八位点多重PCR基因分型试剂盒的制作方法

八位点多重pcr基因分型试剂盒
技术领域
1.本发明属于基因检测试剂领域。


背景技术：

2.基因分型是通过检测和比对dna序列以确定个体的遗传构成(基因型)的过程，其典型的作用就是鉴别同一样品中是否存在来自不同个体的dna，或者鉴别2份(或以上)样本是否包含了来自同一个体的dna。其应用场景举例如下：
3.(1)器官移植后的移植物损伤监测
4.细胞游离dna(cell-free dna，cfdna)是一种可在血液、尿液等体液中检测到的片段化、降解dna。在器官移植后，移植物损伤会令移植物释放供者来源的cfdna(donor-derived cfdna,dd-cfdna)。beck等研究发现，移植物功能稳定的心脏、肾和肝移植受者中，血浆dd-cfdna浓度分数分别为0.9％、1.2％和3.5％，一旦移植物发生损伤，血浆dd-cfdna浓度分数将会突然高于稳定时的浓度分数，可用于移植物损伤的长期监测。而对cfdna进行正确的基因分型，是检测血浆中dd-cfdna浓度分数的前提。
5.(2)刑侦样本的检测
6.在刑事案件侦查中，有时需要通过比对两个犯罪现场的生物样本是否来自同一人。通过提取样本中的dna，进行基因分型，即可实现这一目的。
7.目前，基因分型的常用技术手段包括pcr、寡核苷酸探针、基因测序、基因芯片等。但在事先不知道待区分的个体具体存在哪些dna序列差异时，无法有针对性地设计pcr引物或探针，只能通过基因测序和基因芯片等高通量、粗放型检测技术检测dna后再进行全局比对，时间、物质成本较高。
8.另外，pcr方法单次检测的位点数有限，因为在一个体系中对多个位点进行pcr扩增时引物之间容易相互干扰，目前已报道的能在一个体系中同时进行pcr的引物对数不超过5对(每对引物对应一个位点)。所以，在需要检测多个位点来实现基因分型时，往往需要设置2组以上的pcr反应体系。


