一种用于神经退行性疾病早期诊断的金络合物探针的制备与应用

1.本发明涉及神经退行性疾病诊断探针领域，具体为一种可用于阿尔兹海默病等神经退行性疾病的早期多模态分析诊断的靶标蛋白结合肽与金(au)的络合物探针的制备方法以及该类络合物在神经退行性疾病病理组织中对特定靶标蛋白的荧光标记、催化显色和质谱定量分析等多模态诊断应用。


背景技术：

2.以阿尔兹海默病(alzheimer's disease，ad)为代表的神经退行性疾病，是老龄人口中发病率最高的疾病之一。其中ad是最常见的神经退行性疾病，以认知障碍为主要临床表现。据统计，ad相关综合症已成为全球第七大死因，在发达国家的影响尤其明显，已成为第四大死因，严重威胁人类健康和生活质量，给社会带来沉重的负担。我国是世界上ad患者最多的国家。且随着我国人口老龄化进程的加快，每年还有新增患者30万，也是增速最快的国家之一。但是，与疾病严峻形势严重不相符的是，ad患者诊疗率与发病情况呈强烈反差，全球ad及其它类型痴呆患者中，仅有22％接受过诊断，而这个比例在我国更低，仅21％的患者得到了规范诊断，仅19.6％接受了药物治疗。研究表明，对ad患者进行早期诊断、早期预防和干预治疗是非常重要的，如果能在发病早期及时发现并给予适当的干预治疗，就可以延缓病情的进展。但是，由于ad的病因和致病机制尚未完全清楚，目前临床诊断常以简易精神状态检查得分(mini mental state examination，mmse)和临床痴呆量表得分(clinical dementia rating，cdr)等神经心理学调查、脑电图、神经影像和其他辅助检查等为主，对无明显临床症状的ad患者仍然缺乏有效的早期诊断手段。许多患者未能及时发现而不能得到早期有效的治疗，导致ad到目前为止，仍然是一种无法治愈的疾病。所以，对ad进行更深入的研究以发现早于传统意义上病理损伤的变化，寻找疾病相关的早期生物标志物，开发相应的诊断探针，进行早期预警，并指导临床的诊断与及时治疗，是控制ad发生、发展的重要途径，对ad的有效治疗具有重要意义。在现行ad诊断靶标方面，aβ斑块和tau蛋白缠结也就成为ad诊断和治疗的公认靶标。这是由于这些病理特征的出现，意味着患者已经进入疾病晚期，此时脑中老年斑已经形成，毒性aβ已造成无法逆转的神经损伤，介入治疗时间已显滞后。所以，鉴定出更加早期的ad标志物，并针对其开发出有效的早期诊断方法，已经成为急需攻克的重要目标。
3.文献表明结缔组织生长因子(ctgf)等蛋白参与了ad等退行性疾病的神经病理学的启动和/或维持，是该类疾病诊断和治疗的潜在早期靶标。多肽与au形成的络合物，分子结构明确，具有良好的生物相容性，还具有独特物理化学性质，比如稳定的荧光和类酶催化性质等。得益于这些独特物理化学性质和多肽的靶向性设计，该类材料在生物医学分析诊断方面具有很大的潜力。但是，目前还没有研究金与神经退行性疾病靶标蛋白结合肽络合物的合成方法及其用于神经退行性疾病多模态诊断的报道。


技术实现要素：

4.神经退行性疾病早期诊断对于有效预防与治疗具有重要意义，针对早期诊断的有效性与精准度面临的挑战，本发明提供了一种新型的多模态检测金属探针，即利用神经退行性疾病早期靶标蛋白的特异性结合肽与金形成的络合物探针。通过多模态成像分析与精确质谱定量技术，实现对神经退行性疾病病理样本的体内外早期诊断。
5.本发明涉及一种金与含巯基靶向肽的制备及应用，涉及神经退行性疾病诊断领域，是将金的盐溶液与含巯基的神经退行性疾病早期靶标蛋白的特异性结合肽在特定温度下进行混合搅拌，添加还原试剂后，高价金会被还原成金原子和低价金离子。本发明可以用于阿尔兹海默病等神经退行性疾病的早期多模态诊断，相较普通的肽金络合物，可实现神经退行性疾病早期靶标蛋白的特异性识别与标记，其中多肽实现靶向结合，金络合物通过荧光和催化显色实现半定量直观分析，金元素通过质谱定量实现靶标蛋白的精准定量检测。
6.一种金与神经退行性疾病早期靶标蛋白结合多肽反应形成的络合物，其特征在于，所述的络合物的分子组成(au)x(d)y，x＝1～35，y＝1～30，所述的d为含巯基的多肽或添加巯基改造多肽，au与多肽中的巯基作用，形成络合物，其中所述的多肽具有神经退行性疾病早期靶标蛋白识别与结合功能，例如针对ctgf蛋白、tau蛋白等。
