一种裸藻蛋白提取液在婴儿尿布疹和湿疹中的用途的制作方法

1.本发明涉及护肤品领域，特别是涉及一种裸藻蛋白提取液在婴儿尿布疹和湿疹中的用途；


背景技术：

2.近年来，以海带、海蕴、裙带菜为代表的海藻类，黄金藻类为代表的微藻类，以这些海藻为原料的健康食品在日本市场越来越受到人们的欢迎，在细藻类市场，裸藻的市场增势显著，市场规模大约有100亿日元；
3.近几年，微藻市场出现了一种名为
″
裸藻
″
的产品，并被开发应用为保健食品。这种藻即为小眼虫(纤细裸藻)，小眼虫细胞中生物活性物质种类丰富，如β-胡萝卜素，维生素c、维生素e、β-1，3-葡聚糖和pufa等，并可作为单细胞蛋白的来源。例如：β-13-葡聚糖一直被认为能起到免疫应答调节物质的作用，对人体具有增强免疫的功效。
4.多项研究发现，此物质具有抗癌、抵抗细菌感染、激活巨噬细胞，诱导细胞因子分泌、促进造血、抗辐射、治疗烧伤、促进伤口愈合、降血脂、抗氧化等作用，而其衍生物(如硫酸化)甚至具有抗hiv病毒的功效。
5.裸藻门(euglenophyta)下仅一个裸藻纲，下辖裸藻目和柄裸藻目，共四个科(裸藻科、变胞藻科、袋鞭藻科、柄裸藻科)，约包含了40多个属1000多个种，多数种类为淡水种，通常大量的生存在平静的内陆水体。裸藻门下的眼虫属种如纤细裸藻(又名小眼虫，euglena gracils)作为生物学研究对象的历史非常悠久，可以说是目前研究最透彻的物种之一，列为实验生物学的模式种。例如：含副淀粉的纤细裸藻干粉已经通过美国fda的gras认证，在中国也于2013年5月通过了小眼虫的新资源食品认证。
6.然而，针对纤细裸藻在护肤品中的研究还并不是很多，产品类别也不是非常丰富。基于消费者对无毒无害纯天然护肤品的旺盛需求市场急需以裸藻提取液例如：裸藻蛋白为主要成分的护肤品问世。
7.幼儿湿疹(atopic dermatitis，ad)是一种常见的由多种内外因素引起的与变态反应有密切关系的炎症性皮肤疾病，好发于小婴儿，多发生于生后1～3个月，1岁半以后大多逐渐自愈，部分患儿延至儿童期，其中一部分发展为特应性皮炎。反复发作的皮肤损害、瘙痒和继发感染严重损害了婴儿生活质量。ivette a.g等人研究表明1990-2010世界范围内中国湿疹的发病率为2.5％左右，同时国内研究学者刘婕等人2008年通过临床流行病学统计了506名天津市婴幼儿其结果表明湿疹的发病率为75.7％。现已证实ad的病因既涉及环境因素又涉及内在因素，其发病机制主要包括四大方面：遗传因素(如flg，spink5，il-4/il-4r，gene z等)、th1/th2免疫失衡，皮肤屏障破坏(包括物理屏障、化学屏障、微生物屏障及免疫屏障)以及感染因素。这四大因素相互影响，构成复杂的网络共同参与ad的发病机制。婴幼儿湿疹组织学特征表现为表皮细胞间水肿，伴不同程度的棘层肥厚及浅表血管周围淋巴细胞浸润。由于表皮细胞间水肿，使细胞间隙增大，皮肤
″
砖墙结构
″
不稳定，破环了原有皮肤屏障，经皮水分流失增多；炎性细胞浸润，影响了皮肤正常代谢，脂质、天然保湿因
子及抗炎因子减少，皮肤变得干燥、脱屑，更易敏感；由于皮肤屏障受损，皮肤抵御外界刺激能力下降，易继发感染。因此重建皮肤屏障同时结合抗炎在湿疹治疗中至关重要。
8.目前针对于轻度ad国际上推荐的诊疗策略要以基础治疗保湿促进皮肤屏障功能修复、抗炎及消除刺激性因素为主，同时市售的婴幼儿ad护肤类产品的功效也集中在低敏、无刺激、皮肤修复及抗菌消炎等功效。因此筛选具有屏障修复功能的活性物对于ad的治疗是十分必要的。
9.尿布皮炎又称尿布疹，是发生在婴儿尿布覆盖区的接触性皮肤炎症，主要表现在尿布覆盖，部位的红斑、红疹的出现。流行病学研究结果表明，婴幼儿人群中尿布皮炎的发病率在7％～35％。其中住院婴儿及儿童的人群中，尿布皮炎的发病率高达17％～43％。虽然这种皮肤问题在婴儿群体中比较常见，但由于病情的反复，造成患儿疼痛、哭闹、睡眠不佳，若不及时防护，则容易引起细菌及真菌等病原微生物侵入，导致感染，严重影响患儿正常的成长和生活，同时给家长护理造成了很大的精神压力。尿布区的环境和尿布皮炎的发病密切相关。通常情况下，尿布区的环境表现为湿度过高，尿液、粪便残留，尿布对皮肤的摩擦等。已有研究表明，尿布区皮肤的il-1α的水平会显著高于非尿布区。粪便中的蛋白酶能够降解角质层的蛋白并引发炎症。此外，残留的尿液导致ph升高，会扰乱角质层脂质以及神经酰胺整体构成及功能。这些因素会造成皮肤的屏障缺损，造成皮肤的高渗透性，并引发刺激性皮肤炎症。尿布皮炎的诱发因素是综合的，其治疗方案也多种多样。治疗、防护主要围绕两个宗旨：1)促进损伤皮肤的修复；2)预防反复发作。由此可见，促进损伤皮肤的修复对尿布疹的治疗同样重要。
