松针提取物在制备CHO细胞培养液中的应用和CHO细胞培养方法与流程

松针提取物在制备cho细胞培养液中的应用和cho细胞培养方法
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及松针提取物在制备cho细胞培养液中的应用和cho细胞培养方法。


背景技术：

2.细胞工程在生物制药工业中占据重要地位，据统计，世界上50%的医药产品来自细胞工程制药，为新药开发提供了技术操作基础，在治疗免疫性疾病、提升治病疗效、创新医药品等方面都有广泛的应用。如今，生物制药与细胞工程已经紧密联系在一起，随着细胞工程技术在生物制药生产中的普遍应用，生物制药行业发展迅速，取得了巨大的经济效益。
3.重组蛋白类药物是指利用基因工程技术，改造“工程菌”或“工程细胞”，使其批量表达出人体功能蛋白或其突变体，用于弥补机体由于先天基因缺陷或后天疾病等造成的体内相应功能蛋白的缺失，主要包含多肽类激素、细胞因子、重组酶等多个细分领域。自20世纪80年代初首次批准重组胰岛素和人生长激素以来，多种重组蛋白治疗药物已投入使用，而重组蛋白治疗药物中有近70%是在中国仓鼠卵巢（cho）细胞中生产的。
4.体外细胞培养采用细胞工程技术表达重组蛋白治疗药物至关重要的一环，细胞培养基是体外细胞培养技术中为细胞营造的适合其生长的外环境，提供细胞生长和代谢过程中需要的各种物质和能量，并且直接影响其代谢产物的产量、质量和安全。目前已有研究证明细胞培养基和补充剂配方会影响细胞培养性能，特别是糖基化和电荷变体。
5.传统的细胞培养方式是在含有血清的培养基中贴壁生长，血清在给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质的同时，由于其所含成分复杂，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给动物细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。此外，细胞培养获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍。因此，无血清培养基和化学成分限定的无蛋白培养基已成为哺乳动物细胞培养技术的发展方向。
6.优化化学限定培养基（chemical difined medium,cdm）的配方可以提高cho细胞体外培养的培养性能以及细胞分泌的蛋白质质量。例如，灵芝体内本身含有十分丰富的生物活性成分，其中主要可分为多糖类、核苷类、三萜类、油脂类、甾醇类和矿质元素等10大类，其中研究较为广泛的主要功效成分有增强免疫功能的多糖和抗癌作用的三萜类物质，这些成分能够通过多种细胞代谢通路途径来发挥作用。研究表明，培养基中一定浓度的灵芝孢子粉与cho细胞的生长具有正相关关系。
7.然而，现有cho细胞培养基优化配方对提高细胞培养性能以及蛋白质质量作用有限，如何优化cho细胞培养基配方是提高cho细胞培养性能及其分泌蛋白的难点。


技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本技术的第一目的在于提供一种松针提取物在制备cho细胞培养液中的应用，以优化化学限定cho培养基配方，提高cho细胞培养性能和其分泌的蛋白
质量。
9.在其中一个实施例中，松针提取物包括松针乙醇提取物、松针水提取物以及松针多糖水提取物中的至少一种。
10.在其中一个实施例中，松针提取物的浓度为5mg/ml~1000mg/ml。
11.在其中一个实施例中，松针提取物为松针乙醇提取物、松针水提取物时，松针提取物的浓度为5mg/l~15mg/l。
12.在其中一个实施例中，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为50mg/l~1000mg/l。
13.本技术的第二目的在于提供一种cho细胞培养液，包括化学限定cho培养基，化学限定cho培养基含有上述应用使用的松针提取物。
14.在其中一个实施例中，松针提取物包括松针乙醇提取物、松针水提取物以及松针多糖水提取物中的至少一种。
15.在其中一个实施例中，松针提取物的浓度为5mg/ml~1000mg/ml。
16.在其中一个实施例中，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为5mg/l~15mg/l。