7.上述所述络合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将金盐溶液与含巯基的多肽混合形成混合液，在一定温度及ph条件下，加入还原剂，使该混合液体系发生还原反应，au通过与多肽的巯基相作用，形成所述(au)x(d)y络合物。
8.所述的金盐溶液为三价金化合物或金的无机盐类化合物，如氯金酸；其中所述三价金被还原为金原子或/和一价金。
9.所述的还原剂为硼氢化钠(nabh4)、氢氧化钠(naoh)、维生素c(vitamin c)或柠檬酸三钠(trisodium citrate dihydrate)等，根据实际合成优选。
10.在混合溶液中多肽的浓度为0.1μm-10m，金盐浓度为0.01m-10m。多肽与金盐的摩尔比为1:1～1:5，根据实际合成优选。
11.所述混合液发生还原反应，反应温度为20～75℃，ph条件为酸性(尤其弱酸性)、中性或碱性，可根据需要调节、优选。
12.所述混合液发生还原反应，在20～75℃避光搅拌1-10小时，溶液颜色由无色变为浅黄再发生颜色转变，通过超滤,透析等方法纯化得到aud络合物。aud络合物的水合粒径一般小于5nm。
13.所述金与多肽的络合物的应用，用于制备神经退行性疾病诊断的探针；所述的神经退行性疾病包括但不局限于阿尔兹海默病、帕金森氏病和神经胶质瘤等多种疾病。
14.所述的金与多肽的络合物的应用，用于制备荧光标记、催化显色和质谱定量等多模态分析诊断探针，用于神经退行性疾病的病理诊断。
15.所述的神经退行性疾病的病理组织包括但不局限于阿尔兹海默病、帕金森氏病和神经胶质瘤等多种疾病动物模型及临床患者的病理组织。
16.本发明所述的神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽与金的络合物应用于神经退行性疾病的诊断，相较于现有诊断探针和诊断方法，可以将多肽的靶向结合功能和金络合物的多模态检测性能整合在同一个化合物上，实现了诊断靶标的靶向标记与定量分析，大
大提高诊断的准确度。同时该络合物是结合神经退行性疾病中神经系统异常表达的蛋白靶标，可以减少对正常组织细胞的毒副作用。
附图说明
17.图1a为本发明实施例1的dag和aud的紫外可见吸收光谱图；
18.图1b为本发明实施例1的aud的荧光光谱图，ex代表激发光谱，em代表发射光谱；
19.图1c为本发明实施例1的dag和aud的水合粒径图；
20.图1d为本发明实施例1的aud的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)；
21.图2a为星形胶质瘤细胞u87、神经母细胞瘤细胞sh-sy5y、星形胶质细胞ctx-tna2中ctgf表达量的western blot图；
22.图2b为星形胶质瘤细胞u87、神经母细胞瘤细胞sh-sy5y、星形胶质细胞ctx-tna2中ctgf表达量的western blot统计灰度图；
23.图2c为本发明实施例1标记星形胶质瘤细胞u87、神经母细胞瘤细胞sh-sy5y、星形胶质细胞ctx-tna2中靶标蛋白ctgf的荧光定量分析图；
24.图2d为本发明实施例1在星形胶质瘤细胞u87、神经母细胞瘤细胞sh-sy5y、星形胶质细胞ctx-tna2中靶标ctgf蛋白的荧光统计图及质谱定量示意图；
25.图2e为本发明实施例1在星形胶质瘤细胞u87中靶标蛋白ctgf与商业化ctgf抗体免疫荧光共定位示意图；
26.图2f为本发明实施例1在星形胶质瘤细胞u87、神经母细胞瘤细胞sh-sy5y、星形胶质细胞ctx-tna2中催化显色分析示意图；
27.图3a为本发明实施例1在不同月份阿尔兹海默症小鼠和正常鼠脑片上与阿尔兹海默症标志物aβ蛋白共定位免疫荧光示意图；
28.图3b为本发明实施例1在不同月份阿尔兹海默症小鼠和正常鼠脑片上(icp-ms)质谱定量示意图；
29.图3c为本发明实施例1在不同月份阿尔兹海默症小鼠和正常鼠脑片上催化显色示意图。
具体实施方式