10.发明人经过多年的研究，意外的发现来源于纤细裸藻的活性蛋白提取液能够有效缓解幼儿湿疹和尿布疹，能够起到损伤修复皮肤的奇效，并且这种天然的成分无毒无副作用，特别适合用于婴幼儿使用。


技术实现要素：

11.本发明为解决上述问题，提供一种纤细裸藻的活性蛋白提取液及其在制备护肤品中的应用。
12.解决上述技术问题的具体技术方案如下：
13.根据第一方面，本发明提供一种裸藻蛋白的提取方法，具体而言：
14.1.一种裸藻蛋白的制备方法，其步骤包括：
15.1)细胞破碎：称取0.5g裸藻干粉，加入pbs混匀，超声波破碎15min；
16.2)细胞提取液：12000rpm4℃离心20min，移取上清液至离心管中备用；
17.3)蛋白盐析：往细胞提取液中缓慢加入硫酸铵固体，不断搅拌溶解，直至硫酸铵浓度达到60％，室温继续搅拌1小时，然后放入4度冰箱静置过夜；
18.4)蛋白纯化：将已析出蛋白的溶液4000rpm离心20min，弃去上清液，保留沉淀备用。用适量pbs溶液溶解蛋白沉淀，加入到100d的透析袋中，去离子水中透析至溶液中无硫酸铵为止；
19.5).除菌：将透析纯化的蛋白用0.22μm滤头过滤，收集滤液即为无菌裸藻蛋白提取液。
20.根据另一方面，本发明涉及上述裸藻蛋白在用于制备护肤品中的用途。
21.根据另一方面，本发明涉及上述裸藻蛋白在用于制备治疗幼儿湿疹药物/组合物/护肤品中的用途。
22.根据另一个方面，本发明涉及上述裸藻蛋白在用于制备治疗尿布疹药物/组合物/护肤品中的用途。
23.在一些实施例中，本发明涉及一种裸藻细胞培养液，其包括：0.02g/l kh2po4，0.6g/l蛋白胨，0.025g/l mgso4
·
7h2o，0.4g/l酵母提取膏，0.4g/l乙酸钠，0.5μg/l维生素b12，0.04g/l柠檬酸钾，0.4mg/l维生素素b1。
附图说明
图1：裸藻蛋白提取液凝胶电泳图图2：尿布疹皮肤模型组织活力检测结果图3：尿布疹皮肤模型组织形态检测结果图4：尿布疹皮肤模型屏障蛋白flg检测图图5：尿布疹皮肤模型屏障蛋白lor检测图图6：湿疹皮肤模型组织活力检测结果图7：湿疹皮肤模型组织形态检测结果图8：湿疹皮肤模型屏障相关蛋白flg检测图图9：湿疹皮肤模型屏障相关蛋白lor检测图
实施例
24.实施例1：纤细裸藻的培养藻种：纤细裸藻(购买自中国科学院淡水藻种库，编号fachb-848)基本培养条件：光照3000lux(勒克斯)，温度25
±
2℃，培养基hut(以下为培养基最终浓度配方，ph＝6.4)：编号组分用量母液浓度1kh2po41ml20g/l2蛋白胨0.6g/l-3mgso4·
7h2o1ml25g/l4酵母抽提液0.4g/l-5乙酸钠0.4g/l-6维生素b121ml0.5mg/l7柠檬酸钾1ml40g/l8维生素b11ml0.4g/l
25.培养方式：兼养培养。取适量纯培养纤细裸藻溶液，在无菌条件下，将其接种到500ml灭菌培养液中静置培养，每天摇动溶液三次，使其均匀分散。其中，灭菌培养液成分包括0.02g/l kh2po4，0.6g/l蛋白胨，0.025g/l mgso4·
7h2o，0.4g/l酵母提取膏，0.4g/l乙酸钠，0.5μg/l维生素b12，0.04g/l柠檬酸钾，0.4mg/l维生素b1。
26.配制过程：根据hut培养液配方，称取不同成分的固体粉末，溶解于去离子水中，分别配制1000倍浓度的母液，常温放置备用。将适量去离子水加入到1l容积的容量瓶内，同时
分别加入1ml各个成分的母液，定容至1l，摇匀后将自制培养液导入试剂瓶内，121℃灭菌20min，获得灭菌培养液。实施例2：裸藻蛋白提取工艺
27.1.细胞破碎：称取0.5g裸藻干粉，加入30ml pbs混匀，超声波破碎15min(2s on，4s off，功率60％)；