17.在其中一个实施例中，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为50mg/l~1000mg/l。
18.在其中一个实施例中，cho细胞培养液还包括第一补充剂和第二补充剂，第一补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的3.5%~4.5%，第二补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的0.35%~0.45%。
19.本技术的第三目的在于提供一种cho细胞培养方法，采用的cho细胞培养液对cho细胞进行细胞培养。
20.在其中一个实施例中，培养开始时将含有松针提取物的化学限定cho培养基和cho细胞混合进行细胞培养。
21.在其中一个实施例中，细胞培养为分批补料式培养。
22.在其中一个实施例中，分批补料式培养具体包括：在培养期间分批加入第一补充剂和第二补充剂，第一补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的3.5%~4.5%，第二补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的0.35%~0.45%。
23.在其中一个实施例中，分批补料式培养的时间为14-16天。
24.本技术创造性地采用松针提取物优化化学限定cho培养基，发现不同松针提取物在培养后期均会延缓cho细胞死亡，提高cho细胞活率；松针提取物能够减少单抗的酸性物种变体，增加了单抗的碱性物种变体，有利于抗体蛋白发挥功能和有效性；对于不同糖型的单抗糖基化产生了不同的影响，有利于控制蛋白质糖基化，以更好地靶向特定的寡糖结构；低浓度松针提取物会使单抗的ec50值有所增加，在一定程度内提高了药物的安全性。
附图说明
25.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本技术实施例1中pnwe对cho活细胞密度的影响结果；图2为本技术实施例1中pnee对cho活细胞密度的影响结果；图3为本技术实施例1中pnpwe对cho活细胞密度的影响结果；图4为本技术实施例1中pnwe对cho细胞活率的影响结果；图5为本技术实施例1中pnee对cho细胞活率的影响结果；图6为本技术实施例1中pnpwe对cho细胞活率的影响结果；图7为本技术实施例2中松针提取物对cho细胞产生的单抗的效价影响结果；图8为本技术实施例4中松针提取物对cho细胞产生的单抗的电荷变体影响结果；图9为本技术实施例5中松针提取物对cho细胞产生的单抗的其中五种糖基化影响结果；图10为本技术实施例5中松针提取物对cho细胞产生的单抗的另外五种糖基化的影响结果；图11为本技术实施例6中pnwe实验组的单抗样品活性分析四参数拟合回归曲线；图12为本技术实施例6中pnee实验组的单抗样品活性分析四参数回归曲线；图13为本技术实施例6中pnpwe实验组的单抗样品活性分析四参数回归曲线；图14为本技术实施例6中不同松针提取物对cho细胞产生的单抗的活性影响结果。
具体实施方式
27.现将详细地提供本技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本技术进行多种修改和变化而不背离本技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
28.因此，旨在本技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本技术更广阔的方面。
29.如上文，如何开发更多的优化培养基配方是提高cho细胞培养性能及其分泌的蛋白质量的难点。
30.为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本技术的第一方面提供了一种松针提取物在制备cho细胞培养液中的应用，以优化化学限定cho培养基配方，提高cho细胞培养性能和蛋白质量。
31.具体地，松针为松科松属植物的叶，别名松毛，主要来源为马尾松、华山松、黄山松、黑松、油松、红松等。松针是一种天然再生资源，是松树类植物的主要副产物之一，具有再生速度快、可一年四季采收、分布广泛、天然蓄积量大、可持续利用的优点。松针含有大量有活性的挥发性物质以及丰富营养成分，如氨基酸、萜类、挥发油、脱落酸、大量水溶性维生素b、糖、胡萝卜素、叶绿素、黄酮类物质、十多种微量元素、粗蛋白等，可通过使用水、乙醇等作为溶剂的相对简单的提取方法得到松针提取物。