30.体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。
31.本发明提供了一种新型的金与神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽的络合物的制备方法及其神经退行性疾病诊断应用，本质上说是金与结合肽中的巯基反应形成金硫键，包括提供金元素的盐溶液，将所述金盐溶液与多肽溶液混合，在一定温度、ph和还原剂下，使混合液发生还原反应，将所述金盐中的高价金还原为金原子或低价金离子，所述巯基由多肽提供。
32.优选地，可以向所述混合液中加入弱碱，提供弱碱性环境从而使还原剂具有还原性从而还原金离子。
33.本发明所选用的金盐溶液为三价的金盐溶液，如氯金酸溶液。在制备过程中三价金被还原为金原子或一价金离子。
34.本发明举例所选用的多肽为具有神经退行性疾病早期靶标蛋白特异性识别结合能力的功能肽，可以是天然的肽或者人工合成肽，优选为ctgf结合肽，如dag肽。
35.本发明-实施方式的新型神经退行性疾病多模态诊断探针aud络合物的制备方法，包括：
36.将金盐溶液与含有巯基的神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽溶液混合，搅拌3～5min，使金盐与多肽充分接触，形成混合液；向上述混合液中加入还原剂以使所述体系发生还原反应，调节ph，避光反应，待溶液颜色由无色变为浅黄，再发生颜色转变后继续搅拌1-10小时，最终得到金与肽的络合物。
37.进一步地，可将上述络合物用高速离心机去除大颗粒，随后用超滤管进行纯化，以除去未反应的碱以及未反应的金盐，调节ph(使探针维持稳定结构)浓缩备用。
38.其中，金盐与巯基多肽的摩尔比为1:1-1:5，优选为1:1，所用还原剂可以为硼氢化钠(nabh4)、氢氧化钠(naoh)、维生素c(vitamin c)等，优选为柠檬酸三钠。采用的金盐浓度可以为0.01μm～10m，例如25mm的氯金酸溶液，与浓度为0.1μm～10m的巯基肽，例如1μm，按照最优摩尔比(例如1:1)混合反应。
39.本发明的制备方法所制备的络合物水合粒径为1～5nm，每个au-肽络合物具有精确的分子组成(au)x(d)y，x＝1～35，y＝1～30，并且具有光致荧光特征。
40.本发明的制备方法所制备的络合物，具有类酶催化活性，可以实现催化显色反应，进行原位观察。
41.本发明的aud络合物的制备方法，使用含巯基的神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽作为配体，利用金对巯基的亲和性，合成了au-肽加合物，一步还原法合成方法简单，所获得的络合物具有较高的稳定性，尤其适用于神经退行性疾病靶标分子的标记与诊断。
42.在本发明中，选用含巯基的神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽作为配体直接与au盐进行加合，形成巯基-au加合物。另外，在制备该类络合物的时候，其生物相容性、水溶性、化学稳定性、尺寸和表面性质等属性都可以通过独立的设计和改造去适应某种特定的生物医学应用的要求。
43.本发明的新型金络合物类分子探针au-肽加合物，用于神经退行性疾病的诊断具有诸多优点：(1)可以根据神经退行性疾病早期诊断靶标蛋白的最新研究进展，设计筛选相适配的结合肽，进行新靶标的快速检测，实现神经退行性疾病的早期诊断；(2)利用结合肽的靶向识别与特异性结合，实现探针的神经系统靶向递送和原位检测，提高检测效率；(3)利用金络合物的荧光性质、类酶催化活性和质谱定量，可以实现对靶标蛋白的空间分布、相对表达和精确定量的检测，实现神经退行性疾病的多模态诊断，提高诊断准确度。(4)在后续的应用中，还可以通过放射性同位素的掺杂，实现体内原位的放射性成像检测，提高诊断灵敏度。
44.所述金与神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽的络合物的应用，用于制备神经退行性疾病诊断探针。所述的神经退行性疾病包括但不局限于阿尔兹海默病、帕金森氏病和神经胶质瘤等多种疾病。
45.下面，结合具体实施例对本发明的aud络合物及制备方法与应用做进一步说明。其