28.2.细胞提取液：12000rpm 4℃离心20min，移取上清液至离心管中备用；
29.3.蛋白盐析：往细胞提取液中缓慢加入硫酸铵固体，不断搅拌溶解，直至硫酸铵浓度达到60％，室温继续搅拌1小时，然后放入4度冰箱静置过夜；
30.4.蛋白纯化：将已析出蛋白的溶液4000rpm离心20min，弃去上清液，保留沉淀备用。用适量pbs溶液溶解蛋白沉淀，加入到100d的透析袋中，去离子水中透析至溶液中无硫酸铵为止。5.除菌：将透析纯化的蛋白用0.22μm滤头过滤，收集滤液即为无菌裸藻蛋白提取液。裸藻蛋白提取液采用的常规的sds-page，具体结果参见图1，结果显示，裸藻蛋白的大小在63-75kda之间。实施例3：裸藻蛋白提取液针对湿疹和尿布疹的功效
31.实验设计思路：1.为了模仿湿疹发生过程中的表皮的响应，即在体外皮肤模型(例如：)生发过程中添加刺激因子(polyi：c与lps)，制备组织活力及屏障功能受损，并且释放tslp的3d皮肤模型，模拟类湿疹ad的皮肤病理状态，通过检测屏障指数、组织形态、炎症因子以及相关蛋白表达评估活性物原料对湿疹的抗炎及屏障修复能力提升的功效；2.以屏障弱化的表皮模型为研究对象，采用sls刺激表皮模型建立尿布疹模型，通过检测屏障指数、组织形态、炎症因子以及相关蛋白表达评估活性物原料对于尿布疹的修复功效。
32.本测试所用皮肤模型为3d表皮皮肤模型(以下简称皮肤模型)，批号为：es201101，es201102，由广东博溪生物科技有限公司生产提供。
33.试剂与设备kc2500(广东博溪)、mtt(sigma)、dmso(sigma)、磷酸盐缓冲液(索莱宝)、epigrowth培养液(广东博溪生物)、磷酸盐缓冲液(索莱宝)、mtt(sigma)、异丙醇(国药)、il-1αelisa试剂盒(abcam)、polyi：c(sigma)、脂多糖(e.coli.sigma)、tslp elisa试剂盒(博士德)、4％多聚甲醛(biosharp)、二甲苯(国药)、无水乙醇(国药)、苏木精(碧云天)、伊红(碧云天)、盐酸(国药)、50
×
柠檬酸钠(西安赫特生物)、anti-flg抗体(abcam)、anti-lor抗体(abcam)、abc-peroxidase kits(vectastain)、anti-mouse-488(山羊抗鼠)(abcam)、抗淬灭剂(碧云天)、hochest33342(碧云天)；co2培养箱(thermo，150i)、超净工作台(苏州安泰，sw-cj-1f)、荧光显微镜(leica)、微量振荡器(其林贝尔)、酶标仪(biotek，epoch)。3.1裸藻蛋白提取液针对尿布疹的功效测试用液配置1)mtt工作液配置
34.用pbs配制5mg/ml的mtt储存液，然后将其储存在-20℃(保存时间不超过1个月)。使用前，用pbs溶液将储存液稀释至1mg/ml，4℃下避光备用(备用时间不超过2h)。
35.2)0.4％sls母液配置
36.称取0.024g sls溶于6ml pbs溶液中，0.22μm过滤，配制成0.4％sls母液，备用。将0.4％sls溶液稀释2倍，配制成0.2％sls工作液。
37.3)阳性对照组(0.01％地塞米松)工作液配置
38.用1ml dmso溶解100mg地塞米松配置成浓度为100mg/ml母液；pbs稀释1000倍，配置成0.01％地塞米松，备用。
39.2)给药步骤
40.1.将3d模型转移到6孔板中(提前添加0.9ml模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。
41.2.取配置好的药物溶液25μl加于模型表面，轻轻抖动模型，使样品均匀分布于模型表面，置于co2培养箱(37℃、5％co2、95％rh)中孵育24h。
42.3.孵育结束后，用装有无菌pbs溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。
43.组织活力检测
44.1)mtt孵育：将清洗后的模型，放入含有1mg/ml mtt工作液的24孔板中。随后将24孔板转移到co2培养箱中(37℃、5％co2、95％rh)孵育3h。
45.2)异丙醇浸提：mtt孵育结束后，用镊子取出模型，用吸水纸擦拭底面残留的mtt液体后，转移到新的24孔板中，加入2ml异丙醇，用封口膜密封24孔板，4℃静置过夜。
