肿瘤联合治疗

肿瘤联合治疗
优先权
1.依照美国法典第35章第119条，本技术要求2020年3月18日提交的美国临时专利申请序列号62/991,298的优先权，该临时专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
2.本公开是关于用于肿瘤治疗的方法以及在肿瘤治疗中使用的组合物。


背景技术：

3.若干疗法被用于对异常生物组织(如癌症)进行治疗，包括热消融、冷冻消融、超声消融、化学消融、射频(rf)电消融、和不可逆电穿孔。
4.用于生物组织破坏的新的不同方法是所期望的。本公开描述了用于使用不可逆电穿孔的组织破坏的新组合物及联合方法。


技术实现要素：

5.在一些方面，本发明公开了对组织体积进行治疗的方法，包括(a)将包含可释放膜活性剂的可植入组合物施用至靶部位，使得膜活性剂被局部地释放到组织体积；及(b)通过向组织体积施加脉冲电场而执行该组织体积的治疗。例如，通过脉冲电场的施加可执行不可逆电穿孔、可逆电穿孔和/或热处理。
6.如本文中使用的“膜活性剂”被定义为影响细胞膜的结构和动力学的药剂或分子，如阳离子或两亲性或阴离子分子。阳离子分子借助于电荷-电荷吸引而与细胞膜结合。两亲分子经由带电荷的官能团而与细胞膜结合并借助于疏水相互作用而与细胞膜脂质结合。阴离子分子在质子化时会变成亲水性并与细胞膜脂质相互作用。如本文中使用的“膜溶解剂”是膜活性剂的一个子集，该膜活性剂是指破坏膜完整性的药剂或分子。膜活性剂当以充分高的浓度而存在时经常变成膜溶解性。
7.在一些实施方案中，该组织体积与全部或部分的肿瘤和/或在肿瘤附近的健康组织相对应(经由血管系统形成边缘)。肿瘤的示例包括胰腺、乳房、肺、前列腺、肝、肾、脑、子宫、卵巢、胃、十二指肠、或皮肤的肿瘤。
8.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，可植入组合物是包含可释放膜活性剂的栓塞组合物，该栓塞组合物被施用至一个或多个血管(这些血管提供血液给该组织体积)或者该栓塞组合物经皮肤或利用内镜通过注射而被施用。
9.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，可植入组合物是液体组合物，该液体组合物在导入身体中时变成固体植入物。例如，可植入组合物可以是具有粘弹性质的凝胶，该凝胶是以液体形式被施用并且在活化或体液接触时变成固体。
10.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，所施用的可植入组合物是至少部分地生物稳定的或生物可吸收的。
11.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，可植入组合物是固体可植入组合物。
12.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，固体可植入组合物是可植入颗粒。在部分的这些实施方案中，颗粒的最大截面尺寸可在 10nm至10mm的范围内(例如，在10nm至100nm至1000nm至10微米至 100微米至1000微米至10mm的范围内)。
13.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，固体栓塞组合物可以是支撑体。支撑体的示例包括例如圆盘、杆、支架、线圈、基准标记物、平板、管、或半透性编织网。
14.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于整个固体可植入组合物中，或者膜活性剂仅存在于一部分的固体可植入组合物中。
15.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于固体可植入组合物的表面但不存在于固体可植入组合物的主体中，或者膜活性剂存在于固体可植入组合物的主体中但不存在于固体可植入组合物的表面，或者膜活性剂均匀地存在于固体可植入组合物中，或者膜活性剂以浓度梯度而存在于固体可植入组合物中。
16.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于设置在下面的基底材料上的一层或多层中，或者将膜活性剂包封于包封材料内部，或者将膜活性剂分散于基质材料内部。
17.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，将膜活性剂涂覆于或注入栓塞微球中或者经由共价键而偶联到栓塞微球。
18.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂是选自阳离子分子、两亲性分子、和阴离子分子。例如，膜活性剂可选自阳离子聚合物、阴离子聚合物和两亲性聚合物。
19.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂可以以突释方式(突释曲线)被局部地释放到组织体积，膜活性剂可以以缓释方式(缓释曲线)被局部地释放到组织体积，或者膜活性剂可以以突释方式与缓释方式的组合被局部地释放到组织体积。
20.在可连同任何上述方面和实施方案而应用一些实施方案中，膜活性剂的释放是由电脉冲、超声、磁场变化、或热输入所引发。
21.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，治疗是在与施用可植入组合物的相同过程中执行。
22.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，治疗是在可植入组合物的施用之后的过程中执行。
23.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，治疗是在施用可植入组合物后的同一天、第二天的范围内，或者在第2天至第1周至第 2周至30天范围内的时间的过程中执行。
24.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，将用于治疗的一个或多个电极放置在组织体积内部或者与组织体积相邻的位置。
25.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，(a)在皮肤上的一个或多个位置，将用于治疗的一个或多个电极放置在与组织体积相邻的位置；(b)将用于治