技术实现要素：

9.本发明要解决的主要问题是：提供一种能在事先不知道待区分的个体具体存在哪些dna序列差异时，仍能进行基因分型的非测序、非基因芯片的方法。
10.本发明要解决的次要问题是：提供一种能够同时检测8个dna位点的多重pcr引物对组合及对应的试剂盒。
11.本发明的技术方案如下：
12.一种人类基因分型引物组合，所述引物是分别扩增如下dna序列多态性位点的引物：
13.rs146993505、rs148026204、rs71752266、rs149868456、rs141566886、rs139197112、rs139629754、rs141415483。
14.进一步地，所述引物组合的序列如seq id no.1～16所示。
15.一种人类基因分型用pcr试剂盒，所述试剂盒的引物是分别扩增如下dna序列多态性位点的引物：
16.rs146993505、rs148026204、rs71752266、rs149868456、rs141566886、rs139197112、rs139629754、rs141415483。
17.进一步地，所述引物组合的序列如seq id no.1～16所示。
18.进一步地，所述引物存在于同一个溶液体系中。
19.一种人类基因分型方法，所述方法是对如下dna序列多态性位点组合进行检测：rs146993505、rs148026204、rs71752266、rs149868456、rs141566886、rs139197112、rs139629754、rs141415483；
20.当所述dna序列多态性位点组合存在区别，则判定dna来自不同个体，否则，这判定dna来自同一个体。
21.进一步地，所述检测为pcr检测。
22.进一步地，所述pcr检测为使用序列如seq id no.1～16所述引物组合对dna进行扩增。
23.进一步地，所述引物组合位于同一个pcr反应体系中进行扩增。
24.进一步地，所述方法是区分器官移植受者体内cfdna来源个体的方法；
25.所述不同个体表示器官移植受者和供者。
26.本发明的有益效果：
27.(1)本发明的方法和引物组合借助对特定多态性位点组合的扩增，有效实现人类基因分型。相比传统的基因测序、芯片方法节约了大量的时间和物质成本。
28.(2)本发明的引物组合成功实现8对引物在同一反应体系中进行pcr，克服了引物间相互干扰的障碍，进一步简化了pcr的操作流程。
29.人类dna序列多态性位点数量众多，目前ncbi的dbsnp数据库记载了人类720643623个dna序列多态性位点，其在人群中频率各有不同，任意选择其中数个位点，很难对未知基因型的两人进行基因分型。本发明的核心思路是：通过对8种特定的indel型dna序列多态性位点(rs146993505、rs148026204、rs71752266、rs149868456、rs141566886、rs139197112、rs139629754、rs141415483)进行检测，进而实现基因分型。在本发明的核心思路下，采用任何其他技术来检测前述位点组合以进行基因分型的方法和试剂盒均在本发明的范围内。
30.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
31.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
32.图1～4为相同的4个pcr体系的产物的在不同通道的检测结果。
33.图1：多重pcr产物在fam通道下的检测结果。可见不同样本在3个多态性位点(框线
内)产生了不同长度的扩增产物。
34.图2：多重pcr产物在rox通道下的检测结果。可见不同样本在2个多态性位点(框线内)产生了不同长度的扩增产物。
35.图3：多重pcr产物在tamra通道下的检测结果。可见不同样本在1个多态性位点(框线内)产生了不同长度的扩增产物。
36.图4：多重pcr产物在hex通道的检测结果。可见不同样本在2个多态性位点(框线内)产生了不同长度的扩增产物。
具体实施方式
37.实施例1本发明的试剂盒
38.1.试剂盒组成
39.本发明的试剂盒是多重pcr试剂盒，其内包括本领域中常规pcr所需的缓冲液、dntp、taq酶、镁离子，前述成分混合为3倍工作浓度的预混液3
×
t_enzyme mix；试剂盒还包括序列如表1所示的引物，每对引物用荧光基团(fam、hex、tamra或rox)标记，混合后命名为panel hx-8indel。
40.表1引物序列
[0041][0042]
试剂盒中组分如表2所示。
[0043]
表2试剂盒组成
[0044]
组分名称规格(50次)保存条件panel hx-8indel400ul-20℃3×
t_enzyme mix0.5ml-20℃
[0045]
2.实验流程
[0046]
1)按表3配制pcr反应体系
[0047]
表3反应体系
[0048][0049][0050]
注意：
[0051]
反应体系在冰上配制，并注意避光。配好的反应体系在上机之前应短暂离心将管壁上的液体离心至管底。
[0052]
2)pcr反应条件
[0053]
反应条件如表4所示。
[0054]
表4pcr反应条件
[0055][0056]
3)产物分析
[0057]
扩增产物无需纯化，可直接通过毛细管电泳进行片段分析。在不同的荧光通道下比较产物片段大小，正常的片段大小如表5所示，片段缺失会有10bp左右的差异。
[0058]
表5扩增片段长度
[0059][0060][0061]
实验例1对器官移植供者和受者的cfdna的分型检测
[0062]
募集华西医院就诊的器官移植受者28人，采集血液，提取cfdna，使用实施例1的试剂盒对cfdna进行分型，统计其分型结果。
[0063]
其中4个样品的毛细管电泳在不同荧光通道下的结果如图1～4所示，可见本发明涉及的8个位点均扩增出了条带，且条带长度在部分样品中呈现不同。表明本发明的试剂盒的8对引物能够在同一体系内有效进行扩增。
[0064]
分型结果如表6所示，每对供者和受者的基因型均不相同，通过对8个位点(rs146993505、rs148026204、rs71752266、rs149868456、rs141566886、rs139197112、rs139629754、rs141415483)的扩增即可有效区分供者和受者来源的cfdna，即实现了基因分型。
[0065]
表6基因分型结果
[0066]
[0067]
[0068][0069]
备注：a:野生型；a:缺失型。
[0070]
该结果表明，本发明的分型试剂盒可以对人的cfdna进行准确的基因分型。
[0071]
综上，本发明的基因分型试剂盒可以在同一pcr体系中同时扩增8个位点，并能对人进行准确的基因分型。本发明在器官移植的排异反应检测等领域具有很好的应用前景。