32.化学限定培养基 (chemical defined medium,cdm)，也称为限定化学成分培养基，是指培养基中的所有成分都是明确的，不含有动物蛋白，不添加植物水解物，仅使用一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。
33.一些具体实施方案中，本技术的cho细胞培养液使用马尾松松针提取物作物添加物，以优化化学限定cho培养基的细胞培养性能和产出的蛋白质量。
34.一些具体实施方案中，松针提取物包括松针乙醇提取物、松针水提取物以及松针多糖水提取物中的至少一种。松针乙醇提取物是松针通过使用乙醇作为溶剂的提取方法得到的松针提取物。松针水提取物是松针通过使用水作为溶剂的提取方法得到的松针提取物。松针多糖水提取物是松针通过使用多糖水作为溶剂的提取方法得到的松针提取物。
35.一些具体实施方案中，松针提取物的浓度为5mg/ml~1000mg/ml进一步可以为5 ~15mg/l，更进一步可以为5mg/l~10mg/l，或者可以为50mg/l~1000mg/l，更进一步可以为500 mg/l~1000mg/l。需要说明的是，对于不同浓度的松针提取物，随着浓度的变化，松针提取物对cho细胞培养性能和蛋白质量的影响也有差异。其中，松针提取物为松针乙醇提取物或者松针水提取物时，松针提取物的浓度为5mg/l~15mg/l，进一步可以为5mg/l~10mg/l；松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为50mg/l~1000mg/l，更进一步可以为500mg/l~1000mg/l。
36.本技术创造性地采用松针提取物优化化学限定cho培养基，发现不同松针提取物在培养后期均会延缓cho细胞死亡，提高cho细胞活率；松针提取物还能够减少单抗的酸性物种变体，增加了单抗的碱性物种变体，有利于抗体蛋白发挥功能和有效性；对于不同糖型的单抗糖基化产生了不同的影响，有利于控制蛋白质糖基化，以更好地靶向特定的寡糖结构；低浓度松针提取物会使单抗的ec50值有所增加，在一定程度内提高了药物的安全性。
37.本技术通过研究松针提取物对cho细胞培养物的影响，开发了新型的化学限定cho培养基，并且通过细胞活率、电荷变体、寡糖结构以及安全性等方面提高了cho细胞培养性能和蛋白质量。
38.因此，本技术的第二方面提供了提供一种cho细胞培养液，包括化学限定cho培养基，化学限定培养基含有上述应用中使用的松针提取物。
39.具体地，化学限定cho培养基是指培养基中的所有成分都是明确的，使用一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等，不含有动物蛋白，更有利于分析cho细胞的分泌产物的培养基。本技术创造性地采用松针提取物优化化学限定cho培养基，发现不同方法提取的松针提取物在培养后期均会延缓cho细胞死亡，提高cho细胞活率，进而提高cho细胞蛋白产量。
40.需要说明的是，本技术创造性地将松针提取物加入化学限定cho培养基，通过培养基培养细胞后对培养基葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵盐以及谷氨酸的含量变化进行检测，以评估添加物对其他培养基成分的影响。通过实验发现，本技术使用的不同松针提取物对葡萄糖的消耗量影响略有差异，但均不影响谷氨酰胺、乳酸、铵盐、谷氨酸的消耗量，且能延缓cho细胞死亡，在培养后期提高cho细胞活率。
41.如上文，化学限定培养基含有的松针提取物包括松针乙醇提取物、松针水提取物以及松针多糖水提取物中的至少一种，具体地，松针提取物的浓度为5mg/ml~1000mg/ml，进一步，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为5mg/l~15mg/l，进一步为
5mg/l~10mg/l，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为50mg/l~1000mg/l，进一步可以为更进一步可以为500mg/l~1000mg/l。