疗的一个或多个电极经皮地放置在组织体积的内部或者与组织体积相邻的位置；(c)经由被插入一个或多个天然体腔中的装置，将用于治疗的一个或多个电极放置在组织体积内部或者与组织体积相邻的位置；或者(d)利用前述置放技术的任意两种或三种技术的组合而放置一个或多个电极。
26.本公开的其他方面是关于包含可释放膜活性剂的栓塞组合物。
27.在部分的这些实施方案中，栓塞组合物是固体栓塞组合物。
28.在部分的这些实施方案中，塞组合物是液体组合物，该液体组合物在导入身体中时变成固体栓塞组合物。例如，栓塞组合物可以是具有粘弹性质的凝胶，其以液体的形式被施用并且在活化或体液接触时变成固体。
29.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，固体栓塞组合物是至少部分地生物稳定的或生物可吸收的。
30.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，固体栓塞组合物是可植入颗粒。在部分的这些实施方案中，颗粒的最大截面尺寸可在10 nm至10mm的范围内。
31.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，固体栓塞组合物是支撑体。
32.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于整个固体栓塞组合物中，或者膜活性剂仅存在于一部分的固体栓塞组合物中。
33.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于固体栓塞组合物的表面但不存在于固体栓塞组合物的主体中，膜活性剂存在于固体栓塞组合物的主体中但不存在于固体栓塞组合物的表面，膜活性剂均匀地存在于固体栓塞组合物中，或者膜活性剂以浓度梯度而存在于固体栓塞组合物中。
34.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂存在于设置在下层基底材料上的一层或多层中，将膜活性剂包封于包封材料内部，将膜活性剂分散于基质材料内部，或者将膜活性偶联到基质材料。
35.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，膜活性剂是选自阳离子分子、两亲分子、和阴离子分子。例如，膜活性剂可选自阳离子聚合物、阴离子聚合物和两亲性聚合物。
36.在可连同任何上述方面和实施方案而应用的一些实施方案中，在将栓塞组合物植入受试者中时，膜活性剂是以突释方式、以缓释方式、或者以突释方式与缓释方式的组合而被局部地释放。
37.在阅读接下来的详细说明时，本公开的其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
38.图1a-图1d示出了用荧光标记pahm(聚(甲基丙烯酸6-氨基己酯))涂覆的微球。(图1a)是用不同量的pahm(μg pahm/mg pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)涂覆的微球的代表性荧光显微镜图像。(图1b)是在单独微球上的 pahm涂层的荧光强度。(图1c)是通过不同方法用pahm涂覆的微球的代表性荧光显微镜图像。(图1d)是在利用不同方法涂覆之后在单独微球上的 pahm的荧光强度。数据被显示为平均值 /-sd(a)(n＝16～63)(b)(n＝165～186)。带图凯
hsd检验的方差分析(
*
r《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)。
39.图2a和图2b图解说明了在细胞培养基中pahm的量化。(图2a)是不同pahm浓度的紫外可见光吸收光谱。(图2b)是相对于pahm浓度在 245nm处的吸光度的校准曲线。
40.图3示出了在37℃下在细胞培养基中来自涂覆微球的pahm的释放动力学。数据被显示为平均值 /-标准差(n＝4)并且用两相指数关联模型进行拟合。
41.图4a-图4b示出了在分别实施了不可逆电穿孔(图4a)或pahm处理 (图4b)之后的细胞存活率。数据被显示为平均值 /-标准差(图4a)(n＝4～6) (图4b)(n＝9～13)。带图凯hsd检验的方差分析(*p《0.05，**p《0.01， ***p《0.001，****p《0.0001)。
42.图5a-图5f示出了连同pahm暴露达(图5a)15分钟(图5b)、4小时(图5c)、24小时的不可逆电穿孔处理之后的细胞存活率。数据被显示为平均值 /-标准差(n＝3～12)。图凯hsd检验的方差分析(*p《0.05、**p《0.01、 ***p《0.001、****p《0.0001)。(图5d)联合指数分析(ci《1、＝0.9～1(虚线)、》1分别表示协同作用、近似相加作用、和拮抗作用)。用于不可逆电穿孔(图5e)和pahm(图5f)(dri《1、＝1(虚线)、》1的剂量减少指数分析分别表示不利的剂量减少、无剂量减少、有利的剂量减少)。
43.图6a-图6b示出了在暴露于从具有71μm(图6a)100μm(图6b)平均直径的涂覆微球中所释放的pahm之后的细胞存活率。数据被显示为平均值 /-标准差(n＝6～12)，图凯hsd检验的方差分析(*p《0.05、**p《0.01、 ***p《0.001、****p《0.0001)。
44.图7示出了在暴露于未涂覆的栓塞微球之后的细胞存活率。数据被显示为平均值 /-标准差(n＝2)。
45.图8a-图8f示出了连同暴露于从涂覆微球中释放的pahm达15分钟 (图8a)、4小时(图8b)、24小时(图8c)的不可逆电穿孔处理之后的细胞存活率。数据被显示为平均值 /-标准差(n＝3～9)。图凯hsd检验的方差分析(*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001、****p《0.0001)。(图8d)联合指数分析(ci《1、＝0.9-1(虚线)、》1分别表示协同作用、近似相加作用、和拮抗作用)。用于不可逆电穿孔(图8e)和微球涂覆的pahm(图8f)(dri《1、＝1(虚线)、》1)的剂量减少指数分析分别表示不利的剂量减少、无剂量减少、有利的剂量减少)。
具体实施方式
46.电穿孔是其中生物细胞通过在细胞膜中开孔而对电场做出反应的现象。在低电场强度下，在细胞膜中不形成孔。在超过电穿孔阈值的情况下，孔开始可逆地形成。可逆电穿孔已被长期用于将材料导入生物细胞，否则其将不能穿过细胞膜。例如，可将化学治疗中使用的遗传物质或大分子导入至细胞的内部。在除去电场之后，所形成的孔在“短暂的”或“可逆的”电穿孔中闭合。
