一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法

一种梅山猪气喘病间接elisa检测方法
技术领域
1.本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种梅山猪气喘病间接elisa检测方法。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。
3.猪“高热病”，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”(highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome，hp-prrs)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株(jxa1-r株)、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株(hun4-f112株)、高致病性猪蓝耳病病毒天津株(tj株)。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株(jxa1-r株)和湖南株(hun4-f112株)、天津株(tj株)。疫苗的使用需要配备适合的检测试剂盒才能进行免疫效果评估。本研究关于猪蓝耳病nsp2 片段部分蛋白的制备，可运用于猪蓝耳病间接elisa抗体的检测；建立了间接elisa的方法来检测猪蓝耳病毒抗体，为猪蓝耳病免疫监测提供了技术平台。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种快速、简便、特异性好的能够区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法，为蓝耳病免疫监测和流行病学研究提供技术平台，对prrs的防控有着重要的意义。
5.一种梅山猪气喘病间接elisa检测方法，包括以下实施步骤：
6.t1：构建重组表达质粒pet-32a-n1n2
7.以prrsv nsp2基因组为模板，针对n1、n2基因序列设计特异性引物，通过pcr扩增得到目的片段，构建克隆质粒pmd-18t-n1n2，对克隆载体和原核表达载体pet-32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒 pet-32a-n1n2；
8.t2：对目的蛋白进行表达及纯化
9.将构建重组表达质粒pet-32a-n1n2转入e.colibl21(de3)，诱导表达融合蛋白，利用his柱层析进行纯化，得到经sds-page电泳分析纯度较高的蛋白；
10.t3：建立间接elisa检测方法
11.利用纯化的pet-32a-n1n2蛋白，建立间接elisa检测方法，确定 pet-32a-n1n2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200和37℃60min；封闭液(1％bsa)封闭时间为37℃60min；羊抗猪igg-hrp使用浓度和反应时间分别为1:5000和 37℃60min；底物25℃避光反应20min。
12.优选的，所述步骤t1中，针对n1基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5
’‑
acgcgtcgacaagatcacacgcccaaaat-3’；针对n2基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5
’‑
cgcggatccttatgcgaggtaacatcacaaac-3’。
13.优选的，所述步骤t3中，针对prrsv-nsp2-n1n2蛋白样本阴阳性临界值，判定标准是：当样本0d450》0.4401时(p/n＞2.5)判定为阳性，当样本0d450 ＜0.4401判定为阴性。
14.优选的，所述步骤t2中，纯化所得的目的蛋白，经western blot检测能与6
×
his-tag antibody mouse monoclonal抗体特异性结合。
15.优选的，所述步骤t2中，纯化所得的目的蛋白为可溶性蛋白。
16.优选的，步骤t2中对目的蛋白的诱导表达的最佳条件为iptg浓度为 1.2mm条件下，诱导8小时。
17.优选的，步骤t1中所得pet-32a-n1n2重组质粒大小为307bp。
18.优选的，pet-32a-n1n2蛋白皆不与猪瘟病毒(hcv)，猪伪狂犬病毒(prv) 和猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)tj株抗体阳性血清发生反应。
19.本发明的有益效果：
20.1、利用rt-pcr和蛋白原核表达技术获得纯度较高且具有良好特异性和免疫原性的融合蛋白pet-32a-n1n2，以融合蛋白pet-32a-n1n2为包被抗原，建立检测蓝耳病血清抗体的间接elisa方法；
21.2、该方法适用于大规模检测蓝耳病血清抗体，为区分prrsv野毒株与天津株疫苗株的抗体检测提供了一种特异性强、稳定性高、快速便捷的方法，为猪蓝耳病免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。
附图说明
22.图1为n1n2基因rt-pcr扩增结果图
23.图中：m：dna marker dl2000，1：prrsv nsp2的n1n2基因pcr产物。
24.图2为质粒pmd18-t-n1n2的pcr扩增结果图
25.图中：m：dna marker dl2000；1：质粒pmd18-n1n2的pcr产物。
26.图3为质粒pmd18-t-n1n2的酶切结果图
27.图中：m：dna marker dl2000；1：质粒pmd18-n1n2的酶切产物。
28.图4为重组质粒pet-32a-n1n2鉴定结果图
29.图中：m：dna marker dl2000，1：pet-32a-n1n2质粒pcr产物。
30.图5为重组质粒测序结果图。
31.图6为重组菌诱导表达产物的sds-page分析图
32.图中：m：标准蛋白质分子量；1：诱导pet-32a-n1n2/bl21；2：未诱导 pet-32a-n1n2/bl21；3：诱导pet-32a/bl21空载体。
33.图7为重组菌pet-32a-n1n2/bl21诱导1-8h表达产物的sds-page分析图
34.图中：m：蛋白分子质量标准marker；1-8：1-8h pet-32a-n1n2/bl21表达产物。
35.图8为重组菌pet-32a-n1n2/bl21不同iptg浓度诱导表达产物的 sds-page分析图
36.图中：m：标准蛋白质分子量；1-6：分别为0.2mm、0.4mm、0.8mm、1.2mm、 1.6mm、2.0mm的iptg浓度诱导pet-32a-n1n2/bl21表达。
