一株苏云金芽孢杆菌B172及其应用

一株苏云金芽孢杆菌b172及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）b172及其应用，属于微生物和生物防治领域。


背景技术：

2.夜蛾科（noctuidae）隶属于鳞翅目（lepidoptera）夜蛾总科（noctuoidea），广泛分布在亚洲、欧洲、非洲和大洋洲等地区，是鳞翅目中物种数量最多的一个科，包含多种对农业生产具有极大破坏性的重大害虫，如甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫和粘虫等。此科昆虫大多具有食性杂、食量大、繁殖速度快、迁飞性强等特点，已给人类生产和生活密切相关的水稻、小麦、玉米、高粱、番茄、辣椒、大豆和马铃薯等多种农作物造成了较为严重的危害。因此，对该科害虫进行防控和减灾已迫在眉睫。长期以来，国内外防治夜蛾科害虫主要依赖化学农药，可以有效控制其种群数量的增长，起到了保护农业产业的有益作用。然而，随着化学农药滥用，不合理施用对土壤、水体等环境已造成了诸多负面影响，同时也在一定程度上直接导致害虫抗药性的产生。因此，探索新型环境友好病害防治方法已迫在眉睫。与人工合成的化学农药相比，运用天然病原细菌开发而来的细菌杀虫剂对害虫进行生物防治，具有杀虫特异性强、绿色环保、研发成本低等特点，是害虫绿色防控领域的重要方式，具备巨大的应用潜力。
3.苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis，简称bt）是一种自然界广泛分布的革兰阳性细菌，其主要特征是在菌体形成芽胞的同时，伴随有大量杀虫晶体蛋白（包括cry和cyt晶体蛋白）的产生，bt伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有毒杀作用。以bt作为微生物杀虫剂，具有高效专一、无毒、不污染环境等特点，被广泛应用于农业、林业和卫生害虫的防治。然而，随着以bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的大量使用及bt转基因抗虫植物的大规模推广，害虫抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实，现已发现至少有十几种昆虫对bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性。其主要原因在于，目前虽已分离并报到了多种bt亚种或血清型，但高毒力野生型菌株资源依然较少，导致以现有bt资源而开发而来的商品化的bt制剂菌种种类单一，难以承担在bt转基因抗虫植物大规模种植下对害虫进行有效防控的重任。因此，需要不断从野外分离出更多高毒力bt菌株来补充现有bt资源，筛选并分离出新的高毒力bt杀虫基因，丰富杀虫基因资源库，为转基因作物与工程菌株商业化提供新的基因来源，从而提高bt转基因产品的抗虫效果。因此，寻找新的bt资源对我国的生物防治有着十分重要的意义。


技术实现要素：

4.针对上述现有bt制剂易产生抗性而野生菌株资源短缺的问题，本发明的目的在于提供了一株对棉铃虫和粘虫有高效杀虫活性的野生型苏云金芽孢杆菌。
5.为了达到上述目的，本发明从湖南省浏阳市大围山镇山区丛林中采集大量土壤样品，集中对芽孢杆菌菌株进行筛选，对筛选出的芽孢杆菌进行编号命名和菌种保存，以棉铃
虫和粘虫为防治靶标，最终筛选到一株具有高效杀虫活性的芽孢杆菌菌株172。
6.所述菌株172，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16s rrna基因同源性分析，鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis），命名为苏云金芽孢杆菌菌株b172。保藏于中国湖北省武汉市武昌区八一路299号（武汉大学内）的中国典型培养物保藏中心（简称为cctcc），保藏日期是2022年3月7日，保藏编号为no：m 2022205。
7.本发明的苏云金芽孢杆菌b172在夜蛾科重大农业害虫防治中的应用，所属技术领域的生产技术人员，可以将该苏云金芽孢杆菌菌株b172制成微生物杀虫剂，用于防治夜蛾科重大农业害虫。
8.本发明还提供所述的一株苏云金芽孢杆菌在夜蛾科害虫防治中的应用。优选地，所述夜蛾科害虫选自甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫和粘虫中的至少一种。