42.一些实施方案中，通过分批补料培养cho细胞时，cho细胞培养液还包括第一补充剂和第二补充剂，第一补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的4%，第二补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的0.4%，以用于在培养过程中为cho细胞提供营养物质。
43.因此，本技术的第三方面提供了提供一种cho细胞培养方法，采用的cho细胞培养液对cho细胞进行细胞培养，从而通过提高细胞活率、减少酸性电荷变体、优化寡糖结构以及提高安全性等方面改善cho细胞培养性能和蛋白质量。
44.一些具体实施方案中，采用的cho细胞培养液对cho细胞进行细胞培养具体包括：培养开始时将含有松针提取物的化学限定cho培养基和cho细胞混合以进行细胞培养，培养开始时，松针提取物的浓度为5mg/ml~1000mg/ml，进一步，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为5mg/l~15mg/l，进一步为5mg/l~10mg/l，松针提取物为松针多糖水提取物时，松针提取物的浓度为50mg/l~1000mg/l，更进一步可以为500 mg/l~1000mg/l。
45.进一步地，细胞培养为分批补料式培养。一些具体实施方案中，分批补料式培养具体包括：在培养期间分批加入第一补充剂和第二补充剂，第一补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的3.5%~4.5%，第二补充剂的体积为化学限定cho培养基体积的0.35%~0.45%%。
46.一些实施方案中，为了实现更优异的培养性能，获得更好的蛋白质量，分批补料式培养的时间不小于14天，从而保证松针提取物实现延缓cho细胞寿命、提高细胞活率，进一步提高cho细胞培养性能和蛋白质量。
47.本技术通过将松针提取物加入化学限定cho细胞培养液中，在有统计学意义的条件下，创造性地发现松针提取物在cho细胞培养方面有着独特的影响作用。从细胞生长的角度来看，松针提取物可以延缓细胞在fed-batch培养后期的细胞死亡，从而使细胞密度和寿命保持较高的水平。由于松针提取物维持着高活性细胞，最大限度地提高了目的蛋白的产量。因此，松针提取物以提高细胞的生长密度和寿命从而实现使目的蛋白产量增加。
48.在生产出的单抗角度来看，cho细胞培养产物中，松针提取物使单抗整体上的酸性物种得到了减少，多数增加到了碱性物种当中，增加了少量的主要物种。本技术使用的松针提取物虽然没有较大程度的增加主要物种，但是未牺牲其他工艺性能，例如，未显著影响结合活性和效价，但延缓了细胞衰老，增加了重组蛋白产量。
49.糖基化特征是代表了最重要的关键产品质量属性之一，在细胞系，细胞培养基和补充剂，以及培养过程中的各种条件下都会影响糖基化。cho细胞产生的单抗类型不同，对其糖基化的要求也会有所不同，会根据所需的作用机制和其他特征，如抗体糖型占比，来实现适当的糖基化特征。在生物仿制药领域，生产出单抗的糖基化特征需要与原研药相匹配，所以就需要调节仿制药的糖基化特征。在单抗的糖基化方面，松针提取物可以调节单抗的糖基化，靶向特定的寡糖结构，如降低单抗高甘露糖比例等，简化了调节糖基化特征的方法，从而降低开发成本。
50.在单抗的活性方面，松针提取物没有造成较大的活性降低，同时增加了ec50，说明松针提取物的加入不会影响生产出的重组蛋白与抗原的结合，但能提高重组蛋白的安全性。
51.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述。
52.本技术实施例使用的二甲基亚砜（dmso）和葡萄糖干粉购自sigma-aldrich（usa）。磷酸盐缓冲盐水（pbs）购自国药集团化学试剂有限公司，完全化学限定培养基cdcho050以及补充剂cdfeed由健顺生物科技有限公司提供，分别为cdfeed1的产品名称为cdfeed008和cdfeed2的产品名称为cdfeed009。本实施例使用的细胞系是稳定的重组chok1细胞系，该细胞系表达igg单克隆抗体，由澳斯康生物制药有限公司提供。松针提取物购自市场上经过水提醇沉操作得到的固体粉末。松针水提取物（pnwe）和松针乙醇提取物（pnee）购自陕西斯诺特生物技术有限公司；松针多糖水提取物（pnpwe）购自兰州沃特莱斯生物科技有限公司。
53.实施例1松针提取物对cho活细胞密度和细胞活率的影响对同一株chok1细胞系进行传代扩增后，开展fed-batch，cho细胞培养过程具体如下文所示。
