一种层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体的方法及应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体的制备方法及应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤已经成为严重危害人类生命健康的常见疾病，临床诊断原发肿瘤中约50％的患者已产生远端转移，肿瘤细胞増长快、易变异，容易产生多药耐药，从而导致化疗失败。光动力治疗(photodynamic therapy，pdt)作为一种新型的肿瘤治疗方法，具有高效、微创等显著优势，一直备受研究者的高度关注。美国fda于1997年将光动力学治疗列为肿瘤治疗基本方法；2003年中国nmpa批准光动力学治疗进入临床应用。近年来随着光激活装置、光敏药物的不断进步，瘤内注射光敏剂后，采用光纤将激光聚焦在肿瘤部位，从而增加深部靶区光剂量、降低非靶区光细胞毒性。现已有大量研究表明，光动力治疗后，肿瘤细胞可以发生免疫原性死亡，但基于光动力治疗诱导的免疫效应非常有限，不足以应对肿瘤的转移和复发。细胞焦亡作为一种程序性细胞死亡方式，由gasdermin家族蛋白介导细胞孔洞形成，引起细肿瘤细胞肿胀破裂，释放出大量细胞炎性内容物，能有效提高肿瘤细胞免疫原性死亡的能力。
3.光敏剂是光动力治疗三大重要组成部分之一，酞菁类化合物及其衍生物在近红外区有强吸收，是目前具有潜在前景的一类光敏剂。其中酞菁锌(znpc)化学合成和纯化简单、价格低廉，znpc的脂质体制剂cgp55847由诺华公司开发并进行了i/ii期人体临床试验，表明znpc是一种很有前景的临床候选光敏剂。然而，由于znpc分子间严重的π-π堆积作用，cgp55847在生物介质中仍然存在一定的聚集性，阻碍了znpc脂质体的进一步研究。此外，大量研究表明，经亲水基改性的znpc衍生物，不仅合成与纯化难度大，而且水溶性也未得到彻底改善，极大限制了znpc的临床应用。
4.近年来，得益于纳米材料的快速发展，光敏剂纳米化递药策略的优势逐渐凸显：能解决光敏剂溶解性、“聚集淬灭”效应、肿瘤富集以及光动力治疗效果等多种问题。此外，线粒体靶向的光敏剂能直接引起肿瘤细胞线粒体氧化应激，使肿瘤细胞发生免疫原性死亡。纳米层状双氢氧化物(ldh)在生物医学应用中显示出巨大的潜力，具有生物相容性好、合成方便等优点，已广泛用于药物/基因传递以及无机-生物复合材料。


技术实现要素：

5.本发明提供的一种层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体，在光动力治疗肿瘤过程中，一方面通过靶向肿瘤线粒体，引起线粒体氧化应激，另一方面介导肿瘤细胞发生细胞焦亡，共同提高肿瘤细胞免疫原性死亡，在治疗原发肿瘤的同时，有效抑制远端肿瘤生长。
6.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供了一种层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体，所述纳米复合体由表面阳离子特性的层状双氢氧化物(ldh)纳米材料和光敏剂酞菁锌(znpc)制备，
粒径为50nm～200nm。
8.优选的，所述ldh为正六边形，由三价金属阳离子、二价金属阳离子和层间阴离子组成。
9.本发明的第二个方面，提供了本发明所述的层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体在以下任意制剂中的应用：
10.1)线粒体靶向制剂；
11.2)细胞焦亡诱导制剂；
12.3)抗肿瘤制剂。
13.优选的，所述的抗肿瘤制剂包括肿瘤光动力治疗制剂，所述肿瘤光动力治疗制剂为：具有线粒体靶向作用，可在特定光照下，引起肿瘤细胞线粒体氧化应激以及肿瘤细胞焦亡。
14.优选的，所述特定光照为红外光；更进一步优选的，红外光包括但不限于led灯(670nm，10mw/cm2)。
15.优选的，所述肿瘤包括皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌及食道癌。
16.优选的，所述制剂的有效浓度为不小于5ng/ml；更进一步优选的，所述制剂的有效浓度为不小于80ng/ml。
17.优选的，所述制剂为注射剂。
18.优选的，所述层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体由表面阳离子特性的ldh和光敏剂znpc制备，粒径为50nm～200nm。
19.优选的，所述ldh为正六边形，由三价金属阳离子、二价金属阳离子和层间阴离子组成。
20.本发明的第三个方面，提供了本发明所述的层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体的制备方法，包括以下步骤：
21.s1、将光敏剂znpc溶于有机溶液中，超声溶解；
22.s2、将ldh分散于与步骤s1相同的有机溶液中，超声分散；
23.s3、将步骤s1的znpc溶液与步骤s2的ldh分散液混合，并调节ph至8～9，搅拌一定时间；
24.s4、将步骤s3的混合液离心收集、洗涤，即得纳米复合体。
25.优选的，所述有机溶液包括二甲基亚砜、二甲基酰胺或n-甲基吡咯烷酮。
26.优选的，步骤s2的ldh的制备方法为：在氮气保护下将含有mgcl2·
