重组人生长激素-Fc融合蛋白注射液制剂配方的制作方法

重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方。


背景技术：

2.人生长激素(hgh)是一种肽类激素，它是由垂体中的生长激素细胞合成、存储和分泌的一种蛋白类激素。生长激素分子是由191个氨基酸残基构成，相对分子质量22124道尔顿，与其受体(hghr)在靶细胞表面结合，激活生物反应，促进动物和人的发育以及细胞的增殖。具有调节代谢、刺激蛋白质合成和加速脂肪代谢，促进骨骼和肌肉组织的生长发育等作用，是治疗儿童身材矮小的特效药物。儿童身高问题越来越被关注，改善身高需求也越来越大。引起儿童身材矮小的病因多达10余种，其中以生长激素缺乏(ghd)和特发性矮身材最常见。重组人生长激素(rhgh)主要用来治疗或缓解因生长激素(gh)分泌不足或缺乏而导致的儿童矮小症、组织修复、烧烫伤、成人生长激素缺乏(ghd)等。重组人生长激素-fc融合蛋白(rhgh-fc)是通过基因重组技术，将人生长激素和抗体fc域通过连接肽组合在一起形成同源二聚体，利用中国仓鼠卵巢细胞(cho)生产的重组人生长激素-fc融合蛋白。重组人生长激素-fc融合蛋白(rhgh-fc)n端生长激素的氨基酸含量及序列与人生长激素完全相同，具有与人体内源生长激素同等的作用；其c端为人igg亚型抗体fc域的突变体，可通过新生儿fc受体(fcrn)介导的再循环机制延长药物的半衰期，仅需每周或每两周注射一次，与重组人生长激素(rhgh) 疗效相同且注射频率更低，能显著提高患者用药依从性和总体治疗效果。 rhgh-fc不需要额外的化学修饰，安全隐患较低，表达量高，产品制备工艺稳定可靠，质量易于控制。
3.重组人生长激素是一种不稳定的大分子蛋白质，在水溶液中易产生氧化、脱酰胺、聚合等变化。目前已上市的重组人生长激素多采用冷冻干燥技术制备成粉针剂，需患者自行复溶注射，患者使用起来比较繁琐且存在污染的安全隐患。所以提出重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方，以解决背景技术中的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方，包括如下组分：
7.重组人生长激素-fc融合蛋白25-35mg/ml，l-组氨酸 1.24-1.86mg/ml，蔗糖30-60mg/ml，泊洛沙姆1880.5-3.0mg/ml，甘氨酸5.0-30.0mg/ml，余量为注射用水。
8.进一步地，重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂的ph值为 6.0-8.0。
9.进一步地，l-组氨酸与注射用水组成l-组氨酸缓冲液，以l-组氨酸缓冲液作为重组人生长激素-fc融合蛋白注射液的基础缓冲体系，重组人生长激素-fc融合蛋白更加稳
定。
10.进一步地，甘氨酸可以提高重组人生长激素-fc融合蛋白注射液在光照条件下的稳定性，在一定范围内重组人生长激素-fc融合蛋白浓度越低、 l-组氨酸缓冲液ph越高、蔗糖浓度越高，该制剂在光照条件下越稳定。
11.进一步地，重组人生长激素-fc融合蛋白27-33mg/ml，l-组氨酸 1.30-1.55mg/ml，蔗糖40-50mg/ml，泊洛沙姆1880.8-1.2mg/ml，甘氨酸9.6-14.4mg/ml，余量为注射用水。
12.进一步地，重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂的ph值为 6.3-7.3。
13.本发明的有益效果：
14.本发明重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制配方采用l-组氨酸缓冲液作为基础缓冲液，其中l-组氨酸为ph调节剂；蔗糖的作用为蛋白稳定剂和等渗调节剂；泊洛沙姆188的作用为增溶剂和表面活性剂；甘氨酸的作用为抗氧剂和ph调节剂；制备过程无需复杂的冻干工艺，重组人生长激素-fc融合蛋白在注射液制剂中的稳定性高，便于运输和储存；该注射液制剂中重组人生长激素-fc融合蛋白的含量和浓度确定，避免了复溶带来的浓度误差，便于精确给药，相比传统冻干制剂缓冲无需进行复溶注射，使用更加便利，安全性更高，具有重要的临床意义。
附图说明
15.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