46.3)检测：浸提结束后，用200μl移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型中流出到24孔板中。丢弃被刺穿的模型，将每孔内的异丙醇浸提液吹打3次，充分混匀。混匀后，从每孔中吸取2份200μl异丙醇浸提液，分别加入96孔板的对应孔中，做好标记。酶标仪570nm波长读取吸光度值。
47.炎症因子检测
48.1)收集模型培养液：孵育结束后，收集模型培养液于ep管中，置于-80℃冰箱保存。
49.2)炎症因子含量的检测：根据il-1α的elisa检测试剂盒的操作说明书进行检测分析。
50.3)结果分析：应用graphpad prism program软件作图，各组间采用t-test统计分析，
＊
p＜0.05表示差异显著，
＊＊
p＜0.01表示差异极显著。
51.组织形态检测
52.将用于组织形态的模型用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，将模型环切取下，进行h&e染色处理，显微镜下拍照观察，采集图片。
53.免疫荧光检测
54.1)烤片脱蜡：石蜡切片置于70℃烤片机中，烤片4h。
55.2)脱蜡水化：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。pbs缓冲液清洗3次，每次5min。
56.3)抗原修复：将石蜡切片放入0.01m柠檬酸钠抗原修复溶液，采用高压修复，冷却后取出切片。pbs缓冲溶液清洗3次，5min/次。
57.4)阻断过氧化物酶：每张切片加1滴3％h2o2，室温下孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。pbs缓冲溶液清洗3次，5min/次。
58.5)血清封闭：滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min，无需冲洗。
59.6)一抗孵育：滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。pbs缓冲液清洗3次，5min/次。
60.7)二抗孵育：滴加二抗工作液，室温孵育1h。pbs缓冲液清洗3次，5min/次。
61.8)核染：二抗孵育结束后，pbs缓冲液清洗3次，5min/次。甩净玻片上附着的pbs溶液，每张切片滴加100μl的hochest33342工作液，室温孵育5min。
62.9)pbs缓冲液清洗3次，5min/次。用吸水纸擦去pbs溶液，用一滴抗淬灭剂封片；24h内荧光显微镜拍照(20
×
)。
63.根据实验结果表明(参见图2-图5)，裸藻蛋白提取液能显著提升3d皮肤-尿布疹模型的组织活力，对尿布疹具有抵御能力(图2)；还能够显著修复尿布疹造成的模型损伤(图3)，且能够明显提升紧密连接蛋白flg蛋白、lor蛋白的表达量，修复表面活性剂sls所造成的flg、lor蛋白缺失(图4、图5)。综上所述，上述结果证明，裸藻蛋白对于尿布疹具有较强的抵御及修复功能，具有极好的治疗效果。
[0064][0065]
3.2裸藻蛋白提取液针对湿疹的功效
[0066]
1)mtt工作液配置
[0067]
同3.1相关部分
[0068]
2)诱导工作液制备
[0069]
polyi：c与lps诱导工作液：取480μl 5mg/ml polyi：c母液和20μl 10mg/ml lps母液溶于100ml皮肤模型培养液中，使得polyi：c的终浓度为24μg/ml；lps的终浓度为20μg/ml。
[0070]
3)阳性对照组(0.01％地塞米松)工作液配置
[0071]
同3.1相关部分
[0072]
3.2给药步骤
[0073]
1)将3d模型转移到6孔板中(提前添加0.9ml模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。
[0074]
给药：取待测样品25μl加于模型表面，涂布均匀后置于co2培养箱(37℃、5％co2、95％rh)中孵育24h。
[0075]