37.图9为pet-32a-n1n2重组蛋白可溶性分析图
38.图中：m：蛋白分子质量标准marker；1：pet-32a-n1n2超声裂解上清； 2：pet-32a-n1n2超声裂解沉淀。
39.图10为纯化pet-32a-n1n2重组蛋白sds-page分析图
40.图中：m：蛋白分子质量标准marker；1-6：纯化pet-32a-n1n2重组蛋白。
41.图11为pet-32a-n1n2重组蛋白的western blot检测图
42.图中：m：蛋白质分子质量标准；1-6：pet-32a-n1n2重组蛋白。
具体实施方式
43.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但不限制本发明的保护范围和应用范围：
44.一、一种梅山猪气喘病间接elisa检测方法的建立
45.本发明根据genbank已发表的prrsv nsp2基因序列，设计一对克隆引物 (n1、n2)，扩增包含prrsv-nsp2-n1n2基因的序列，大小为332bp，并插入 salⅰ和bamhⅰ两个酶切位点。对目的片段和原核表达载体pet-32a同时双酶切，连接后得到重组表达质粒pet-32a-n1n2。
46.将重组质粒转入感受态细胞e.colibl21(de3)中，获得阳性重组大肠杆菌 bl21(de3)，将阳性重组大肠杆菌bl21(de3)接种于amp/lb培养基中进行iptg 诱导表达，iptg浓度为1mm条件下，诱导4小时后，收集样品。经sds-page 电泳和western blot检测，证实了所表达的重组蛋白大小相符具有免疫反应活性，且无交叉反应。通过对其特异性、敏感性及工作条件进行优化，建立了区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法。
47.实施例1
48.引物设计
49.根据genbank已发表的prrsv nsp2基因序列，设计一对克隆引物(n1、 n2)扩增包含prrsv-nsp2-n1n2基因的序列，大小为332bp，见图1，并插入 salⅰ和bamhⅰ两个酶切位点。引物序列送大连宝生物工程公司合成。
50.实施例2
51.prrsv-nsp2-n1n2基因克隆
52.2.1prrsv病毒rna的抽提
53.按照总rna抽提试剂盒说明书(北京天根公司)步骤进行操作，提取prrsv 病毒抗原的rna。步骤如下：
①
取200μl prrsv病毒抗原，加入300μl裂解液rl和10μl蛋白酶k，振荡混匀放56℃水浴锅处理15分钟；
②
加入 250μl无水乙醇，混匀后转入吸附柱cr3中(吸附柱套在收集管中)，12000 转/分钟离心1分钟；
③
弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入350μl的去蛋白液rw1，再12000转/分钟离心1分钟；
④
弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入配制
好的dnaseⅰ工作液80μl，静置15分钟，加入350μl的去蛋白液，再12000转/分钟离心1分钟；
⑤
弃掉收集管中废液，向吸附柱中加入 500μl的漂洗液rw，静置2分钟，12000转/分钟离心1分钟；
⑥
弃掉收集管中的废液，再向吸附柱中加入500μl的漂洗液，12000转/分钟离心1分钟；
⑦
弃掉收集管中的废液，再12000转/分钟离心2分钟，把吸附柱取出置于新的rnase-free离心管中，打开盖子晾干；
⑧
向吸附柱中加入35μl ddh2o，静置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，离心管中为rna溶液。
54.一种梅山猪气喘病间接elisa检测方法，包括以下实施步骤：
55.t1：构建重组表达质粒pet-32a-n1n2
56.以prrsv nsp2基因组为模板，针对n1、n2基因序列设计特异性引物，通过pcr扩增得到目的片段，构建克隆质粒pmd-18t-n1n2，对克隆载体和原核表达载体pet-32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒 pet-32a-n1n2；
57.t2：对目的蛋白进行表达及纯化
58.将构建重组表达质粒pet-32a-n1n2转入e.colibl21(de3)，诱导表达融合蛋白，利用his柱层析进行纯化，得到经sds-page电泳分析纯度较高的蛋白；
59.t3：建立间接elisa检测方法
60.利用纯化的pet-32a-n1n2蛋白，建立间接elisa检测方法，确定pet-32a-n1n2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200和37℃60min；封闭液(1％bsa)封闭时间为37℃60min；羊抗猪igg-hrp使用浓度和反应时间分别为1:5000和 37℃60min；底物25℃避光反应20min。所述步骤t1中，针对n1基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5
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acgcgtcgacaagatcacacgcccaaaat-3’；针对n2基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5
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cgcggatccttatgcgaggtaacatcacaaac-3’。所述步骤t3中，针对 prrsv-nsp2-n1n2蛋白样本阴阳性临界值，判定标准是：当样本0d450》0.4401 时(p/n＞2.5)判定为阳性，当样本0d450＜0.4401判定为阴性。所述步骤t2 中，纯化所得的目的蛋白，经western blot检测能与6
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his-tag antibodymouse monoclonal抗体特异性结合。所述步骤t2中，纯化所得的目的蛋白为可溶性蛋白。优选的，步骤t2中对目的蛋白的诱导表达的最佳条件为iptg 浓度为1.2mm条件下，诱导8小时。步骤t1中所得pet-32a-n1n2重组质粒大小为307bp。pet-32a-n1n2蛋白皆不与猪瘟病毒(hcv)，猪伪狂犬病毒(prv) 和猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)tj株抗体阳性血清发生反应。
61.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。