中，实施例所采用的金盐为三价的氯金酸；神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽选用特异性结合ctgf的dag肽。采用紫外和荧光光谱仪对合成的aud的紫外可见吸收和荧光特性进行表征，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)进行络合物分子组成的解析。采用胶质瘤细胞和阿尔兹海默病转基因小鼠模型的脑组织作为诊断检测样本，证明探针的多模态检测可行性。
46.实施例1、aud络合物的制备与表征
47.1)一定温度下(本实例优选55℃)，10mg dag肽(cdagrkqkc)(首尾酰胺键环化)溶于10ml的超纯水里，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌；
48.2)将400ul的氯金酸溶液(25mm)逐滴加入上述溶液中；
49.3)随后向体系中加入200ul柠檬酸三钠溶液；
50.4)立即逐滴滴加1000ul的naoh(1mol/l)溶液，调节溶液ph为碱性，持续搅拌5h；
51.将搅拌子用磁力棒吸出，可得发射红色荧光的金团族。使用截留分子量为3000的超滤管去除游离的金属离子以及未发生反应的多肽。合成的络合物可见光下呈棕黄色。紫外光下呈现红色。
52.如图1a所示，dag肽在270和307nm处有较强的吸收峰，络合物在275nm左右处无吸收峰，说明dag肽发生了反应。如图1b所示，该络合物的荧光光谱表明，该物质最佳激发波长是550nm，最佳发射波长是660nm。图1c为本发明实施例1的dag和aud的水合粒径分别为0.7nm和2.64nm。图1d为本发明实施例1的aud的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)检测结果，从图中结果可知该络合物分子式为au
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petide8(p代表petide，s代表金硫键)；
53.以下实施例的相关测试均是采用本实施例1所得aud络合物。
54.实施例2、aud在细胞水平对靶标蛋白的荧光定性定量分析
55.首先将ctgf表达水平不同的星形胶质瘤细胞(u87)、神经母细胞瘤细胞(sh-sy5y)、星形胶质细胞(ctx-tna2)三种细胞种在玻璃小皿上，在37℃和5％二氧化碳环境下的细胞培养箱中培养。第二天，将细胞拿出用pbs洗三遍，然后用3.7％的多聚甲醛固定30min。随后将多聚甲醛去除。然后向培养皿中加入2ml 3％bsa溶液培养30min用于排除非特异性吸附。去除3％bsa溶液，加入一定浓度的该络合物aud进行孵育，dapi染核后用激光共聚焦荧光显微镜进行成像观察。
56.为了证明该络合物可以靶向标记细胞上的靶标蛋白，我们通过商品化的ctgf抗体与该络合物标记的ctgf进行荧光共定位分析。u87细胞种在玻璃小皿上，拿出用pbs洗三遍，然后用3.7％的多聚甲醛固定。随后将多聚甲醛去除。然后向培养皿中加入3％bsa溶液培养30min用于排除非特异性吸附。去除3％bsa溶液，向细胞培养皿里加入一定浓度商品化ctgf抗体，4℃过夜培养。接着fitc标记的羊抗兔二抗37℃下避光孵育30min。随后加入一定浓度的aud络合物，培养60min。dapi染核后放入激光共聚焦显微镜下成像。
57.图2c，2d-1为本发明对三种细胞荧光成像后细胞上荧光示意图及荧光强度的统计图，从荧光示意图可以看出ctgf抗体表达量最多的u87细胞荧光强度最强，sh-sy5y次之，ctx-tna2最弱。荧光强度统计结果也证明了这一点，这与之前western blot的结果相一致。icp-ms结果也与之一致。
58.图2e为u87细胞中加入该络合物孵育及不加该络合物的空白对照组，且位置与
ctgf荧光抗体相一致，可以证明该络合物aud可以靶向ctgf靶标蛋白。
59.实施例3、aud在细胞水平对靶标蛋白的质谱定量分析