3)诱导：给药孵育完成后，从培养箱中取出6孔板。采用无菌棉签轻轻擦拭模型表面。吸弃孔内剩余培养液，阴性对照、阳性对照以及样品组加入polyi：c与lps诱导工作液，空白对照组加入模型培养液。结束后将所有6孔板转移到co2培养箱(37℃、5％co2、95％rh)中孵育24h。
[0076]
3.3组织活力检测
[0077]
1)mtt孵育：将清洗后的模型，放入含有1mg/ml mtt工作液的24孔板中。随后将24孔板转移到co2培养箱中(37℃、5％co2、95％rh)孵育3h。
[0078]
2)异丙醇浸提：mtt孵育结束后，用镊子取出模型，用吸水纸擦拭底面残留的mtt液体后，转移到新的24孔板中，加入2ml异丙醇，用封口膜密封24孔板，4℃静置过夜。
[0079]
3)检测：浸提结束后，用200μl移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型中流出到24孔板中。丢弃被刺穿的模型，将每孔内的异丙醇浸提液吹打3次，充分混匀。混匀后，从每孔中吸取2份200μl异丙醇浸提液，分别加入96孔板的对应孔中，做好标记。酶标仪
570nm波长读取吸光度值。
[0080]
3.4炎症因子检测
[0081]
1)收样：诱导孵育24h结束后，收集模型培养液于ep管中，置于-80℃冰箱保存。
[0082]
2)检测：根据tslp elisa检测试剂盒的操作说明书进行检测分析。
[0083]
3)结果分析：应用graphpad prism program软件作图，各组间采用t-test统计分析，
＊
p＜0.05表示差异显著，
＊＊
p＜0.01表示差异极显著。
[0084]
3.5组织形态检测
[0085]
将用于组织形态的模型用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，将模型环切取下，进行h&e染色处理，显微镜下拍照观察，采集图片。
[0086]
3.6免疫荧光检测
[0087]
1)烤片脱蜡：石蜡切片置于70℃烤片机中，烤片4h。
[0088]
2)脱蜡水化：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。pbs缓冲液清洗3次，每次5min。
[0089]
3)抗原修复：将石蜡切片放入0.01m柠檬酸钠抗原修复溶液，采用高压修复，冷却后取出切片。pbs缓冲溶液清洗3次，5min/次。
[0090]
4)阻断过氧化物酶：每张切片加1滴3％h2o2，室温下孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。pbs缓冲溶液清洗3次，5min/次。
[0091]
5)血清封闭：滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min，无需冲洗。
[0092]
6)一抗孵育：滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。pbs缓冲液清洗3次，5min/次。
[0093]
7)二抗孵育：滴加二抗工作液，室温孵育1h。pbs缓冲液清洗3次，5min/次。
[0094]
8)核染：二抗孵育结束后，pbs缓冲液清洗3次，5min/次。甩净玻片上附着的pbs溶液，每张切片滴加100μl的hochest33342工作液，室温孵育5min。
[0095]
9)pbs缓冲液清洗3次，5min/次。用吸水纸擦去pbs溶液，用一滴抗淬灭剂封片。24h内荧光显微镜拍照(20
×
)。
[0096]
根据实验结果可得，裸藻蛋白能显著下调湿疹中的关键炎症因子tslp，起到抑制炎症的作用(图6)；此外，兼氧中性裸藻蛋白能够显著修复湿疹造成的模型损伤(图7)，且能够明显提升紧密连接蛋白flg蛋白、lor蛋白的表达量，修复表面活性剂sls所造成的flg、lor蛋白缺失(图8、图9)。综上所述，上述结果证明，裸藻蛋白对于幼儿湿疹和尿
[0097]
布疹具有较强的修复功能，虽然部分效果略逊于地塞米松这类糖皮质激素，然而地塞米松副作用比较大，长期使用或剂量使用失当会造成幼儿发育紊乱，生长受到抑制的严重后果。裸藻蛋白源自纯天然的藻类成分，无毒副作用，对皮肤比较温和，更适合幼儿使用，取得了预料不到的治疗和缓解幼儿湿疹和尿布疹的技术效果。