16.图1是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(40℃-2w)等直线图；
17.图2是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(40℃-2w)主效应图；
18.图3是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(40℃-6w)等直线图；
19.图4是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(40℃-6w)主效应图；
20.图5是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(25℃-1m)等直线图；
21.图6是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(25℃-1m)主效应图；
22.图7是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(25℃-2m)等直线图；
23.图8是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(25℃-2m)主效应图；
24.图9是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(光照-5d)标准化效应的pareto图；
25.图10是本发明doe筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方关键影响因子的sec-hplc纯度(光照-5d)主效应图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液的基础缓冲液，包括如下步骤：
29.步骤1：选取8种常用的蛋白注射液用基础缓冲液(请参阅表1)，定义为8个实验组，每个实验组分别量取69.5ml(188.35mg)检定合格的重组人生长激素-fc融合蛋白并置于超滤浓缩管中进行浓缩，得到8个实验组样品；
30.表1
[0031][0032][0033]
步骤2：在步骤1中每个实验组样品中分次加入不同的基础缓冲液进行换液，换液体积为9
±
1倍体积；然后使用对应缓冲液将每个实验组样品浓度配制到30
±
5mg/ml，在无菌环境下经过0.22μm微孔滤膜过滤并分装，得到分装样品；
[0034]
步骤3：将步骤2中的分装样品分别在温度为40
±
2℃、湿度为60
±
5％rh 和反复冻融(-30
±
10℃，12h；25
±
2℃，12h；循环5次)的条件下考察其稳定性。记录重组人生长激素-fc融合蛋白注射液基础缓冲液筛选的 sec-hplc纯度结果和rp-hplc纯度结果，分别如表2和表3所示(单位：％)：
[0035]
表2
[0036][0037]
表3
[0038][0039][0040]
由表2可知，重组人生长激素-fc融合蛋白在组氨酸缓冲体系中的稳定性明显高于在磷酸盐缓冲液体系中的稳定性；由表3可知，在40
±
2℃(60
ꢀ±
5％rh)的条件下，重组人生长激素-fc融合蛋白在实验组6(10mm l-组氨酸缓冲液(ph6.5))中最稳定。
[0041]
实施例2
[0042]
通过doe实验设计的方法筛选重组人生长激素-fc融合蛋白注射液的关键影响因子，包括如下步骤：
[0043]
步骤1：以l-组氨酸缓冲液作为重组人生长激素-fc融合蛋白注射液的基础缓冲液，选择5个因子(蛋白浓度、缓冲体系ph、甘露醇浓度、蔗糖浓度和吐温80浓度)进行五因
子、两水平的doe部分的实验设计(分辨度为
ⅴ
)，共19组实验；按照表4中配制试验所需的缓冲液母液；
[0044]
表4
[0045][0046][0047]
步骤2：使用步骤1中的缓冲液母液并按照表5配制实验所需的基础缓冲液；
[0048]
表5
[0049][0050]
步骤3：使用步骤1中的缓冲液母液并按照表6配制实验所需的辅料浓缩液(4倍浓缩)；
[0051]
表6
[0052][0053][0054]
步骤4：使用步骤2中的缓冲液，按照表7实验需求量取检定合格的重组人生长激素-fc融合蛋白进行浓缩换液(tff)操作；
[0055]
表7
[0056][0057][0058]
