应混合物中添加tfa(120μl)且于25℃下搅拌30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(22.8mg)。c
24h23
n9o2的[m h]

计算值469.51,实验值470.1。
[0860]
实例44：(r)-5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)烟碱酸吡咯烷-3-基酯(549)的合成.
[0861][0862]
步骤a：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)烟碱酸甲基酯(44-2)的制备.将于脱气1,4-二噁烷(4.2ml)中的1-8(250mg,0.837mmol)、44-1(127mg,0.837mmol)、碳酸铯(545mg,1.674mmol)、brettphos(44.9mg,0.084mmol)和brettphos pd g4(77mg,0.084mmol)的小瓶加热到110℃并保持16h。在真空中浓缩反应混
合物且通过硅胶管柱色谱使用meoh于dcm中的梯度(0到15％)纯化，以获得橙色油状44-2(214mg)。c
21h18
n8o2的[m h]

计算值414.43,实验值415。
[0863]
步骤b：5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)烟碱酸(44-3)的制备.将44-2(214mg,0.516mmol)和lioh(24.73mg,1.033mmol)于thf(1291μl)、meoh(861μl)和h2o(430μl)的3:2:1混合物中的溶液加热到65℃并保持3h。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(5到30％)纯化，以得到44-3的tfa盐(77mg)。c
20h16
n8o2的[m h]

计算值400.40,实验值401.1。
[0864]
步骤c：(r)-5-((4-((2-(6-甲基吡啶-2-基)嘧啶-4-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)烟碱酸吡咯烷-3-基酯(549)的制备.将44-3(20mg,0.039mmol)、44-4(10.92mg,0.058mmol)、hatu(22.17mg,0.058mmol)和diea(27.2μl,0.156mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液加热到50℃并保持1h。向反应混合物中添加tfa(120μl)且于25℃下搅拌30min。在真空中浓缩反应混合物且通过制备型hplc色谱使用具有0.05％三氟乙酸的乙腈于水中的梯度(2到60％)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(12.8mg)。c
24h23
n9o2的[m h]

计算值469.51,实验值470.1。
[0865]
实例45：生物化学alk5(tgf-βr1)分析以测量pki。
[0866]
使用重组人类alk5(tgf-βr1)蛋白(产品号pr9075a或等效物，生命技术(life technologies))和市售激酶分析((镧系元素螯合物激发)ultra ulight
tm
激酶分析，产品号trf0130-m及trf02108-m，珀金埃尔默(perkin elmer))来测定本揭示内容的化合物的表观pki值，如下文所阐述。
[0867]
在384孔板(24列
×
16孔/行)中实施分析。使用550液体处置器(雷博赛特(labcyte))制备于100％dmso中的各种中间浓度的本揭示内容的化合物。从中间浓度制备一定范围的浓度(10μm到25pm，对应于高达105nl的体积)并喷射到最终分析板中，用于产生标的化合物中每一者的个别剂量反应曲线。对于分析板内的单独列，每孔中使用105nl dmso来确立最大分析信号。另外，在另一列的孔中使用105nl 100μm sd-208(一种选择性tgf-βr1抑制剂(目录号s7624，赛力克化学(selleck chemicals)))，以确立最小分析信号。