54.三种松针提取物根据实验要求配置一定浓度的溶液，首先用纯化水进行充分溶解，再利用0.22μm滤器分别在生物安全柜中进行过滤，保证溶液处于无菌状态，在2~8℃环境下进行储存。之后将pnwe组和pnee组分别开设5mg/l、10mg/l、15mg/l三种浓度梯度，pnpwe组开设50mg/l，500mg/l，1000mg/l三种浓度梯度。在培养开始时加入三种松针提取物，在第14天时收获培养物。
55.具体地，将初始细胞解冻后复苏，保持在具有5%co2，80%湿度，37℃条件的二氧化碳振荡培养箱（kuhner，switzerland）中，转速为200rpm。然后以每3天传代一次将细胞以1.0
×
106个活细胞/ml接种到新培养基中。当细胞数量足够开展后续实验时停止传代。设置9个实验组加一个空白对照组。每个实验组设置3个平行实验。在50ml的细胞培养管（tpp,switzerland）中进行独立培养。共计30个细胞培养管，每个管中细胞体积为25ml，接种密度为1.0
×
106个活细胞/ml。
56.从第三天开始补充cdfeed，分别在第3/5/7/9/11/13天添加cdfeed。同时添加的两种类型的cdfeed1和cdfeed2分别占初始培养体积的4%和0.4%。葡萄糖浓度根据每天的nova检测结果，使其始终保持在2g/l的较低浓度下。活细胞密度（vcd）超过10
×
106个活细胞/ml时，为了保证测量准确性，故使用pbs将样品细胞密度稀释一倍进行测量。根据工艺设计，本实施例在培养的第7天进行集体降温处理。温度从37℃降到32℃。在培养第14天后，用高速冷冻离心机（beckmancoulter，usa）在20℃，4500rpm的条件下离心样品30分钟，取上清液作为分批补料培养物。采用vi-cellxr(beckmancoulter，usa)测定培养物的活细胞密度(vcd)和细胞存活率（viability）。培养物中的葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵、谷氨酸、ph和渗透压用bioprofile400(novabiomedical，usa)测定。
57.与对照组进行比较，三组实验组和对照组的活细胞密度(vcd)和细胞存活率（viability）的测定结果如图1~6所示。pnwe实验组在浓度10mg/l和15mg/l条件下，活细胞密度与对照组比较有了不同程度的下降，具体如图1所示。图1表明10mg/l和15mg/l的松针提取物明显抑制了cho细胞的生长。而5mg/l浓度的培养基活细胞密度在培养初期与对照组没有明显差异，培养后期活细胞密度明显高于对照组且结果具有统计学意义，说明在此浓度下pnwe有延缓cho细胞死亡的作用，在细胞活率中表现的尤为明显，具体如图4所示。
58.在培养后期，三种浓度的pnwe实验组cho细胞活率均比对照组高且具有统计学意义。pnee实验组表现出来的结果与pnwe实验组非常相似，在浓度10mg/l和15mg/l中出现了
抑制细胞增长的情况，具体如图2所示，在培养后期会延缓细胞死亡，具体如图5所示。如图3和图6所示，pnpwe实验组在整个fed-batch培养过程中，活细胞密度与对照组相比较都表现出良好的增殖生长情况，并且浓度50mg/l的pnpwe实验组在培养第7天最高活细胞密度达到了16.37
×
106cells/ml，并且500mg/l和1000mg/l浓度的实验组最高活细胞密度也都超过了对照组。
59.在第14天培养结束时，pnpwe三个实验组均保持了较高的活细胞密度和活率，活细胞密度在12
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106cells/ml左右，细胞活率在82%左右。对照组活细胞密度为10.23
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106cells/ml，活率为79.3%，与对照组比较p《0.05,具有统计学意义。培养期间除了pnwe和pnee实验组中10mg/l和15mg/l浓度的葡萄糖消耗量较少之外，其余实验组与对照组的葡萄糖消耗量大致相同。谷氨酰胺、乳酸、铵盐、谷氨酸的含量与对照组比较没有较大差异。
