一种诱导牛乳过敏耐受肽的制备方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导牛乳过敏耐受肽的制备方法。
技术背景
2.牛乳过敏是由牛乳中的蛋白质所引起不良免疫反应，可引起哮喘、湿疹、过敏性鼻炎、胃肠出血、腹泻等症状。因此，牛乳被认定为八大类主要过敏食物之一。食物过敏反应是一种免疫学变态反应，其反应的物质基础是抗原表位与抗体对位。在利用各种技术降低鲜牛乳致敏性的过程中，发现大分子断裂后产生的诸多肽段中，有部分肽段具有着特定的功能性。而从中发掘诱导耐受肽的研究，可作为婴儿配方奶粉的储备技术，有助于低致敏配方奶粉的进一步发展。


技术实现要素：

3.本发明针对牛乳蛋白，基于生物信息学方法预测并结合文献报道数据获得60个牛乳主要过敏原的ige表位。通过定向酶解结合发酵技术针对性的裂解过敏原表位，最终在产物中筛选出一个诱导牛乳耐受肽，并建立其制备方法。
4.本发明所述的一种诱导牛乳过敏耐受肽的制备方法，是通过以下步骤来实现：
5.(1)从ncbi获得牛乳主要过敏原氨基酸序列信息，基于生物信息学方法预测并结合文献报道数据获得60个牛乳主要过敏原的ige表位。
6.(2)运用peptidecutter等蛋白酶酶切位点预测网站，筛选精准水解牛乳主要过敏原表位的蛋白酶。
7.(3)对碱性蛋白酶酶解条件进行响应面优化，得出最优酶解条件，并结合复合乳酸菌发酵，获得大量肽段。
8.(4)构建dc细胞和t细胞共培养模型，评估肽段对th0细胞分化的影响，确定在酶解产物中获得了潜在的免疫耐受肽段。
9.本发明采用酶解复合发酵术，它通过定向酶解结合发酵技术针对性的裂解过敏原表位，最终在产物中筛选出诱导牛乳耐受肽。这种制备方法能够大量获得诱导耐受肽，对于婴幼儿低致敏配方乳粉的制备具有重要的意义。
附图说明
10.图1碱性蛋白酶水解牛乳的最适条件
11.图2酶解协同发酵处理鲜奶产物的电泳结果
12.图3细胞因子检测结果
具体实施方式
13.本发明通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。
14.实施例1。
15.具体实施过程包括如下步骤。
16.1、表位获取
17.汇总文献中已经报道的表位信息，结合dnastar软件预测，共获得60 个牛乳过敏原b表位；
18.2、酶解复合发酵方法条件优化
19.根据已有的蛋白酶酶切位点信息，筛选出碱性蛋白酶作为实验最佳用酶，经响应面优化，得到最佳酶解条件，结果见图1。在此条件下酶解后致敏性可降低96.167％，之后复合乳酸菌发酵，对产物进行物料性质评估，结果显示经酶解、发酵后的牛乳蛋白被降解成极小的小分子肽，小分子电泳结果见图2。
20.3、诱导耐受功能的评估
21.构建dc细胞和t细胞共培养模型，探究肽段对th0细胞分化的影响。通过评估肽段对共培养模型细胞因子的释放，结果见图3。结果显示，酶解协同发酵产物中存在诱导牛乳过敏的免疫耐受肽段。


技术特征：
1.从ncbi获得牛乳主要过敏原氨基酸序列信息，基于生物信息学方法预测并结合文献报道数据获得60个牛乳主要过敏原的ige表位；运用peptidecutter等蛋白酶酶切位点预测网站，筛选精准水解牛乳主要过敏原表位的蛋白酶；对碱性蛋白酶酶解条件进行响应面优化，得出最优酶解条件为：碱性蛋白酶的理论最适e/s为3.75%，ph为9.21，酶解时间为3.87h，酶解温度为57.03℃，此时酶解产物致敏性降低比率可达96.167%。2.发酵采取瑞士乳杆菌 cicc 20275复合碱性蛋白酶进行发酵处理；菌种经3次活化后用于发酵实验，发酵接种量为2%，发酵时间24h，发酵温度37℃。

技术总结
本发明针对牛乳蛋白，基于生物信息学方法预测并结合文献报道数据获得60个牛乳主要过敏原的IgE表位。通过定向酶解结合发酵技术针对性的裂解过敏原表位，最终在产物中筛选出一个诱导牛乳耐受肽，并建立其制备方法。本发明采用酶解复合发酵术，它通过定向酶解结合发酵技术针对性的裂解过敏原表位，最终在产物中筛选出诱导牛乳耐受肽。这种制备方法能够大量获得诱导耐受肽，对于婴幼儿低致敏配方乳粉的制备具有重要的意义。备具有重要的意义。备具有重要的意义。


技术研发人员：胡巍 谭宏凯 黎晶晶 鄢宇婷 杨若婷 陈红兵 李欣
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2021.06.02
技术公布日：2022/12/5