[0868]
利用多点分配器，向每孔中添加8μl酶混合物(1.25x最终)。酶混合物由250pm alk5酶和62.5nm肽底物((镧系元素螯合物激发)ultra ulight
tm-dna拓朴异构酶2-α(thr1342))组成，其在分析缓冲液(50mm hepes、10mm mgcl2、1mm egta、0.01％吐温-20(tween-20)，ph 7.5，于室温下)中制备，使用前添加2mm dtt。然后用粘着密封件密封板，并使其在室温下平衡60分钟。
[0869]
接下来，将2μl 125μm atp(5x最终，在具有2mm dtt的分析缓冲液中制备的125μm atp)添加到培育混合物中，用环境盖(产品号lls-0310，雷博赛特)覆盖，并且立即转移到37℃。使反应在37℃下进行60分钟，然后在室温下利用添加检测混合物(12mm edta，在检测缓冲液(50mm tris-hcl、150mm nacl、0.5％bsa(馏分v)，ph7.0)中制备的4nm检测抗体((镧系元素螯合物激发)超铕-抗磷酸化-dna拓朴异构酶2-α(thr1342))中的10μl检测抗体终止。然后在perkin elmer envision读板仪上用铕特异性读板仪设置读板，激发和发射波长分别设定为320或340nm和665nm。这些数据用于计算基于dmso和sd-208背景对照的酶抑制百分比值。
[0870]
对于剂量-反应分析，将抑制百分比对化合物浓度作图，并用graphpad prism v5
软件(graphpad软件公司,拉霍亚(la jolla),加利福尼亚州)从4参数稳健拟合模型测定pic
50
值。所述模型通过将s形剂量-反应(可变斜率)等式拟合到数据获得pic
50
值。结果表示为pic
50
(ic
50
的负对数)且随后使用程-普鲁索夫(cheng-prusoff)等式将其转化成pki(解离常数的负对数，ki)。pki值愈高(ki值愈低)，对alk5活性的抑制愈大。当在生物化学alk5分析中测试时，本文揭示的某些化合物展现大于8或大于9的pki值。
[0871]
表3显示生物化学alk5分析中所选化合物的生物活性。化合物编号对应于表1和2以及实例1-44中提供的编号和结构。
[0872]
表3
[0873]
[0874]
[0875][0876]
实例46：细胞alk5功效分析以测量pic
50
，beas-2b细胞中tgf-β刺激的psmad3形成的抑制。
[0877]
在beas-2b细胞(一种人类肺上皮细胞系)中测量本揭示内容的化合物抑制tgf-β刺激的smad3磷酸化的功效。tgf-β在即将smad3磷酸化前经由活化素受体样激酶5(alk5)传导信号。由于alphalisa surefire ultra试剂盒(珀金埃尔默)定测量量溶解物中psmad3含量，所述分析展现测试化合物的alk5细胞功效。
[0878]
使用50％dmem(生命技术)和50％f-12(生命技术)培养基生长beas-2b细胞，所述培养基补充有10％胎牛血清(atcc)、25mm hepes(生命技术)和1x pen-strep(生命技术)。将细胞在设定在37℃、5％co2的加湿培育箱中培养，并使用0.25％胰蛋白酶和0.5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)胰蛋白酶化。
[0879]