60.实施例2松针提取物对cho细胞产生的单抗效价的影响在fed-batch培养结束后，取细胞上清液利用hplc测定cho细胞产生的单抗效价，具体如图7所示。从结果可以看出，pnwe实验组与比对照组相比较，单抗效价具有不同程度的提高，且结果具有统计学意义，但是随着加入的松针提取物浓度的增加，单抗效价呈下降趋势。pnee实验组在5mg/l浓度的条件下，单抗效价比对照组高且具有统计学意义，10mg/l和15mg/l的浓度下要比对照组的效价低，其中15mg/l浓度实验组单抗效价明显低于对照组，与pnwe实验组相似，随着浓度增加，效价降低。pnpwe实验组不同于前两者，与对照组比较，单抗效价均有明显的提高，并且随着加入的提取物浓度的提升，效价也得到了明显增加，呈剂量依赖关系，在统计学方面，三组数据的p值《0.001，均有极其显著性差异。
61.实施例3松针提取物对cho细胞产生的单抗纯度的影响在fed-batch培养结束后，首先将细胞上清液用0.22μm滤膜进行过滤，除掉上清液中的细胞残留物。实验采用1ml重力柱进行亲和层析，纯化培养物中的单抗样品。纯化的单抗样品保存在-80℃，用于后续对抗体的空间几何尺寸，抗体的电荷变体、抗体糖基化以及抗体结合活性进一步分析。本实施例通过体积排阻层析色谱法从空间几何层面观察松针提取物对单抗纯度的影响，具体采用tskgelg3000swxl分子尺寸排除色谱柱（tosoh，jpn），thermosciencevanquish的hplc系统(thermofisher，usa)对培养物进行分析，监测松针提取物对于单抗在空间几何层面的影响，具体检测结果如表1所示，其中，mainpeak表示主峰，highmolecularweight表示高分子量；lowmolecularweight表示低分子量。
62.表1
在整个cho细胞培养过程中，cho细胞所产生的lgg纯度控制是非常重要的一个环节。lgg纯度的影响因素主要在于上游fed-batch培养和下游上清液纯化工艺。加入松针提取物改变了cho细胞生长环境的物质组成，根据表1可知，在pnpwe组浓度增高时，单抗纯度会有一定程度的下降，但整体而言，松针提取物对于这类单抗在分子尺寸方面没有较大的影响，所有实验组的sec主峰相对百分比都在99%以上，说明松针提取物作为一种复合物加入到培养基当中，不会在分子尺寸方面对单抗纯度造成不利的影响。
63.实施例4松针提取物对cho细胞产生的单抗电荷变体的影响本实施例通过强阳离子交换层析（scx-hplc）检测松针提取物对cho细胞产生的单抗的电荷变体的影响，具体地，使用配备proteomixscx-np5μm4.6x150mm分析柱(sepaxtechnologies,inc)的thermosciencevanquish的hplc系统对纯化的单抗样品进行分析，在主峰之前洗脱的峰称为“酸性峰”，在主峰之后洗脱的峰称为“碱性峰”，通过计算峰面积百分比来确定电荷变异量，具体检测结果如图8所示。
64.根据图8的分析结果可知，pnwe实验组与对照组比较，单抗的酸性物种都有下降，添加pnwe浓度越高，单抗的酸性物种下降程度越大，而碱性物种有所增加，并且随着添加pnwe浓度增加，碱性物种占比也相应增加，两者的结果与对照组比较均具有极其显著统计学差异。而单抗的主要物种在5mg/l和10mg/l浓度下有占比有所增加，15mg/l的浓度占比有所下降，但只是名义上的增加或下降，没有统计学意义。在pnee实验组中，表现出与pnwe实验组类似的结果，酸性物种随着添加浓度升高，下降比例越多。碱性物质则是随着添加浓度升高而占比提高。除了碱性物种中添加5mg/l浓度的结果p值《0.05具有统计学差异，其他实验组结果p值《0.001具有极其显著统计学差异，而主要物质只是在5mg/l和10mg/l有名义上的增加。pnpwe实验组酸性物种都有所减少，其中在500mg/l浓度下酸性物质下降比例最大，并且结果具有极其显著统计学差异。碱性物种则是随着添加浓度升高而占比提高。抗体的主要物种在1000mg/l浓度下，占比有所减少，50mg/l和500mg/l浓度下则是有所增加，但只是名义上的。
65.综合结果表明，三种松针提取物在一定浓度下，都能够减少cho细胞产生的蛋白质的酸性物种变体，但是没有能够显著的增加主要物种，而是增加了碱性物种。酸性物种的存在有可能对所产生的蛋白质的有效性和功能产生一定程度的影响。因此在单抗的生产过程中，控制酸性物种的占比保持相对较低，提高主要物种水平，有利于蛋白质发挥功能和有效性，是蛋白质制造过程中的一个重要目标。本实施例中松针提取物能够显著的减少酸性物种的产生，在某种方面来说，能够对单抗发挥其功能产生一定的益处。