步骤5：使用步骤2中的缓冲液、步骤3中的辅料浓缩液和步骤4中的浓缩液换液样品(tff1、tff2、tff3、tff4、tff5)，按照表8中物料配比制备重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂，完成配制后，在无菌环境下，将每个实验组样品分别用0.22μm滤膜过滤并分装；各实验组对应的制剂组分如表9所示；
[0059]
表8
[0060][0061]
表9
[0062][0063]
步骤6：将步骤5每个实验组分装的制剂分别置于40
±
2℃(60
±
5rh)、 25
±
2℃(60
±
5％rh)、光照(光照强度4500
±
500lx，5
±
3℃，紫外强度200hw) 条件下，以sec-hplc纯度作为响应，对实验结果进行分析。
[0064]
请参阅图1-图10，在加速实验条件下，重组人生长激素-fc融合蛋白注射液的蛋白浓度、缓冲液ph和蔗糖浓度对蛋白聚集/降解程度具有显著影响，在一定范围内，蛋白浓度越低、缓冲液ph越高、蔗糖浓度越高，样品越稳定。低蛋白浓度的重组人生长激素-fc融合蛋
白注射液在光照条件下更稳定。
[0065]
实施例3
[0066]
单变量实验方法优化重组人生长激素-fc融合蛋白注射液配方，包括如下步骤：
[0067]
步骤1：根据实施例1和实施例2的实验结果，本实验中8组实验均以 l-组氨酸缓冲液作为基础缓冲液，重组人生长激素-fc融合蛋白浓度均为 30mg/ml，蔗糖浓度均为50mg/ml，在此基础上通过改变吐温80浓度、泊洛沙姆188浓度和甘氨酸浓度，研究吐温80、泊洛沙姆188和甘氨酸对重组人生长激素-fc融合蛋白注射液稳定性的影响。
[0068]
按照表10配制单变量实验所需的溶液：
[0069]
表10
[0070][0071]
步骤2：使用步骤1中的溶液并按照表11的物料配比配制单变量实验所需的辅料浓缩液；
[0072]
表11
[0073][0074][0075]
步骤3：使用步骤1中的溶液和步骤2中的辅料浓缩液，每个实验组分别量取156mg
检定合格的重组人生长激素-fc融合蛋白原液，按照表12中物料配比制备重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂，完成配制后，在无菌环境下，将每个实验组样品分别用0.22μm滤膜过滤并分装；各实验组对应的制剂组分见表13；
[0076]
表12
[0077][0078][0079]
表13
[0080][0081]
步骤4：将步骤3每个实验组分装的制剂分别置于40
±
2℃(60
±
5％rh)、 25
±
2℃(60
±
5％rh)、5
±
3℃，反复冻融(-30
±
10℃放置12h，取出后25
ꢀ±
2℃放置12h，循环5次)、光照(光照强度4500
±
500lx，5
±
3℃，紫外强度200hw)、震荡(180rpm，5
±
3℃)等条件下，检
测其sec-hplc纯度和 rp-hplc纯度，实验结果见表14和表15。
[0082]
表14
[0083][0084][0085]
由表14可知，实施例3中所有实验组在25
±
2℃(60
±
5％rh)-3m、5
±ꢀ
3℃-6m，反复冻融-5t(5次)、和震荡-5d(180rpm，5
±
3℃)条件下sec-hplc 纯度均无明显衰减；光照-10d(光照强度4500
±
500lx，5
±
3℃，紫外强度 200hw)条件下的sec-hplc纯度结果显示，甘氨酸可以提高样品在光照条件下的稳定性，制剂中甘氨酸含量12mg/ml与25mg/ml对重组人生长激素-fc 融合蛋白在光照条件下的稳定性无明显差异。
[0086]
表15
[0087][0088]
由表15可知，实施例3中所有实验组在5
±
3℃-6m，反复冻融-5t、和震荡-5d(180rpm，5
±
3℃)条件下rp-hplc纯度均无明显衰减。
[0089]
根据上述实验结果确定该重组人生长激素-fc融合蛋白注射液制剂配方如下所示：
[0090]
重组人生长激素-fc融合蛋白25-35mg/ml，l-组氨酸1.24-1.86mg/ml，蔗糖30-60mg/ml，泊洛沙姆1880.5-3.0mg/ml，甘氨酸5.0-30.0mg/ml，余量为注射用水。
[0091]
需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0092]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。