47.在相对较高幅值的电穿孔剂量下，响应于所施加电场而形成的孔会变得过大以致细胞膜不能恢复。如果细胞膜不恢复，那么细胞将由于此电穿孔(被称为“不可逆”电穿孔)而死亡。不可逆电穿孔(ire)的阈值随着细胞大小和形状、总体组织结构、和细胞间液特征而变化。这些阈值本身可以由局部电场强度和持续时间所限定，例如其中在较短的持续时间下需要较高幅值电压，并且在较长持续时间下需要较低幅值电压。
48.在本公开中，描述了对组织体积进行治疗的方法，包括(a)将包含可释放膜活性剂的可植入组合物施用至靶部位，使得膜活性剂被局部地释放至组织体积；及(b)在组织体积
上执行不可逆电穿孔。
49.在根据本公开的电穿孔处理期间，穿越位于待处理组织体积内部或者与待处理组织体积相邻位置的两个或更多电极而施加电压，由此在该组织体积中产生电场。在不可逆电穿孔中可以被调整的参数包括：电压幅值、电压持续时间(脉冲长度)、脉冲的数量、电极的数量、和电极间距。
50.可应用根据本公开的不可逆电穿孔处理的组织体积包括：良性和恶性肿瘤体积、以及包含可能发挥作用的细胞的经灌注或健康组织体积(该可能发挥作用的细胞构成了划界肿瘤体积)。肿瘤体积的示例包括胰腺肿瘤、食管肿瘤、膀胱肿瘤、胆管肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、乳房肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、子宫肿瘤(包括子宫囊肿)、卵巢肿瘤、腹膜后肿瘤、末端肿瘤、盆腔肿瘤、以及神经内分泌肿瘤或癌前增生细胞簇或肿瘤结构。
51.大范围的不可逆电穿孔设定可连同本公开的不可逆电穿孔处理而使用，包括电压，这些电压提供在250～2500v/cm更典型地375～1750v/cm范围内的电场强度、在1至5000更典型地5～300范围内的脉冲数、在0.5至1000μs更典型地1至250μs范围内的脉冲宽度、在0.25至10hz范围内的脉冲频率、和在0.1至2cm范围内的电极间距。电极可在单极模式、双极模式或者在穿过多电极组合或探针的多路构型中操作。
52.可将电极放置在通过使用各种方法的不可逆电穿孔而被处理的组织体积的内部或者与之相邻的位置，这些方法包括(a)将一个或多个电极放置在皮肤的一个或多个位置上(包括返回单极放置)；(b)一个或多个电极在一个或多个组织位置的经皮电极放置；(c)一个或多个电极在一个或多个天然体腔(例如，血管、胃肠道、胆管、淋巴管、尿路、肺气道、尿道空间、膀胱、或其他体腔)中或者与之相邻位置的放置；或者(d)这些置放技术的任意两种或全部三种的组合。
53.关于一个或多个电极在天然体腔中或者与之相邻位置的放置，可使装置 (如导管、内窥镜、支气管镜、十二指肠镜或类似的微创的一次性使用或可重复使用的直接可视化探头)行进至体腔中，在此情况下可使一个或多个电极定位在该装置上并进入到与腔壁接触的状态，或者可将一个或多个电极从该装置中经过紧靠该装置的腔壁而插入在腔壁附近的组织中。
54.如前所述，本公开中描述了对组织体积进行治疗的方法，包括(a)将包含可释放膜活性剂的可植入组合物施用至靶部位，使得膜活性剂被局部地释放至组织体积；及(b)在组织体积上执行不可逆电穿孔。在这方面，膜活性剂可用于增加在给定电场强度下被杀伤细胞的数量并且/或者降低杀伤给定数量细胞所需的电场强度。
55.释放膜活性剂可植入组合物可选自至少部分地是生物稳定的膜活性剂释放可植入组合物、及是生物可吸收的膜活性剂释放可植入组合物。
56.在一些实施方案中，膜活性剂释放可植入组合物可以是包含膜活性剂的栓塞组合物，并且可将该栓塞组合物施用至将血液提供给组织体积的一个或多个血管，由此形成栓子/栓塞。以这种方式，除了利用膜活性剂增强的不可逆电穿孔而杀伤细胞以外，本公开的方法可通过切断细胞的血液供给而杀伤细胞。
57.膜活性剂的示例包括阳离子分子、两亲分子、和阴离子分子。
58.膜活性阳离子分子可选自具有伯、仲、叔或季胺基的天然和合成阳离子聚合物。
59.天然阳离子聚合物包括阳离子多肽类(如聚赖氨酸、聚精氨酸和聚鸟氨酸)、阳离
子多胺类(如亚精胺和精胺及它们的衍生物)、阳离子多糖类(如壳聚糖和阳离子明胶)、富含阳离子氨基酸的阳离子肽类(其包括赖氨酸和精氨酸，如天蚕抗菌肽a、爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、铃蟾抗菌肽、蜂毒肽、蛇毒抗菌肽、人防御素、乳铁蛋白肽、锯鳞肽、吲哚抗菌肽(indolicidin)、tritripticin、 holotricin、鞘翅肽(coleoptericin)、红蝽素抗菌肽(pyrrhocoricin)，等)。
60.合成阳离子聚合物是含有伯、仲、叔或季胺基的聚合物。这些聚合物可含有线性、嵌段、接枝、支化、树突状和网络结构的分子链段。这些阳离子聚合物可选自以下的类别：聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酰胺类、聚酰胺类、聚酯类、聚原酸酯类(polyorthoesters)、聚(β
‑ꢀ
氨基酯类)、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚酰胺-胺、聚降冰片烯、及它们的共聚物。它们可利用自由基聚合、开环聚合、聚加成和缩聚反应而合成。合成阳离子聚合物也包括带非天然序列(这些序列可以与细胞膜结合)的阳离子肽类。这种阳离子肽类富含赖氨酸和精氨酸，并且可以利用本领域中已知的固相法而合成。
61.膜溶解性两亲分子包括用亲水性基团和结构(如含有饱和及不饱和c-c 键的线性、支化、环状、芳香烃类)进行改性的前述天然和合成阳离子聚合物。膜活性两亲分子还包括含有亲水性氨基酸类(如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)或亲水性结构(如烃类)的前述阳离子肽类。
62.膜活性阴离子分子包括某些含有羧酸的合成聚合物(如聚烷基丙烯酸类) 和肽类(如“gala”：weaalaealaealaehlaealaealealaa)。这些聚合物和肽类在酸性ph下质子化，变成亲水性，并且采用便于与细胞脂膜相互作用的构造。
63.膜溶解剂是导致细胞膜破坏的特定膜活性剂。膜溶解剂的示例包括氨基烷基丙烯酸酯类，如氨基c
2-c
10