6h2o和alcl3·
9h2o的混合溶液缓慢加入naoh溶液中，室温下剧烈搅拌，得到的悬浊液于5000rpm离心5min，去离子水洗涤三次，去离子水重悬，置于水热釜中，100℃干燥箱中反应一定时间，离心(10000rpm，20min)收集，去离子水洗涤三次，得到胶状的ldh纳米材料。
27.综上所述，本发明将znpc装载于ldh纳米材料，在解决znpc“聚集淬灭”效应的同时，可实现对肿瘤细胞线粒体的靶向杀伤，从而引起线粒体氧化应激，同时，肿瘤细胞发生焦亡，共同提高免疫原性死亡，从而对肿瘤发挥高效的光动力治疗效果和光免疫效应。
28.与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明提供的一种层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体在肿瘤光动力治疗中具有高效、微创等显著优势。本发明合成的
层状双氢氧化物-酞菁锌纳米复合体，在光动力治疗肿瘤过程中，一方面通过靶向肿瘤线粒体，引起线粒体氧化应激，另一方面介导肿瘤细胞发生细胞焦亡，共同提高肿瘤细胞免疫原性死亡，能在治疗原发肿瘤的同时，有效抑制远端肿瘤生长，对高转移恶性肿瘤具有重要意义。
附图说明
29.为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
30.显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
31.图1为本发明实施例1的ldh纳米材料的tem图；
32.图2为本发明实施例2的ldh@znpc纳米复合体的tem图；
33.图3为本发明实施例3的ldh@znpc纳米复合体对宫颈癌hela细胞和tc-1细胞的光动力效果图；
34.图4为本发明实施例4的ldh@znpc纳米复合体对宫颈癌tc-1细胞的线粒体靶向效果图；
35.图5为本发明实施例5的ldh@znpc纳米复合体介导宫颈癌tc-1细胞焦亡；
36.图6为本发明实施例6的ldh@znpc纳米复合体诱导宫颈癌tc-1细胞免疫原性死亡；
37.图7为本发明实施例7的ldh@znpc纳米复合体对原发肿瘤的光动力治疗效果及光免疫效应对远端瘤的抑制作用。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
39.显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.需要理解的是：
41.术语“焦亡”，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin介导的细胞程序性坏死。
42.术语“肿瘤”，是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。
43.术语“制剂”，是以各类具有医研价值的碳基生物为原料，利用传统技术或现代生物技术制造，作用于人体各类生理症状的预防(保健)、治疗和诊断的各种形态制剂。包括生物制剂、药物制剂，其中生物制剂包括保健生物制剂：如乳酸钙、维生素d等；医用生物制剂：如疫苗等。药物制剂是按照一定的剂型要求所制成的，可以最终提供给用药对象使用的药
品。
44.术语“纳米复合体”，是以树脂、橡胶、陶瓷和金属等基体为连续相，以纳米尺寸的金属、半导体、刚性粒子和其他无机粒子、纤维、纳米碳管等改性为分散相，通过适当的制备方法将改性剂均匀性地分散于基体材料中，形成一相含有纳米尺寸材料的复合体系，这一体系材料称之为纳米复合材料。
45.对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
46.还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
47.下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
48.实施例1 ldh纳米材料的制备
49.在氮气保护下将含有mgcl2·
6h2o和alcl3·
9h2o的混合溶液缓慢加入naoh溶液中，室温下剧烈搅拌，得到的悬浊液于5000rpm离心5min，去离子水洗涤三次，去离子水重悬，置于水热釜中，100℃干燥箱中反应一定时间，离心(10000rpm，20min)收集，去离子水洗涤三次，得到胶状的ldh纳米材料。
50.本实施例制备的ldh纳米材料的tem图，如图1所示。
51.实施例2层状双氢氧化物-酞菁锌(ldh@znpc)纳米复合体的制备
52.将实施例1制备所得的ldh纳米材料均匀分散于dmso中，取znpc(5mg)溶于dmso(20ml)中，超声溶解后与上述ldh溶液混合，加入三乙胺将ph调节至碱性，在室温下搅拌一定时间。离心(9000rpm，20nim)收集，用dmso和去离子水分别洗涤3次，即得ldh@znpc纳米复合体。
53.本实施例制备的ldh@znpc纳米复合体的tem图，如图2所示。
54.实施例3 ldh@znpc纳米复合体对宫颈癌细胞的光动力治疗效果
55.实验分组：ldh( )为加入ldh纳米材料组；znpc( )为加入znpc组；ldh znpc( )为加入ldh纳米材料和znpc的物理混合物组；ldh@znpc( )为加入实施例2制备的ldh@znpc纳米复合体组。
56.实验方法：
57.将人源宫颈癌hela细胞、鼠源宫颈癌tc-1细胞分别以每孔3