60.将已经用激光共聚焦显微镜成像后的u87,sh-sy5y和ctx-tna2细胞加入3ml王水消解，放到微波消解仪上160℃赶酸。最后样品用稀酸稀释到合适的浓度转入icp-ms系统检测。图2d-2为本发明对三种细胞荧光成像后经电感耦合等离子体质谱仪icp-ms消解分别检测到的含金量统计图，可以看出ctgf抗体表达量最多的u87细胞含金量最强，sh-sy5y细胞含金量次之，ctx-tna2细胞含金量最弱。与之前荧光强度统计结果和western blot的结果相一致。
61.实施例4、aud在细胞水平对靶标蛋白的催化显色分析
62.在本发明实例1中，我们设计了一种功能多肽为配体来构建具有红色荧光性质和内在过氧化物酶活性的络合物。它可以催化常用的过氧化物酶底物3，3，5，5-四甲基联苯胺硫酸盐(tmb)和3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)的氧化。此外，该络合物表面的多肽具有特异性的识别细胞的ctgf蛋白，因此该络合物可以特异性的靶向标记细胞的ctgf蛋白上。当该络合物定位到细胞上时，加入dab显色液，然后该络合物可以进一步的催化氧化dab溶液，在细胞上形成不溶于水的棕褐色沉淀，通过普通光学显微镜就能观察到肿瘤细胞上附着的棕色沉淀。我们选择了高表达ctgf的u87细胞为研究对象，来看该络合物是否可以简单快速的检测ctgf表达水平。此外，我们还选择了ctgf中等表达的sh-sy5y和低表达ctgf的ctx-tna2作为对照。如图2f，很明显的看到ctgf表达量很少的ctx-tna2，有很少的棕色沉淀附着在细胞上，而ctgf表达量多的u87细胞有较多的棕色沉淀。
63.实施例5、aud在阿尔兹海默病小鼠脑组织中的多模态诊断分析
64.前面已经证明了该络合物可以靶向细胞上与神经退行性疾病密切关联的早期靶标蛋白ctgf,现在探究该络合物是否可以靶向标记阿尔兹海默病小鼠脑组织上与神经退行性疾病早期病变密切关联的aβ靶标蛋白，从而实现早期诊断的效果。首先将正常小鼠脑切片，3个月早期ad小鼠脑片，9个月晚期ad小鼠脑片脱蜡水化。然后通过商品化的aβ抗体对小鼠脑切片进行特异性标记，接着fitc标记的羊抗兔二抗37℃下避光孵育30min；随后加入一定浓度的该络合物培养。dapi染核后放入激光共聚焦显微镜下成像。接着用已经激光显微镜成像后的不同组的小鼠切脑片加王水消解，使用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)分别检测到不同组脑切片金含量统计图。将已脱蜡水化的脑切片按照以上步骤标记该络合物aud，激光共聚焦成像后加dab显色溶液，然后该络合物可以进一步的催化氧化dab显色溶液，形成不溶于水的棕褐色沉淀。图3a可以看出在九个月ad鼠脑切片aβ蛋白表达量最多，荧光最亮，3个月早期ad鼠和正常鼠则无荧光，这也符合之前文献的报导。而aβ的位置与该络合物荧光位置一致，初步实现荧光共定位。aβ表达量最多的九个月ad鼠脑切片络合物标记荧光最强，三个月ad鼠脑切片有部分荧光，而正常鼠几乎没有荧光。图3b可以看出通过icp-ms结果可以看出九个月晚期ad小鼠脑切片上的含金量最多，三个月早期ad小鼠脑切片的含金量次之，正常小鼠脑切片的含金量最少。质谱统计图与激光共聚焦显微镜荧光强度的结果相符合。图3c可以看出正常组小鼠和早晚期ad小鼠脑组织切片上dab显色结果与荧光结果及质谱结果一致。综上结果，三种诊断方式结果相互验证，从而实现该络合物aud在阿尔兹海默病小鼠脑组织中的多模态诊断分析。
65.本发明涉及一种金与巯基多肽络合物的制备及应用，属于神经退行性疾病早期病
变的多模态诊断探针开发领域，是以神经退行性疾病早期靶标蛋白结合肽为模板或配体制备生物相容性好的aud络合物，将含巯基的多肽直接与金盐络合，利用多肽的靶向识别与特异性结合，以及金络合物的荧光性质、类酶催化活性和质谱定量进行诊断靶标的多模态精确诊断，用于神经退行性疾病的体内外早期诊断。
66.除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
67.本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。