烷基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸氨基烷基酯类(如氨基c
2-c
10
烷基甲基丙烯酸酯类)、甲基丙烯酸氨基烷基酯类与烷基丙烯酸酯类的共聚物、及甲基丙烯酸氨基烷基酯类与烷基甲基丙烯酸酯类的共聚物。膜溶解性甲基丙烯酸氨基烷基酯类的示例包括聚(甲基丙烯酸6-氨基己基酯) (pahm)、聚(甲基丙烯酸氨基乙基酯-甲基丙烯酸丁酯)共聚物、及聚(2-环己亚胺基)乙基甲基丙烯酸酯。
64.在各种实施方案中，膜活性剂释放可植入组合物(释放膜活性剂的可植入组合物)可以是液体组合物，该液体组合物在导入身体中时变成固体膜活性剂释放植入物(例如，该组合物可采用液体栓塞组合物的形式)。
65.在各种实施方案中，膜活性剂释放可植入组合物可以是固体组合物。膜活性剂可位于整个固体组合物中或者位于仅一部分的固体组合物中。例如，膜活性剂可以存在于在下面的基底材料上的一层或多层中(例如，所述层可完全地由膜活性剂构成，或者可与从其中释放膜活性剂的一种或多种另外的生物可吸收或生物稳定的基质材料混合)，可将膜活性剂包封于包封材料内部(例如，对于膜活性剂为可渗透的生物可吸收包封材料或生物稳定包封材料)，膜活性剂可分散于基底材料内(例如，通过将基底材料膜活性剂吸收入先前存在的基底材料中，通过以含有膜活性剂的基质的形式而形成基底，等)，可经由共价键(如酰胺、酯、醚、硫醇醚、二硫酚、原酸酯、缩醛、缩酮)将膜活性剂附接到从其中膜活性剂被释放的一个或多个固体组合物中，膜活性剂可经由共价键(如生物素-亲和素、金属螯合物、电荷-电荷静电相互作用、主客体包络物(如聚乙二醇/环糊精、金刚烷胺/环糊精))而附接到从其中膜活性剂被释放的固体组合物中的一种或多种，或者通过完全地由膜活性剂形成固
体组合物。
66.因此，除了膜活性剂以外，本公开的可植入组合物还可包含可以是生物可吸收和/或生物稳定的基底材料、基质材料和包封材料。生物可吸收和/或生物稳定材料的示例包括生物可吸收和/或生物稳定的聚合物、生物可吸收和/或生物稳定的金属和金属合金、及生物可吸收和/或生物稳定的陶瓷和玻璃材料。
67.本文中使用的生物可吸收和生物稳定的聚合物以及聚合物膜活性剂包括均聚物和共聚物。如本文中使用的“均聚物”是含有单一组成单元的多个拷贝的聚合物。“共聚物”是含有至少两种不同组成单元的多个拷贝的聚合物，其示例包括无规、统计、梯度、周期(例如，交替)和嵌段(例如，二嵌段、三嵌段等)共聚物。本公开中使用的聚合物可以是线性或支化的。支化构型包括星形构型(例如，其中从单个分枝点发散出三个或更多链的构型)、梳状构型(例如，具有一个主链和多个侧链的构型)、树突状构型(例如，树枝状和超支化聚合物)，等。
68.生物可吸收和生物稳定聚合物的具体示例可选自例如下列：多元羧酸均聚物和共聚物，包括聚丙烯酸、烷基丙烯酸酯和烷基甲基丙烯酸酯均聚物和共聚物(包括聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸正丁酯-b-甲基丙烯酸甲酯)和聚(苯乙烯-b-丙烯酸正丁酯-b-苯乙烯)三嵌段共聚物)；聚酰胺类，包括尼龙6,6、尼龙 12、和聚醚-聚酰胺嵌段共聚物(例如，树脂)；乙烯基均聚物和共聚物，包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚卤代乙烯(如聚氯乙烯)和乙烯-醋酸乙烯共聚物(eva)、乙烯基芳族均聚物和共聚物(如聚苯乙烯、苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物)、乙烯基芳族烯烃共聚物(包括苯乙烯-丁二烯共聚物)、苯乙烯
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乙烯-丁烯共聚物(例如，聚(苯乙烯-b-乙烯/丁烯-b-苯乙烯)(sebs)嵌段共聚物，作为g系列聚合物而购得)、苯乙烯-异戊二烯共聚物(例如，聚 (苯乙烯-b-异戊二烯-b-苯乙烯)三嵌段共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、丙烯腈
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丁二烯-苯乙烯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物和苯乙烯-异丁烯共聚物(例如，聚异丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物，如聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)三嵌段共聚物或sibs(它们描述于例如授予pinchuk等人的美国专利第6,545,097中)；离子聚合物；聚酯类，包括聚对苯二甲酸乙二醇酯和脂肪族聚酯类(如丙交酯的均聚物和共聚物(它们包括右旋、左旋和内消旋丙交酯)(例如，聚(l-丙交酯)和聚(d,l-丙交酯)、乙交酯(乙醇酸)、和ε-己内酯(包括丙交酯-乙交酯共聚物，如聚(l-丙交酯-乙交酯)共聚物和聚(d,l-丙交酯-乙交酯)共聚物；聚碳酸酯类，包括三亚甲基碳酸酯(及其烷基衍生物)；聚酸酐类；聚原酸酯类；聚醚均聚物和共聚物，包括聚氧化烯聚合物，如聚氧化乙烯(peo)和聚醚醚酮类；聚烯烃均聚物和共聚物，包括聚烯烃，如聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯类(如聚丁烯和聚异丁烯)、聚烯烃弹性体(例如，山都平(一种热塑性橡胶))和乙烯
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丙烯二烯单体(epdm)橡胶；氟化均聚物和共聚物，包括聚四氟乙烯(ptfe)、聚(四氟乙烯-六氟丙烯)共聚物(fep)、改性乙烯-四氟乙烯共聚物(etfe)和聚偏二氟乙烯(pvdf)；聚硅氧烷均聚物和共聚物，包括聚二甲基硅氧烷；聚氨酯类；生物聚合物，如多肽类、蛋白质类、多糖类、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、弹性蛋白、壳聚糖、明胶、淀粉；和糖胺聚糖类，如透明质酸；以及上述的共混物和其他共聚物。
69.本公开中使用的生物稳定聚合物的示例也可选自例如含有一种或多种烯类单体的均聚物和共聚物，该烯类单体包括氟化烯类单体、丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸酯单体、乙烯基单体、二烷基硅氧烷单体及其组合、以及各种其他聚合物(包括聚氨酯类、聚脲类、聚酰