对于所述分析，将beas-2b细胞以7,500个细胞/孔(25μl/孔)接种在384孔板中，并培养过夜。在给药前，吸出生长培养基，并用补充有25mm hepes(生命技术)和1％牛血清白蛋白(罗氏(roche))的hbss缓冲液(具有钙和镁的hbss，生命技术)冲洗各孔。将化合物在dmso中连续稀释，然后用补充的hbss缓冲液(50μl/孔)进一步稀释，以0.3％dmso产生最终分析浓度的3x的化合物板。然后将稀释的化合物添加到细胞(8μl/孔)并在37℃、5％co2下培育1小时。在化合物培育后，将在补充的hbss缓冲液中重构的tgf-β(r&d systems)添加到细胞(12μl/孔，最终浓度10ng/ml)并再培育30分钟，此后立即用alphalisa溶解缓冲液(珀金埃尔默)溶解细胞。间隔2小时添加alphalisa接受器和检测器珠粒(珀金埃尔默)，然后培育过夜以在第二天读数。经由分析psmad3信号从基线(未用化合物处理的tgf-β刺激的细胞)的剂量依赖性定量变化来测定化合物的功效。数据表示为pic
50
(负的十进制对数ic
50
)值。当在beas-2b细胞中测试时，本文揭示的某些化合物展现大于6或大于7的pic
50
值。
[0880]
表4显示细胞alk5功效分析中所选化合物的生物活性。化合物编号对应于表1和2以及实例1-44中提供的编号和结构。
[0881]
表4
[0882]
[0883][0884]
实例47：通过染色体早熟凝集[15](pcc
15
)测量的细胞毒性。
[0885]
在beas2b细胞(一种人类肺上皮细胞系)中测量本揭示内容的化合物对细胞三磷酸腺苷(atp)含量的影响。atp的含量与细胞的存活率相关，并且经常经测量以测定化合物的潜在细胞毒性。使用celltiter-glo测定测试化合物对细胞存活率的效应，所述celltiter-glo溶解细胞并产生与存在的atp的量成正比的发光信号。
[0886]
使beas2b细胞在50％dmem(生命技术)和50％f-12(生命技术)培养基中生长，所述
培养基补充有10％胎牛血清(atcc)、25mm hepes(生命技术)和1x pen-strep(生命技术)。将细胞在设定在37℃、5％co2的加湿培育箱中培养，并使用0.25％胰蛋白酶和0.5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)胰蛋白酶化。
[0887]
对于所述分析，将beas2b细胞以500个细胞/孔(25μl/孔)接种在384孔板中，并培养过夜。将化合物在dmso中连续稀释，然后用生长培养基(40μl/孔)进一步稀释，以0.6％dmso产生最终分析浓度的6x的化合物板。然后将稀释的化合物添加到细胞(5μl/孔)并在37℃、5％co2下培育48小时。在化合物培育后，将celltiter-glo(普洛麦格(promega))直接添加到细胞中(30μl/ml)。将分析板密封且在黑暗环境中以700rpm振荡15分钟，然后以1500rpm离心2分钟，使溶解物沉降在孔的底部。通过分析atp从基线(未用化合物处理的细胞)和用60μm at9283(一种充分表征的细胞毒性化合物)处理的孔的剂量依赖性定量变化来测定化合物对细胞存活率的效应。数据表示为pcc
15
(负的十进制对数cc
15
)值。当在beas2b细胞中测试时，本文揭示的某些化合物展现小于6或小于5.5的pcc
15
值。
[0888]
表5显示染色体早熟凝集分析中所选化合物的细胞毒性。化合物编号对应于表1和2以及实例1-44中提供的编号和结构。
[0889]
表5
[0890]
[0891][0892]
实例48：活体外人肝微粒体固有清除率(hlm cl
int
)。
[0893]
肝微粒体用于活体外测定本揭示内容的化合物的肝清除率。用缓冲到ph 7.4并补充有2mm nadph(西格玛-奥德里奇,圣路易斯(st.louis),密苏里州(mo))的100mm磷酸钾(bd生物科学(bd biosciences),沃本(woburn),马萨诸塞州(ma))制备微粒体培育辅因子溶液。将10mm测试化合物的dmso储液稀释并掺入辅因子溶液中以得到0.2μm浓度(0.02％v/v dmso)。将冷冻的人肝微粒体(生物再生ivt,巴尔的摩马里兰州)的等分试样解冻，并稀释