×
103个的密度接种在两个96孔板上培养24h，加入不同浓度的本实施例的实验分组的材料(n＝4)，孵育24h后，用led灯(670nm，10mw/cm2)照射5min，细胞继续培养16h，每孔加入10μl cck-8溶液，进一步培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算肿瘤细胞存活率。
58.实验结果：
59.如图3所示，对照组和znpc组在光照后hela细胞和tc-1细胞的活力均保持正常；相比之下，光照后ldh@znpc的细胞毒性显著增强，当ldh@znpc剂量升至80ng/ml时，hela细胞和tc-1细胞几乎被完全根除。
60.实施例4 ldh@znpc纳米复合体对tc-1细胞的线粒体靶向效果
61.实验分组：znpc为加入znpc组；ldh@znpc为加入实施例2制备的ldh@znpc纳米复合体组。
62.实验方法：
63.将tc-1细胞以每孔8
×
104个的密度接种在35mm玻璃底培养皿上并培养24h。用本实施例的实验分组的材料分别处理细胞(n＝3)后孵育24h，用线粒体绿色荧光探针(mito-tracker green)标记线粒体，孵育20min后，细胞用pbs洗涤3次，用激光共聚焦显微镜观察ldh@znpc纳米复合体与线粒体共定位情况。
64.实验结果：
65.如图4所示，ldh@znpc纳米复合体与tc-1细胞共孵育24h后，ldh@znpc纳米复合体与tc-1细胞线粒体共定位系数达到0.91，表明ldh@znpc纳米复合体具有优异的线粒体靶向效果。
66.实施例5 ldh@znpc纳米复合体介导肿瘤细胞焦亡
67.实验分组：control( )为加入pbs组；ldh( )为加入ldh纳米材料组；znpc( )为加入znpc组；ldh znpc( )为加入ldh纳米材料和znpc的物理混合物组；ldh@znpc( )为加入实施例2制备的ldh@znpc纳米复合体组(znpc浓度为160ng/ml)。
68.实验方法：
69.将tc-1细胞以每孔8
×
104个的密度接种在35mm玻璃底培养皿上并培养24h。用本实施例的实验分组的材料处理细胞(n＝3)后孵育24h，用led灯(670nm，10mw/cm2)照射5min，细胞继续培养2h，用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。
70.实验结果：
71.如图5所示，在相同光照下用znpc或ldh和znpc的混合物处理后，只有单个细胞膨胀，细胞膜周围有多个小的气泡状突起(如箭头所示)；在ldh@znpc处理后，大多数细胞膨胀并从质膜中喷出或大或小的气泡(如箭头所示)，提示tc-1细胞的死亡方式为细胞焦亡。
72.实施例6 ldh@znpc纳米复合体诱导tc-1细胞免疫原性死亡
73.实验分组：control( )为加入pbs组；ldh为加入ldh纳米材料组；znpc( )为加入znpc组；ldh znpc( )为加入ldh纳米材料和znpc的物理混合物组；ldh@znpc( )为加入实施例2制备的ldh@znpc纳米复合体组(znpc浓度为160ng/ml)。
74.实验方法：
75.将tc-1细胞以每孔8
×
104的密度接种在35mm玻璃底培养皿上并培养24h。用本实施例的实验分组的材料处理细胞(n＝3)后孵育24h，用led灯(670nm，10mw/cm2)照射5min，细胞继续培养12h；pbs洗涤两次，4％多聚甲醛固定，0.5％triton x-100透化，然后用5％bsa封闭；将细胞与兔抗crt抗体或兔抗hmgb1抗体在4℃下孵育过夜。随后，将细胞用pbs洗涤3次，并分别与alexa fluor 488标记的驴抗兔二抗在25℃下孵育1h。细胞用pbs洗涤3次，用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度。
76.实验结果：
77.如图6所示，与其他组相比，ldh@znpc处理组表现出明显的表面crt暴露和hmgb1从细胞核中的释放，表明tc-1细胞发生免疫原性死亡。
78.实施例7 ldh@znpc纳米复合体对宫颈癌的光动力治疗效果和光免疫效应对远端肿瘤的抑制作用
79.实验方法：
80.建立c57bl/6小鼠双侧肿瘤模型：在第0天将1
×
106个tc-1细胞注射到右侧皮下组织模拟原发性肿瘤，在第6天将8
×
105个tc-1细胞注射到左侧皮下组织以模拟远端肿瘤。当
原发肿瘤体积达到50～100mm3时，实验组瘤内注射ldh@znpc纳米复合体(znpc给药剂量：0.3mg/kg)，对照组注射pbs，给药后24h，小鼠原发肿瘤用近红外激光灯照射一次(200mw/cm2，10min)。
81.实验结果：
82.如图7所示，对于原发瘤，光照后，ldh@znpc显著抑制肿瘤生长(肿瘤抑制率为40％)；对于未光照的远端肿瘤，ldh@znpc治疗组对远处肿瘤表现出有效的抑制作用。
83.在上述说明书的描述过程中：
84.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
85.最后应说明的是：
86.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
87.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。