胺类(包括尼龙)、聚碳酸酯类、聚酯类、聚(醚酮)(peek)、和聚芳基醚酮(paek))。
70.本公开中使用的生物可吸收聚合物的示例也可选自生物可降解的聚酯均聚物和共聚物、聚原酸酯均聚物和共聚物、聚酸酐均聚物和共聚物、基于氨基酸的均聚物和共聚物(包括基于酪氨酸的聚合物)、及聚乙二醇均聚物和共聚物。
71.膜活性剂可通过扩散、溶解、生物降解(包括任何类型的化学反应(如水解(经由共价键)或键的酶解、离子化和去离子化、或者任何前述的组合而从可植入组合物中被释放。
72.膜活性剂可以以突释方式(曲线，profile)(例如，在0至6小时的时间段内)、缓释方式(曲线，profile)(例如，在6小时至3个月范围内的时间段中)、脉冲释放特性、双相或多相释放特性、或者前述的组合而从可植入组合物中被释放。
73.膜活性剂可通过可触发释放机制从可植入组合物中被释放，例如由于电脉冲(例如，将可植入组合物加热，有或者没有相应的相变，通过电迁移等从可植入组合物中驱动膜活性剂)、超声(例如，其可以用于将可植入组合物加热或者使含有膜活性剂的胶囊爆裂由此释放膜活性剂，等)、磁场变化(例如，可在植入组合物中提供磁性颗粒并振动以释放膜活性剂，例如通过将可植入组合物加热、通过使含有膜活性剂的胶囊爆裂，等)、化学实体的注入(例如，酸或碱、低渗或高渗盐，这破坏在膜活性剂与可植入组合物之间的键合从而导致膜活性剂等的释放)、热激发以改变扩散动力学或膜运输、使化学键减弱和调整释放、或者上述的组合。
74.膜活性剂释放可植入组合物可采用例如膜活性剂释放颗粒的形式。这种颗粒可形成各种形状，包括球形和细长形状。这种颗粒的最大截面尺寸(例如，球体的直径)可在10nm至10mm的范围内。
75.膜活性剂释放可植入组合物可采用例如膜活性剂释放支撑体的形式。这种支撑体可变成各种形式，包括圆盘、杆、支架、线圈、基准标记物、编织网、和管。这种支撑体可含有尺寸在0.1nm至1mm范围内的孔，或者可以根本不是多孔的。
76.可利用任何合适的植入方法将膜活性剂释放可植入组合物植入靶组织中，该植入方法包括可植入组合物的经皮放置、将可植入组合物放置在一个或多个天然体腔中或者与一个或多个天然体腔相邻的位置(例如，血管，包括远侧毛细管或多血管病变)以将血液流动、胃肠道、胆管、淋巴管、尿路、或其他体腔栓塞)、或者其组合。可利用维持开放内腔的装置(如导管、内窥镜、微导管、针、或其他柔性探针)将一个或多个可植入组合物放置在天然体腔中或者与天然体腔相邻的位置。
77.如前所述，在本公开的各种方面中描述了对组织体积进行治疗的方法，包括(a)将膜活性剂释放可植入组合物施用至靶部位，使得膜活性剂被局部地释放到组织体积；及(b)在组织体积上执行不可逆电穿孔。
78.在一些实施方案中，可将可植入组合物施用至靶部位并且可在相同的过程中在组织体积上执行不可逆电穿孔。例如，可将植入组合物施用至靶部位，并且在允许充分时间发生从可植入组合物进入组织体积的突释之后可在该组织体积上执行不可逆电穿孔(例如，在30秒至180分钟的范围内)。
79.在一些实施方案中，在其中将可植入组合物施用至靶部位的过程之后，可在一个或多个过程中在组织体积上执行不可逆电穿孔。例如(例如，其中可植入组合物是缓释组合物)，在将可植入组合物施用至靶部位之后，可在0.1 天至6周范围内的时间点执行一个或
多个随后的过程。
80.如从前述中可见，本公开的组合物和方法的优点是能够建立膜活性剂释放的大体上任何期望的时间过程以及大体上任何期望的大体上不可逆电穿孔 (ire)方案(其可以基于肿瘤生物学进行调整)。实施例
81.材料.罗斯威尔公园纪念研究所(roswell park institute,rpmi)1640培养基、胎牛血清(fbs)、青霉素-链霉素(10,000u/ml；10,000pg/ml)、杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)、mtt(3-(4,5-二甲基三唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)(mtt)、二甲基亚砜(dmso)、乙醇(200标准酒精度)、alexa fluor 488nhs酯是从thermo fisher scientific公司(沃尔瑟姆，马塞诸塞州，美国) 购得。盐酸羟胺和pd-10去盐柱(葡聚糖凝胶g-25培养基；排除限：m
r 5000) 是从millipore sigma公司购得(伯灵顿，马塞诸塞州，美国)。电穿孔比色皿 (间隙为4mm)是从harvard apparatus公司(霍利斯顿，马塞诸塞州，美国) 购得。紫外透明比色皿(半微量，1.5ml)是从美国科学(usa scientific)公司购得(奥卡拉，佛罗里达州，美国)购得。
82.药物协同作用的compusyn建模.各联合治疗的联合指数(ci)和剂量减少指数(dri)是通过chou-talalay法用compusyn软件程序进行计算 (combosyn公司，帕拉默斯，新泽西州，美国)(chou，t.-c.“药物联合研究中协同作用和拮抗作用的理论基础、试验设计、和计算模拟《药理学评论 (pharmacol.rev.)》58,621-681(2006))。ci值是药物相互作用的无量纲量化，ci＝1表明相加作用；ci《1表明协同作用；ci》1表明是拮抗作用。dri 是与各单独药物的剂量相比如果在给定fa下联合使用则可以减少各药物的剂量多少的测量尺度，dri＝1表明无剂量减少；dri》1表明有利的剂量减少， dri《1表明不利的剂量减少。
83.统计分析.用于多重比较的方差分析和图凯hsd检验是用来确定在不同治疗组之间细胞存活率的差异的显著性。用于多重比较的方差分析和图凯hsd 检验是用来确定在涂覆微球上pahm的荧光强度的差异的显著性。用两相指数关联模型拟合了pahm释放特性。所有分析均是使用graphpad棱镜(版本 9.0.0)(graphpad软件公司，圣迭戈，加尼福尼亚州，美国)而执行。实施例1.聚(甲基丙烯酸6-氨基己基酯)(pahm)合成
84.以如下方式合成聚(甲基丙烯酸6-氨基己基酯)(pahm)：甲基丙烯酸n
‑ꢀ
(叔丁氧基羰基)氨基己基酯(tbocahm)首先以zhu,c.等人的“通过可逆加成
‑ꢀ