9.更优选地，所述夜蛾科害虫选自棉铃虫和粘虫中的至少一种。
10.本发明还提供一种防治夜蛾科害虫的生物杀虫剂，其是以所述苏云金芽孢杆菌b172作为活性成分。
11.具体地，其是培养液发酵所述苏云金芽孢杆菌b172，离心后去上清液，获得的固体残留物即孢晶混合物。更具体地，培养液发酵培养3天，在8000 rpm/min的离心机上离心4 min，去掉上清液获得固体残留物即孢晶混合物，再以所述苏云金芽孢杆菌b172作为主要活性成分。
12.所述生物杀虫剂包含如本技术之一所述的苏云金芽孢杆菌b172。在一个具体实施方式中，所述生物杀虫剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述生物杀虫剂还可以包含与本技术的苏云金芽孢杆菌b172具有增效作用的其他物质。例如该物质可以是微生物来源诱导植物能够产生抗病的物质，也可以是诱导植物能够产生抗病的化合物，还可以是诱导植物能够产生抗病的其他微生物等等；再如该物质可以是微生物来源抑菌物质，也可以是抑菌化合物，还可以是具有抑菌作用的其他微生物等等。所述生物杀虫剂进一步可以包括与本技术的苏云金芽孢杆菌相配合的辅剂、增稠剂和分散剂中的至少一种，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、a1、a2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等中的至少一种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、qh凝胶、龙胶粉、f1、黄原胶等中的至少一种：分散剂有拉开粉、nno、lfs、b1、碳黑等中的至少一种。
13.在一个具体实施方式中，所述生物杀虫剂的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明的苏云金芽孢杆菌菌株b172是从湖南省浏阳市大围山镇山区丛林的非耕作土壤中分离而得，通过形态学观察和分子鉴定，最终确定为苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis b172；其次，申请人还测定了其对农业重大害虫棉铃虫和粘虫的毒力，经测定发现本发明的苏云金芽孢杆菌菌株b172对夜蛾科重大农业害虫具有较高致病力，可有效杀死夜蛾科重大农业害虫。在现有bt制剂可用的野生菌株相对匮乏的情况下，本发明的b172菌株是对bt生防菌野生资源的又一补充。
15.（2）本发明的苏云金芽孢杆菌菌株b172是一株在棉铃虫和粘虫的防治上具有潜在意义的生物防治菌株，可开发成微生物杀虫剂，为夜蛾科重大农业害虫的绿色高效防控提供技术支撑。
16.本发明菌株bacillus thuringiensisstrainb172，保藏编号为cctcc no：m 2022205，保藏日期为2022年3月7日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址为中国武汉武汉大学，经检测，存活。
17.附图说明
18.图1为b172菌株菌落形态正面图；图2为b172菌株菌落形态背面图；图3为b172菌株在30℃生长稳定不同ph环境下的吸光度；图4为b172菌株在中性条件下生长稳定不同温度的吸光度；图5为b172菌株16s rrna序列进化树。
19.具体实施方式
20.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果做进一步清晰、完整地描述，以达充分理解本发明的目的、特征和效果，是对本发明的补充解释而不是限定。所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
21.下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到相关的试剂和材料。