到100mm磷酸钾缓冲液中，以得到0.2mg/ml的微粒体蛋白浓度。将辅因子/药物和微粒体溶液在保持于37℃的水浴中分开预热4分钟。通过等体积的辅因子/药物溶液与微粒体溶液的组合开始培育(n＝1)。测试化合物的最终浓度为0.1μm，最终蛋白质浓度为0.1mg/ml，并且最终nadph浓度为1mm。在时间0、3、8、15、30和45分钟收集样品以监测测试化合物的消失。在每一时间点，取出50μl培育样品，并将其掺入25μl水加3％甲酸加用于反应终止的内标准品中。然后将样品注射到ab sciex api4000三重四极质谱仪上，通过lc-ms/ms定量。移动相a由具有0.2％甲酸的hplc级水组成，并且移动相b由具有0.2％甲酸的hplc级乙腈组成，所有样品都流过thermo hypurity c18 50x2.1mm管柱(沃尔瑟姆(waltham),马萨诸塞州)。hlm cl
int
数据以μl/min/mg为单位报道。参见莱利r.j.(riley,r.j.)等人，药物代谢与处置(drug metab.dispos.),2005年9月,33(9),第1304-1311页。本文揭示的某些化合物展现大于50μl/min/mg或大于100μl/min/mg的hlm cl
int
。
[0894]
实例49：肺pk/pd。
[0895]
存活部分
[0896]
c57bl/6n小鼠在使用前适应至少3天。在实验当天，将动物分组成5的样本大小(对于tgf-β刺激组，n＝10)。经由经口抽吸(oa；动物通过覆盖其鼻子而被迫将溶液抽吸到肺中)预处理本揭示内容的化合物(调配于pbs中的3％甘油中；ph＝4)。所有经口抽吸都使用50μl剂量体积实施并伴有适当媒剂对照组。在化合物oa处理后，将动物放回其饲养笼中并监测。在收获前4小时进行化合物预处理以进行筛选和剂量反应研究；持续时间研究具有可变的化合物预处理时间。在收获前一小时，经由第二次经口抽吸pbs媒剂或重组人类tgf-β1蛋白(0.01μg/动物，溶解于1份4mm hcl和2份3％pbs中的甘油中)攻击动物。在收获前五分钟，将动物在异氟醚下深度麻醉并经由颈椎脱臼实施安乐死。在收获期间收集支气管肺泡灌洗液(balf)、血浆和左肺叶。
[0897]
样品收集和处理
[0898]
经由开放性心脏穿刺收集血浆。在全血收集后，将样品置于edta包被的试管中以防止凝固。在4℃下以15300xg旋转血样4分钟以分离血浆。立即分离血浆，冷冻并进行生物分析型(ba)分析。
[0899]
为了收集balf，将肺用0.7ml pbs经由气管冲洗3次。立即将balf(几乎完全由组织源巨噬细胞组成)以700xg离心15分钟。离心后，去除上清液，将balf重悬于1x细胞溶解缓冲液中，并立即冷冻。在进行ba之前，将balf脱解冻并在冷水上超声波处理30分钟以溶解打开细胞。
[0900]
balf收集后立即收集左肺叶。将肺样品在500μl 1x细胞溶解缓冲液中均质化。在均质化后，将样品分开：将一半样品立即置于回转式烤架上10分钟，同时将另一半立即冷冻用于ba分析。然后将置于回转式烤架上的样品以10,000xg离心10分钟，以便将上清液中的蛋白质与沉淀的碎片分离。收集上清液后，实施总蛋白质定量分析(布拉德福德(bradford))以正规化所有样品的浓度。使用汉密尔顿(hamilton)星形液体处理系统，将各样品在1x细胞溶解缓冲液中稀释到2mg/ml蛋白质。将样品储存在-80℃或立即使用meso-scale discovery系统处理。
[0901]
使用meso-scale discovery的磷酸化-smad3(psmad3)和总-smad3(tsmad3)定量
[0902]
meso-scale discovery(msd)是一种需要具有附着于底部的碳电极的专用微板的
电化学蛋白质定量分析。这些碳电极允许生物试剂与微板的更大附着，从而允许与传统elisa相比时读出更灵敏。与标准夹心式elisa相似，msd需要使用结合样品内的靶标蛋白的包被抗体。在样品培育后，使用一级抗体结合感兴趣的表位。在添加一级抗体后，使用具有sulfo-tag检测的二级抗体来定量感兴趣的表位。最后，经由电脉冲读取微板，所述电脉冲使sulfo-tag发光，此用作分析的最终读出。
[0903]