断裂链转移(raft)聚合、dna缩合、和体外基因转染的含有伯和叔氨基侧基的阳离子甲基丙烯酸酯共聚物的受控制合成”j.polym.sci.part a polym. chem(2010).doi:10.1002/pola.24064中所描述的方式合成。然后，通过tbocahm 的原子转移自由基聚合(atrp)接着基于由ji,w.等人“具有用于dna疫苗递送至树突状细胞的界线明确的链长度的聚(甲基丙烯酸2-氨基乙酯)”《生物大分子(biomacromolecules)》12,4373-4385(2011)所报告方法进行tboc侧链的去保护而合成pahm。。利用如ji,w.的“带用于dna疫苗递送和癌症治疗的规整结构的合成聚合物”明尼苏达大学博士学位论文，2013年11月中所描述的1h nmr和凝胶渗透色谱法(gpc)对聚合物进行表征。pahm具有2.08
×
104的数量平均分子量(mn)、1.26的分散度(d)、和100的平均聚合度(dp)。实施例2.微球形成
85.通过将珠粒在溶解于乙醇的pahm中进行培养，接着将乙醇蒸发，而将未水解的聚
(丙烯酸甲酯)(pmma)珠粒(直径为90～106μm)用膜活性剂(具体地聚(甲基丙烯酸6-氨基己基酯)(pahm)进行涂覆，其中n为整数，如下面更详细描述。实施例3.pahm的荧光标记
86.按照制造商的规程，将pahm用alexa fluro 488染料(thermo fisherscientific公司)的nhs酯进行荧光标记(λ
ex
/λ
em
：494/517nm；消光系数＝71,000 cm-1
m-1
)。基于供给比和25～33％标记效率，理论的标记程度为1％(根据制造商)。通过凝胶过滤法用pd-10去盐柱(葡聚糖凝胶g-25培养基；排除限： m
r 5000)(millipore sigma公司)除去未反应的染料。将经纯化的荧光标记 pahm溶液在-80℃下冷冻一夜并且在装备有maxima
tm c plus真空泵(型号 m8c，themo fisher scientific公司，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)的冷冻干燥系统(labconco，堪萨斯城，密苏里州)中在0.020mbar压力下冷冻干燥4天。在室温下，将经干燥的聚合物存放于真空干燥器中(避光)直至使用。实施例4.用pahm将微球涂覆的方法的优化
87.具有71μm或100μm平均直径的聚甲基丙烯酸甲酯微球是由波士顿科学公司(梅普尔格罗夫，明尼苏达州，美国)提供。通过溶剂蒸发法，将pmma 微球用pahm进行涂覆。以0.1mg/ml或0.5mg/ml的总浓度将荧光标记的 pahm与未标记的pahm(标记:未标记＝1:8比率)的混合物溶解于乙醇 (thermo fisher scientific公司)。在玻璃小瓶中，将1ml pahm溶液加至50 mg聚甲基丙烯酸甲酯微球(直径为100μm)。将未覆盖的玻璃小瓶在轨道摇床上(lab-line instruments公司，梅尔罗斯公园，伊利诺伊州，美国)在室温下放置3天，以使乙醇蒸发。根据供给比，在干燥后，以2μg/mg或10μg/mg (μg pahm/mg pmma)的浓度将微球用pahm进行涂覆。在室温下将经涂覆微球存放于真空干燥器中(避光)直至使用。
88.为了优化并加速涂覆过程，利用三种不同的溶剂蒸发法将pmma用 pahm进行涂覆。以0.8mg/ml的总浓度将荧光标记与未标记的pahm的混合物(标记：未标记＝1:8的比率)溶解于乙醇。在玻璃小瓶中将5ml pahm 溶液加入到100mg pmma微球(直径为100pm)中。就涂覆方法1而言，以如上所述的方式使乙醇蒸发(在缓慢旋转的的轨道摇床上3天)。就涂层方法 2而言，将未覆盖的玻璃小瓶在真空干燥器内部在缓慢旋转的轨道摇床的顶部上放置12小时。就涂覆方法3而言，用压缩空气使乙醇蒸发10分钟。在室温下将经涂覆微球存放于真空干燥器中(避光)直至使用。
89.为了使pahm涂层可视化，用装备有olympus dp72照相机和x-cite 120 宽场荧光显微镜激发光源(excelitas technologies公司，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)的olympus ix70倒置荧光显微镜，获得经涂覆微球的荧光图像和明场图像。使用480
±
50nm的激发波长和535
±
50nm的发射波长使荧光标记的pahm 可视化。使用imagej(一种开放源)、在用于化学和计算仪器的国家卫生和实验室研究所开发的基于java的图像处理程序(loci，威斯康辛州大学)对在各个涂覆微球上的pahm的荧光强度进行了定量。
90.通过溶剂蒸发法用荧光标记pahm对栓塞微球(直径为100pm)进行了涂覆。代表性的荧光显微照片(图1a)表明提高pahm的浓度形成更厚的涂层，因为用10μg/mg(μg pahm/mg pmma)涂覆的微球与用2μg/mg(μgpahm/mg pmma)涂覆的微球相比显示10.5倍的更明亮荧光(图1b)。
91.为了优化涂覆过程，通过三种不同的溶剂蒸发法，用4μg/mg(μgpahm/mg pmma)荧光标记的pahm将栓塞微球(直径为100μm)进行涂覆。图1c中示出了用三种方法涂覆的微球的代表性荧光显微照片并且在图1d 示出了荧光强度的量化。在方法3中，在10分钟内使乙醇快速地蒸发，这形成明亮的、相对均匀的涂层(图1c)。在方法2中，在12小时中较慢的乙醇蒸发似乎稍微增加涂覆于微球上的pahm的量，如由与方法3相比1.2倍更亮的荧光所反映(图1d)。然而，还表明在方法3中蒸发至第3天形成暗淡得多的涂层(图1c、图1d)。我们选择采用方法3来涂覆用于所有后继试验的微球，因为该方法快速同时仍然形成良好的涂层。
92.所有后继试验(pahm释放动力学和细胞毒性测试)使用了用未标记 pahm以10μg/mg(μg pahm/mg pmma)浓度涂覆的微球。将pahm以1 mg/ml的浓度溶解于乙醇。在玻璃小瓶中，将1ml pahm溶液加入到100mg 微球(71μm或100μm)中。利用如上所述的方法1使乙醇蒸发。实施例5.来自经涂覆微球的体外释放动力学