22.实施例1：菌株b172的分离、培养与鉴定1. 菌株的分离本发明苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）b172分离、纯化的方法为：选取湖南省浏阳市大围山镇山区丛林土壤，采样时选择深度为5-10cm左右的非耕作区土壤，用铁锹铲除表层土壤约1cm左右，以去除土壤表面杂质，收集3-5个不同位置的土样约100 g，充分混匀后，放入一个无污染的自封袋，并做好相关的采集记录（土壤编号、采样地点、经纬度、采样日期等）。称取5 g土样装入50 ml醋酸钠液体培养基中，在漩涡震荡器上震荡1-3 min，将土样充分打碎；使用200 rpm/min、30 ℃摇床培养4 h后，将土样-培养基混合物于80 ℃烘箱中热处理30 min，待高温杀死杂菌后，静置冷却。在超净工作台中，取1 ml上清液分别稀释成10、102、103三个浓度梯度的土壤悬液，吸取100 μl稀释好的上清液至lb固体培养基上，以同一方向画圈的方式进行涂布，涂布均匀后于30 ℃条件下培养72h以上，观察待用。
23.将上述已培养完毕的平板在超净工作台中完成细菌菌株的分离及纯化工作。根据菌株的形态、直径大小、颜色、粘稠度等将不同类型的菌株在lb固体培养基上进行四区划线分离纯化；反复重复，直至出现单菌落斑点，再将菌株转移至lb液体培养基中，于30 ℃、200 rpm/min摇床上培养72 h后得到单一菌株菌液。
24.将上述已经分离出的单个菌株再次划线于lb固体平板上，30 ℃恒温箱中培养48 h以上，待观察到大量菌斑形成时，即可置于4℃冰箱进行保存（见图1）。复苏时，挑取平板上的单一菌斑转移至5ml的lb液体培养基中，在200 rpm/min、30 ℃摇床培养即可完成活化。
25.2. 活性菌株的筛选饲料的准备：切取大小一致的人工饲料放入高温灭菌处理过的试管中，加入上述培养好的菌液，使菌液与饲料充分混匀，再将混匀后的饲料铺在干净的报纸上晾干；晾干后，分别分装于24孔养虫板（24孔养虫板经提前灭菌处理）中待用；并使用未经菌液处理的饲料作为对照，以校正虫体的死亡率。
26.初筛：用毛笔轻柔的蘸取实验室饲养的1-2龄的粘虫幼虫至装有菌液处理的饲料的养虫板中，以未经菌液处理的饲料作为空白对照，每孔注入20头，置于27 ℃、相对湿度60%-70%、光照16l：8d的恒温光照培养箱中，每天观察虫体状态，记录幼虫死亡数量，3天后计算死亡率，校正死亡率。
27.复筛：用镊子小心挑取实验室饲养的3龄粘虫幼虫至放有菌液处理的饲料的养虫板中，未经菌液处理的饲料作为空白对照。每孔注入20头，分别设置3个重复，其余培养条件和初筛的一致，每天观察虫体状态，记录幼虫死亡数量，3天后计算死亡率，校正死亡率。获得具有高杀虫毒力的菌株用于后续实验。
28.校正死亡率=（处理组死亡率－对照组死亡率）/（1－对照组死亡率）本发明从土壤样品中共分离获得455株菌株，以室内饲养的较为敏感的棉铃虫幼虫作为靶标昆虫进行了生物活性初筛，初步筛选出高杀虫活性的芽孢杆菌菌株4株（见表1）。对3龄粘虫幼虫进行生物活性测定实验结果表明：菌株172对3龄粘虫幼虫有毒杀作用最强，3天后校正死亡率为40%，而菌株58对3龄粘虫幼虫无明显的毒杀作用（见表1）。
29.表1 四株菌株对1-2龄棉铃虫幼虫和3龄粘虫幼虫的杀虫活性3. 菌株b172的鉴定1）菌株172最佳温度和ph测定将已分离出的菌株172接种于lb固体培养基上，分别采用1mol/l naoh和1mol/l hcl调节ph并设置3、5、7、9、11五个ph梯度，每个梯度设置3个重复，置于30 ℃恒温箱内培养72h，每隔8h观察记录菌株的生长情况并采用酶标仪测定其吸光度。结果发现菌株172在培养40h时，生长速度放缓，生长基本达到稳定，其40h测定的吸光度如图3所示。由图3可以看出，菌株172在中性环境中生长较好，最适ph为7。
30.再将已分离出的菌株172接种于中性的lb固体培养基上，分别置于20、25、30、35、40℃五个温度梯度恒温箱内培养72h，每个梯度设置3个重复，每隔8h观察记录菌株的生长情况并采用酶标仪测定其吸光度。结果发现菌株172在培养24h时，菌株生长速度迅猛，呈指数型增长，24h之后，生长速度放缓，其40h后基本达到平衡。菌株172在培养24h测定的吸光度如图4所示。由图4可以看出，菌株172在温度35℃长势最好。
31.2）菌体形态及培养特征观察及生理生化指标测定置于35 ℃恒温箱内培养三天，观察并记录菌株群落特征；同时挑取适量菌落进行革兰氏染色；生理生化指标测定参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）和《微生物学实验手册》的有关实验方法进行菌株172的生理生化特性鉴定。