将包被抗体(smad3，克隆＝5g-11)在专门msd微板中于4℃下培育过夜。第二天，将微板在3％bsa(牛血清白蛋白)中封闭70分钟以防止非特异性蛋白结合到微板的底部。洗涤步骤后，将50μg肺样品加载到msd板中并在室温下培育2小时。再次洗涤板以去除未结合的样品；将磷酸化-smad3(psmad3；克隆＝ep568y)或总-smad3(tsmad3)一级抗体培育1小时。洗涤步骤后，将抗兔sulfo-tag检测抗体培育50分钟。在最终洗涤步骤之后，将msd-读取缓冲液添加到各样品中。使用msd特异性读板仪(sector s 600)实施psmad3和tsmad3定量。
[0904]
数据分析
[0905]
立即使用离群值分析(格拉布斯(grubbs)测试，α＝0.05)分析样品。在去除离群值后，将原始psmad3除以tsmad3发光读数。在筛选和剂量反应研究中，将psmad3/tsmad3比率正规化为tgf-β诱发组(设定为100％)以使刺激之间的可变性最小化。首先，用司徒顿氏(student’s)t-测试(截止值：p＝0.05)比较3％甘油/pbs组与3％甘油/tgf-β组，以确保psmad3窗存在。使用单因子anova(费雪氏(fisher’s)未校正之lsd)将所有药物处理组与3％甘油/tgf-β组比较，以确定是否观察到统计学显著差异。使用媒剂psmad3作为基线值计算psmad3抑制百分比，并且展示为最终读出。用4-参数非线性回归算法拟合剂量-反应曲线；将最小反应设定为0％psmad3抑制，并且将最大反应设定为100％psmad3抑制。从回归获得化合物功效并报告为id50。
[0906]
pk研究
[0907]
定量血浆、肺和巨噬细胞药物浓度。将总巨噬细胞浓度相对于balf中回收的总药物正规化为总巨噬细胞体积。计算中使用的肺泡巨噬细胞体积是基于科隆巴赫(krombach)等人的出版物(环境卫生展望(environmental health perspectives),1997年9月,第105卷,增刊5,第1261-1263页)，其估计大鼠肺泡巨噬细胞体积为约1200μm3或1.2e-9
ml。假设小鼠肺泡巨噬细胞体积与大鼠的肺泡巨噬细胞体积相似。回收的正规化总巨噬细胞浓度＝(从balf回收的总药物)/(总细胞计数*1.2e-9
ml)。
[0908]
本文揭示的某些化合物展现大于10、例如大于50、大于75或大于100的(肺auc
0-t
):(血浆auc
0-t
)比率。预期以最小全身暴露局部递送到肺的化合物优选展现大于50的(肺auc
0-t
):(血浆auc
0-t
)比率。表3中提供的pki值大于9.5的某些化合物展现大于75的(肺auc
0-t
):(血浆auc
0-t
)比率。
[0909]
实例50：心脏pk/pd。
[0910]
存活部分
[0911]
c57bl/6n小鼠在使用前适应至少3天。在实验当天，将动物分组成5-10的样本大小。经由经口抽吸(oa；通过覆盖动物的鼻子迫使动物将溶液抽吸到肺中)预处理测试化合物。所有经口抽吸都使用50μl给药体积实施并伴有媒剂对照组(3％pbs中的甘油，ph＝4)。在化合物oa处理后，将动物放回其饲养笼中并监测。在收获前2或4小时进行化合物预处理。在收获前一小时，经由尾静脉内注射pbs媒剂或重组人类tgf-β1蛋白(1μg/动物，溶解于1份
4mm hcl和2份3％pbs中的甘油中)攻击动物。在收获前五分钟，将动物在异氟醚下深度麻醉并经由颈椎脱臼实施安乐死。在收获期间收集血浆、左肺叶和整个心脏。
[0912]
样品收集和处理
[0913]
如上文在肺pk/pd实验中所述收获血浆。以与肺pk/pd实验中的左肺叶相同的方式处理整个心脏。将左肺叶在500μl水中均质化，并进行ba分析。
[0914]
使用meso-scale discovery的磷酸化-smad3(psmad3)和总-smad3(tsmad3)定量
[0915]
使用msd以与上述左肺叶相同的方式处理心脏样品。以与肺pk/pd实验相同的方式实施数据分析。定量血浆、肺和心脏药物浓度。
[0916]