93.在12孔培养板中，将25mg经涂覆微球(直径为71μm或100μm)悬浮于1ml细胞培养基(不含酚红)中并且在增湿的环境中在37℃下用5％ co2培养达1周。在特定的时间点，对750μl的上清液进行取样并且用新鲜培养基进行更换。然后，在uv透明比色皿(半微量，1.5ml)(美国scientific公司，奥卡拉，佛罗里达州，美国)中，用0.75ml释放培养基(最终体积：1.5 ml)将取样的上清液加以稀释。通过使用cary 100紫外可见光分光光度计 (agilent technologies公司，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)测量在245nm 处的吸光度，测量在上清液中pahm的量。图2a和图2b图解说明了在细胞培养基中pahm的量化。图2a示出了不同pahm浓度的紫外可见光吸收光谱。图2b示出了在245nm处的吸光度相对于pahm浓度的校准曲线。
94.释放动力学特性被表示为随时间推移而释放的累计百分并且在图3中进行图示说明。在前4小时内的初始突释之后，在1周的过程中pahm的缓释继续。与100μm相比，pahm略微更快地从71μm pmma微球中被释放。在第一小时内，51％和38％的pahm从71μm和100μm pmma微球中被释放。 4小时后，69％和59％的pahm从71μm和100μm pmma微球中被释放。在第2天和第7天之间，超过20％的pahm从这两种尺寸的微球中被释放。实施例6.细胞培养
95.人胰腺癌细胞系aspc-1是从atcc获得。将aspc-1细胞在由含有2 g/l葡萄糖、2mm l-谷氨酰胺、2g/l碳酸氢钠、10％热灭活胎牛血清(fbs) (thermo fisher scientific公司)、100u/ml青霉素(thermo fisher scientific 公司)、和100μg/ml链霉素(thermo fisher scientific公司)的罗斯威尔公园纪念研究所(rpmi)1640培养基(thermo fisher scientific公司，沃尔瑟姆，马塞诸塞州，美国)所组成的培养基中进行培养。将aspc-1细胞在组织培养瓶中进行培养，并且在增湿环境中在37℃下用5％ co2进行培养。当细胞达到～80％融合时除去培养基，采集细胞并分离1:3至1:6，以继续培养或立即使用用于细胞毒性试验。实施例7.结合无pahm或从经涂覆微球中释放的pahm的不可逆电穿孔的细胞毒性
96.将所采集的细胞进行离心，并丢弃上清液。将细胞团再悬浮于细胞培养基中(不含酚红)，稀释到675,000细胞/ml的密度，并将1ml等分样品分配入2ml微量离心管中。
97.在细胞培养基中将游离的pahm溶解到250μg/ml的初始浓度并稀释到不同的浓度。向1ml细胞悬液中加入0.5ml pahm稀释物，以提供0～50 μg/ml的最终浓度。将经涂覆微球(直径为71或100μm)和未经涂覆微球在细胞培养基中悬浮至25mg/ml的初始浓度并稀释到不同浓度。向1ml细胞悬液中加入0.5ml经涂覆微球稀释物，以提供0～5mg/ml的最终浓度(对应于0～50μg/ml微球涂覆pahm)。
98.在15分钟培养后，以如shao,q.等人“对胰腺癌的不可逆电穿孔的物理与化学增强及自适应抵抗”ann.biomed.eng.46,25-36(2018)中所描述的方式用不可逆电穿孔对细胞进行了处理。简略地，用移液管将400μl所制备的细胞悬液移液至在两个铝板电极之间(间隔4mm)的电穿孔比色皿(btx45-0126，哈佛仪器公司，霍利斯顿，马塞诸塞州)中。将该比色皿置于由电脉冲发生器所产生的外电场中(btx ecm方波电穿孔系统，btx型号830，哈佛仪器公司，霍利斯顿，马塞诸塞州，美国)，该电脉冲发生器以150、225、300、375、或450v(对应于375、562.5、750、937.5、或1125v/cm的电场强度)输出了 50个电脉冲(100μs脉冲持续时间，1hz频率)。
99.就15分钟暴露时间样品而言，将400μl经处理细胞悬液转移至微量离心管，离心，并舍弃上清液。用1ml杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)(thermofisher scientific公司)将pahm从细胞中清洗掉(两次)。使细胞团再悬浮于 1ml细胞培养基中并且在12孔培养板中(180,000细胞/孔)进行覆盖。就4 小时和24小时暴露时间样品而言，将400μl经处理细胞悬液铺于12孔培养板中(180,000细胞/孔)并添加600μl游离pahm或经涂覆微球稀释物以维持适当的pahm剂量。在增湿环境中在37℃下用5％ co2细胞培养4小时或 24小时之后，用1ml dpbs清洗(两次)并提供1ml新鲜细胞培养基。
100.使用mtt(3-(4,5-二甲基-三唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)(thermo fisherscientific公司)检测(mosmann,t.“用于细胞生长和存活的快速比色测定：适用于增殖和细胞毒性测定”j.immunol.method 65,55-63(1983))对细胞存活率进行了评价。向各孔中，加入100μl mtt溶液(5mg/ml，溶解于dpbs)。在增湿环境中在37℃下用5％ co2进行4小时培养后，从各孔中除去850μl 培养基。将甲臜晶体溶解于1ml dmso(thermo fisher scientific公司)并在 540nm处使用biotek cytation 3细胞成像多模式的读数仪(biotek instruments 公司，威努斯基，弗吉尼亚州)测量吸光度。通过用未处理细胞的吸光度进行归一化(具有相同的暴露时间)而确定细胞存活率。
101.图4a-图4b中示出了在暴露于不可逆电穿孔(ire)或pahm之后aspc
‑ꢀ
1细胞的存活率。在单独的不可逆电穿孔之后较高的电场强度导致较低的细胞存活率，然而细胞存活率的降低是相对地适中(图4a)。就暴露于750v/cm 和以下的细胞而言，超过70％的细胞仍然存活。在15分钟、4小时、24小时的时间点，甚至最高的电场强度(1125v/cm)仅杀伤46％、50％、和68％的细胞。相反，单独的pahm具有多得多的显著细胞杀伤作用(图4b)。就以》25 μg/ml剂量用pahm进行处理的细胞而言，当连续地暴露于pahm达15分钟、4小时、和24小时时，大于45％、90％和85％的细胞被杀伤。当用40μg/ml 或50μg/ml pahm处理达24小时时，100％的细胞被杀伤。
102.不可逆电穿孔的细胞杀伤作用被发现具有小的时间依赖性，因为在不可逆电穿孔