66.实施例5松针提取物对cho细胞产生的单抗糖基化的影响本实施例通过超高效液相色谱荧光检测法（uplc-fld）分析了各个实验组纯化的单抗样品的糖基化含量，具体使用acquityuplc
®
glycanbehamide，130
å
,1.7μm,2.1x150mm色谱柱（waters，usa）进行分析以得到糖基化图谱。实验使用glycoworksrapifluor-msn-糖分析试剂盒（waters，usa），根据糖分析试剂盒说明书对纯化后的单抗样品进行脱糖和标记。根据抗体蛋白已知的糖基化图谱的多糖种类进行标定，按归一化峰面积（峰面积占所有峰面积总合的百分比）来分析糖基化变化，具体如图9和图10所示。其中，g0、g2f、g1fglcnac、man5、g0minusglcnac、g0f、g1fa，g1fb、g0fminusglcnac、和man6等表示采用的是igg糖型命名系统命名的不同糖型。
67.根据图9和图10可知，各实验组纯化后的单抗中共发现有上述十种糖型的糖基化，其中，糖基化含量占比最高的糖型为g0f，达到了70%左右，而松针提取物的加入，降低了g0f的水平，并且在pnpwe实验组中，随着添加浓度的升高，g0f的下降也更为明显，与对照组相比最大相差了8.73%。类似地，随着加入松针提取物浓度的提高，g0minusglcnac和g0fminusglcnac的水平也呈下降趋势。而g1fa，g1fb和g2f三种糖型，则是表现出随着加入松针提取物浓度的提高，水平升高的现象。在pnpwe实验组，g1fa在递增的三种浓度下分别增加了0.56%，4.41%，6.7%。g1fb则是增加了0.96%，2.07%，2.91%。而g2f在水平只有0.22%的情况下，加入松针后，水平增加了0.1%，0.57%，1.01%，500mg/l和1000mg/l浓度下几乎增加了3.6倍和5.6倍。g0在pnwe和pnee实验组中表现出随着浓度升高水平增加的情况。在pnpwe组中，g0和g1fglcnac在500mg/l浓度下达到最高水平，之后表现出高浓度会其g0糖型水平降低的趋势。而man5和man6在50mg/l浓度下就达到了最高水平。
68.培养基中的糖类用于满足cho细胞的能量需求，也是使蛋白质糖基化途径得以进行的碳水化合物来源。细胞依赖的糖类多数为葡萄糖，而根据糖基化含量检测结果来看，松针提取物中存在的糖类以及其他未知的物质，可以影响蛋白质糖基化，控制产品质量。因此，改变cho细胞培养基组分，添加一定浓度的松针提取物，可以控制蛋白质糖基化，更好地靶向特定的寡糖结构。
69.实施例6松针提取物对cho细胞产生的单抗的结合活性的影响本实施例利用酶联免疫反应法（elisa）测定松针提取物对纯化的单抗样品的结合活性，并根据检测结果使用softmaxpro计算机软件中的四参数拟合回归模型绘制曲线，其中，pnwe实验组的单抗样品活性分析回归曲线如图11所示，pnee实验组的单抗样品活性分析回归曲线如图12所示，pnpwe实验组的单抗样品活性分析回归曲线如图13所示，曲线中横坐标表示单抗样品浓度，纵坐标表示检测的a450值，曲线中参数c即为50%最大效益时对应的浓度（ec50），通过计算对照组和实验组的ec50比值来报告相对活性，具体如图11和表2所示，其中，r2表示各实验组单抗样品活性分析回归曲线的决定系数。
70.表2根据图14和表2可知，低浓度松针提取物加入会降低单抗样品lgg的活性，随着浓度提高，活性也随着提高，lgg活性有着浓度依赖性。除了pnee实验组，其余组单抗活性都低于对照组的活性。根据本实施例所用cho k1细胞培养出的lgg结合活性要求，不同松针化合物加入后lgg结合活性均处于可接受的范围内，可以认为松针提取物对cho分泌的lgg结合活性的影响不大。
71.在药物的安全指标方面，cho细胞产生的单抗的半最大效应浓度（ec50）整体都有增加，具体如图11和表2所示，pnwe实验组和pnee实验组的ec50会随着松针提取物浓度升高而减小，并趋近于对照组。pnpwe实验组中50mg/l和500mg/l两个浓度下ec50值接近，均高于对照组。1000mg/l浓度的ec50与对照组接近。因此，低浓度松针提取物会使本实施例cho细胞产生的单抗的ec50值有所增加，药物的安全性在一定程度内得到了提高。
72.以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
73.以上实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。