如通过smad3磷酸化抑制所测量，在用本文揭示的一或多种化合物处理后全身存在最小的靶标结合。在一些实例中，如通过smad3磷酸化抑制所测量，本文所揭示化合物展现全身性小于10％的靶标结合。
[0917]
实例51：同系癌症模型中的效能研究。
[0918]
本文揭示的一或多种化合物(例如表1中提供的alk5 pki值大于9.5、优选大于10.5(反映化合物抑制alk5活性的能力的测量，根据实例45测量)的化合物)当单独或与免疫治疗剂组合投与时，预计在同是癌症模型中抑制肿瘤生长。根据iacuc指南，使用6到8周龄的balb/c小鼠进行活体内效能研究。将市售4t1细胞(0.5-2.0
×
104个细胞/小鼠)皮下植入balb/c小鼠的右胁。当肿瘤达到直径约8-10mm的可触知大小时，手术去除原发性肿瘤，并将小鼠随机分配到媒剂对照或化合物治疗组。或者，将ct26细胞(0.5-2.0
×
104个细胞/小鼠)静脉内注射到balb/c小鼠中以产生癌症模型。手术后两天或注射ct26细胞后7天，用以下物质治疗小鼠：(1)媒剂对照，(2)本揭示内容的化合物，适当量和频率(调配于3％pbs中的甘油中，ph＝4)，经由经口抽吸或鼻内，(3)免疫治疗剂(例如派姆单抗或德瓦鲁单抗)，适当量和频率，或(4)本揭示内容的化合物和免疫治疗剂，各自以适当量和频率。
[0919]
每周测量体重两次。在治疗2-4周后，收获每一动物的肺和肝，并使用克隆形成转移分析测定每一组织样品中转移细胞的数目。细胞可以进一步经受facs分析、t细胞功能分析和rna提取中的一或多者。预计用一或多种本文揭示的alk5抑制剂治疗的动物组展现肺肿瘤负荷的降低。alk5抑制剂对免疫反应的活化可刺激局部和全身抗肿瘤t-细胞活化，因此还可观察到肝肿瘤负荷的降低。当与免疫治疗剂组合投与时，预计本揭示内容的化合物(例如表1中提供的化合物)相对于在用任一单独试剂治疗的动物中观察到的肿瘤负荷的降低，产生肺肿瘤负荷的增加的降低。预计本文所述的化合物与免疫治疗剂协同相互作用以抑制肿瘤生长并增加存活。
[0920]
实例52：鼠类dss诱发的肠纤维化模型中的预防性研究。
[0921]
预计本文揭示的一或多种化合物(例如表1中提供的alk5 pki值大于9.5、优选大于10.5(反映化合物抑制alk5活性的能力的测量，根据实例45测量)的化合物)在鼠类结肠炎模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。给6到8周龄的雄性c57bl/6j小鼠加标签并称重。用2.5％葡聚糖硫酸钠(dss)处理动物的饮用水7天以诱发急性结肠炎，之后正常饮用水2天。然后完成三个3周的2.5％dss治疗循环(1周的2.5％水中的dss；2周的正常水)以诱发肠纤维化。
[0922]
从dss投与的第一天开始，经由经口胃管灌食以适当量和频率(例如，每天一次)用媒剂对照或本揭示内容的化合物治疗小鼠。在第一次dss投与后9周，将动物处死，然后收获
结肠的远端、中部和近端切片用于组织学分析、rna提取和细胞因子测量。预计本揭示内容的化合物(例如表1中提供的化合物)降低结肠中的alk5活性并减缓或预防肠纤维化，如通过以下一或多者证明：(1)结肠重量对结肠长度的比率降低；(2)通过组织学观察到的细胞外基质的沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(col1a1)和结缔组织生长因子(ctgf)的表达降低；和(4)相对于载剂治疗的对照，结肠中tgf-β1和il6的产生减少。
[0923]
实例53：鼠类dss诱发的肠纤维化模型中的效能研究。
[0924]
预计本文揭示的一或多种化合物(例如表1中提供的alk5 pki值大于9.5、优选大于10.5(反映化合物抑制alk5活性的能力的测量，根据实例45测量)的化合物)在鼠类结肠炎模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。给6到8周龄的雄性c57bl/6j小鼠加标签并称重。用2.5％葡聚糖硫酸钠(dss)处理动物的饮用水7天以诱发急性结肠炎，之后正常饮用水2天。然后完成三个3周的2.5％dss治疗循环(1周的2.5％水中的dss；2周的正常水)以诱发肠纤维化。