处理后培养细胞达4小时或24小时似乎并不影响细胞存活率(图4a)。仅当暴露于1125v/cm时，培养细胞达24小时导致较低的细胞存活率。与不可逆电穿孔相反，使用pahm的细胞杀伤取决于暴露时间。有趣的是，用pahm 处理细胞达4小时似乎导致与处理细胞24小时相比更低的细胞存活率。在《20 μg/ml的pahm剂量下，就4小时暴露时间而言存在细胞存活率的显著降低，但在24小时后细胞似乎以某种方式恢复。在》25μg/ml的pahm剂量下并未看见此恢复，因为就4小时和24小时暴露时间而言在细胞存活率中不存在统计学显著性差异。
103.为了对pahm增强不可逆电穿孔(ire)的细胞杀伤作用的能力进行评价，将两个电场强度与三个pahm剂量结合(图5a-图5c)。就所有暴露时间而言，将pahm与不可逆电穿孔进行组合导致显著地更多的细胞死亡。当仅用pahm处理细胞达15分钟时，就5μg/ml、15μg/ml、和25μg/ml pahm 而言(图5a)，暴露于562.5v/cm的细胞的存活率从95％下降至64％、48％、和33％。在对pahm暴露4小时的情况下，就5μg/ml、15μg/ml、和25μg/mlpahm(图5b)而言，暴露于562.5v/cm的细胞的存活率从86％下降至37％、 10％、和2％。类似于单独的pahm处理，就用不可逆电穿孔和pahm处理达 24小时的细胞而言，存在某种细胞存活率恢复；然而，就5μg/ml、15μg/ml、和25μg/mlpahm而言，暴露于562.5v/cm的细胞的存活率仍然从91％下降至72％、17％、和3％(图5c)。
104.为了对pahm增强不可逆电穿孔的效力的能力进行检查，而通过chou
‑ꢀ
talalay法用compusyn软件程序(combosyn公司，帕拉默斯，新泽西州)对用于不可逆电穿孔与pahm的各组合的联合指数(ci)和剂量减少指数(dri) 的进行了计算。在图5d中，将ci相对于部分影响(fa)、被不可逆电穿孔与游离pahm的特定组合所抑制的细胞生长的分数进行绘图。就15分钟pahm 暴露而言，不可逆电穿孔与游离pahm的联合似乎是略微拮抗的，因为大部分的ci大于1.12。在较长pahm暴露的情况下，ci倾向于在较高fa下降低。就4小时pahm暴露而言，与三个最高fa的组合似乎是协同的。就24小时 pahm暴露而言，与较低fa的组合显示轻微到适度的拮抗作用；然而，与较高fa的组合是近似相加的或者显示适度的协同作用。在图5e和图5f中示出了不可逆电穿孔电场强度的dri及pahm剂量。就所有三个暴露时间而言，不可逆电穿孔的dri往往会随着fa而增加，并且所有dri均大于1。这表明就与pahm的任意组合而言，较低的电场强度可以杀伤与单独的较高电场强度相等分数的细胞。就除了一个组合以外的所有组合而言，pahm的dri大于1，从而表明当组合使用时pahm剂量也可以减小。就15分钟和24小时暴露而言，dri往往会随着fa而降低；然而，就4小时暴露于pahm而言，dri 往往会随着fa而增加。
105.图6a-图6b中示出了在暴露于用10μg/mg(μg pahm/mg pmma)涂覆的微球(直径为71μm或100pm)之后aspc-1细胞的存活率。因为单独的 pmma微球(未涂覆)显示较小毒性至无毒性(图7)，所以所有细胞杀伤均归因于从经涂覆微球中释放的pahm。类似于游离pahm，对从71μm经涂覆微球中所释放的pahm的暴露时间对于细胞存活率具有显著的影响(图6a)。在暴露于71μm经涂覆微球15分钟之后仅导致适度的细胞杀伤，因为甚至最高剂量(50μg/ml微球涂覆pahm)仅杀伤47％的细胞。暴露于71μm经涂覆微球达4小时大大地降低细胞存活率。就》20μg/ml微球涂覆pahm而言，小于13％的细胞是存活的。在暴露于71μm经涂覆微球24小时之后细胞重新获得许多的它们的活力，类似于在15分钟暴露后所看到的存活率。仅就50 μg/ml微球涂覆的pahm而言，与15分钟暴露相比，24小时暴露杀伤统计学显著的更多细胞。就用100μg/ml经涂覆微球处理达15分钟或24小时的细胞而言，看到了类似的结果；然
而，4小时暴露并未导致几乎同样多的细胞毒性 (图6b)。甚至在50μg/ml微球涂覆pahm中，在暴露于100μm经涂覆微球4小时后，保留19％的细胞存活率。仅就》25μg/ml微球涂覆的pahm而言，与15分钟暴露相比，更长的暴露时间导致显著地更低的细胞存活率。实施例8.连同从经涂覆微球中所释放pahm的ire(不可逆电穿孔)的细胞毒性
106.由于在4小时和24小时暴露时间之间pahm的较慢释放和小得多的细胞存活率差异，因而选择100μm经涂覆微球来检查从经涂覆微球中所释放的pahm增强不可逆电穿孔的能力(图8a-图8f)。在15分钟特别是4小时之后，所释放的pahm确实增强不可逆电穿孔的细胞杀伤作用；然而，24 小时暴露时间并不显著地降低细胞存活率。就15分钟暴露而言，当添加经涂覆微球时，暴露于912.5v/cm的细胞的存活率从95％下降至40～54％；然而，在三个微球剂量之间，不存在统计学显著性差异(图8a)。在4小时暴露于 100μm经涂覆微球的情况下，看见了最可观的不可逆电穿孔增强，因为就5 μg/ml、15μg/ml、和25μg/ml微球涂覆的pahm(图8b)而言，暴露于562.5 v/cm的细胞的存活率从86％下降至65％、56％和19％。在24小时暴露之后，此增强很大程度地消失。当与单独的不可逆电穿孔进行比较时显著降低细胞存活率的仅有组合是562.5v/cm的电场强度与25μg/ml微球涂覆的pahm(图 8c)。此减少也是相对地适度，从单独不可逆电穿孔的91％到该组合的75％。
107.也计算出了不可逆电穿孔与经涂覆pmma微球的组合的ci和dri。如由图8d中的ci所示，在低fa下，将不可逆电穿孔与暴露于从经涂覆微球中释放的pahm达15分钟加以组合是强烈地拮抗的，但在中间fa下该组合变成协同。就4小时暴露而言，大部分的ci是在0.9～1.1范围内(或接近该范围)，这表明近似地相加作用。所有24小时暴露时间显示大于1.1的ci。在低fa下，这些组合是强烈地拮抗，但拮抗作用往往会随着fa而降低。在图11e 和图11f中示出了不可逆电穿孔电场强度的dri及微球涂覆pahm剂量。就所有三种暴露时间而言并且就fa》0.1而言，不可逆电穿孔的dri往往会随着 fa而增大，不可逆电穿孔的dri均全部大于1。就15分钟和24小时暴露时间而言，微球涂覆的pahm的dri往往会随着fa而增大，但就4小时暴露时间而言随着fa而减小。就fa》0.2而言，微球涂覆pahm的dri大于1。