32.如图1和图2所示，菌株172在普通lb固体培养基上菌体细胞呈杆状，菌落白色且形态呈圆形，中间微隆起，边缘缺刻。该菌株的生理生化鉴定结果如表3所示。
33.由表2可见，菌株172为革兰氏阳性菌，生理生化特征及形态特征符合《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌鉴定手册》中苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）的分类标准。
34.表2菌株172生理生化特性鉴定结果注：“ ”表示阳性反应，
“‑”
表示阴性反应3）分子生物学鉴定具体实施过程：从lb平板上挑取单菌落，转接到含有1.2 ml lb液体培养基的1.5 ml ep管中，20℃，200 rpm/min，振荡培养24h后，使用细菌基因组dna提取试剂盒，按操作步骤进行菌株172总dna的提取。将提取的总dna进行质检，质检合格后，送至北京贝瑞和康生物技术有限公司进行高通量测序。
35.从测序平台下机获得的原始数据中包含接头或低质量的reads，为了提高测序数据的质量，利用fastqc软件对原始数据进行质控分析，随后采用fastp软件对原始数据进行质控从而获得高质量的clean reads。采用unicycler软件对质控后的数据进行基因组组装，获得scaffolds基因组草图，并用bakta软件对基因组草图进行注释；从带有注释的基因
组上提取出16s rrna。
36.采用ncbi 网站上的 basic blast对所测得的16s rrna序列进行同源性比对，挑选同源性较高的序列在mega x中比对并构建系统nj树，结果如图5所示。
37.由系统进化树可以看出，菌株172与bacillus thuringiensis同属一个遗传分枝且有较高支持度。结合形态特征及生理生化试验，确定菌株172为苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis），分类命名为bacillus thuringiensis strain b172，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 2022205，保藏日期为2022年3月7日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
38.实施例2：菌株b172的杀虫活性具体实施过程为：从lb平板上挑取单菌落，接种到5 ml的lb液体培养基中，在35 ℃、200 rpm条件下活化培养12h后，按照1%的接种量再将菌株转移到200 ml液体培养基中，3天后取出培养液，在8000 rpm/min的离心机上离心4 min，去掉上清液并称量固体残留物（孢晶混合物）的质量；将孢晶混合物按照不同质量分别加入培养基，稀释后获得10 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml、200 mg/ml、500 mg/ml、1000 mg/ml六个浓度梯度的孢子液，用孢子液处理饲料并确保饲料均均匀粘附孢子液后晾干；再将晾好的饲料放至24孔养虫板中，用镊子小心挑取实验室饲养的3龄粘虫和棉铃虫幼虫至放有菌液处理的饲料的养虫板中，以未经菌液处理的饲料作为空白对照，分别重复三次，每天观察幼虫存活情况，3天后统计不同药液浓度梯度下幼虫死亡率，并利用spss软件计算每天的致死浓度量。
39.表3菌株b172对粘虫的活性测定表3显示了菌株b172对三龄粘虫和棉铃虫幼虫生物活性测定结果。由此可知，菌株b172在第三天时对靶标害虫的毒力最高，对粘虫的lc50值分别为18.36 mg/ml、lc95为66.08 mg/ml；对棉铃虫的lc50分别为51.88 mg/ml、lc95值为570.27 mg/ml。
40.综上，本发明的苏云金芽孢杆菌（bacillus thuringiensis）b172菌株对农业重大害虫棉铃虫和粘虫均表现出较强烈抑制作用，同时兼顾环境友好型，不会引起生态环境的二次污染。本发明的苏云金芽孢杆菌b172菌株适用于对农业重大害虫棉铃虫和粘虫进行生物防治，是在现阶段可用的bt野生菌株匮乏的情况下对bt资源的又一补充。
41.虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发
明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。