[0925]
从3个dss投与的循环的第二个之后，经由经口胃管灌食以适当量和频率(例如，每天一次)用媒剂对照或本揭示内容的化合物治疗小鼠。在第一个dss循环后6、9或12周，将动物处死，然后收获结肠的远端、中部和近端切片用于组织学分析、rna提取和细胞因子测量。预计本揭示内容的化合物(例如表1中提供的化合物)降低结肠中的alk5活性并减缓、停止或逆转肠纤维化，如通过以下一或多者证明：(1)结肠重量对结肠长度的比率降低；(2)通过组织学观察到的细胞外基质的沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(col1a1)和结缔组织生长因子(ctgf)的表达降低；和(4)相对于载剂治疗的对照，结肠中tgf-β1和il6的产生减少。
[0926]
实例54:结肠炎的过继性t细胞转移模型中的效能研究。
[0927]
预计本文揭示的一或多种化合物(例如表1中提供的alk5 pki值大于9.5、优选大于10.5(反映化合物抑制alk5活性的能力的测量，根据实例45测量)的化合物)在结肠炎的过继性t细胞转移模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。给6到8周龄的雌性cb17scid小鼠加标签并称重，然后投与从balb/c小鼠的脾分离的cd4

cd25-cd62l

未经处置的t细胞(ip；1x106个细胞)以诱发结肠炎。
[0928]
一旦观察到腹泻和体重减少10％或更多(通常在第2周左右)，即经由经口胃管灌食以适当量和频率(例如，每天一次)用媒剂对照或本揭示内容的化合物治疗小鼠。诱发结肠炎后45天处死动物，然后收集结肠的远端、中部和近端切片用于组织学分析、rna提取和细胞因子测量。预计本揭示内容的化合物(例如表1中提供的化合物)降低结肠中的alk5活性并减缓、停止或逆转肠纤维化，如通过以下一或多者证明：(1)结肠重量对结肠长度的比率降低；(2)通过组织学观察到的细胞外基质的沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(col1a1)和结缔组织生长因子(ctgf)的表达降低；和(4)相对于载剂治疗的对照，结肠中tgf-β1和il6的产生减少。
[0929]
实例55：严重肺高血压的野百合碱模型中的效能研究。
[0930]
预计本文揭示的一或多种化合物(例如表1中提供的alk5 pki值大于9.5、优选大于10.5(反映化合物抑制alk5活性的能力的测量，根据实例45测量)的化合物)在严重肺高血压的野百合碱(mct)模型中减缓、停止或逆转肺高血压的进展。给雄性斯普拉格-道利(sprague-dawley)大鼠加标签、称重，并随机分成对照组和mct治疗组。向mct治疗组中的大鼠投与单剂量的mct(60mg/kg，s.c.)，然后用以下物质治疗：(1)媒剂对照；(2)西地那非
(sildenafil)(30mg/kg,p.o.,b.i.d.)；或(3)本揭示内容的化合物，适当量和频率(调配于3％pbs中甘油中；ph＝4)，经由经口抽吸。
[0931]
治疗2周后，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉动物，以最终监测肺和全身动脉压以及心率。然后收获每一动物的肺用于组织学分析。预计本揭示内容的化合物(例如表1中提供的化合物)降低肺中的alk5活性，并且减缓、停止或逆转肺高血压的进展，如通过以下的一或多者证明：(1)肺收缩动脉压的降低；(2)右心室(rv)收缩压的降低；(3)rv舒张压的降低；(4)心搏出量的增加；(5)rv肥大的减少；(6)血管和/或肺泡细胞中psmad2或psmad3染色的减少；(7)内侧厚度的减少；(8)血管平滑肌细胞增殖的减少；(9)血管平滑肌肥大的减少；和(10)基质金属蛋白酶(mmp)-2和/或mmp-9表达的降低。