桑根酮C在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用

桑根酮c在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于药物应用领域，特别涉及一种桑根酮c在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。


背景技术：

2.脑瘤是最常见的原发性恶性肿瘤，大多呈浸润性生长，生长速度快，与周围组织分界不清，具有较强的侵袭能力。其中，胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,gbm)为脑瘤最恶性的形式(who分类为iv级)，是最具侵袭性和不可治愈的脑瘤类型，也是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤；其预后极差，5年生存率《10％，中位生存期约为15个月，改善gbm患者的生存预后是人类迄今尚未攻克的难题。最新的研究数据显示，我国恶性肿瘤死亡病例增至271.19万例/年，死亡粗率为190.66/10万。脑瘤位于全国恶性肿瘤发病率第9位，死亡率第8位。临床上对脑瘤的治疗仍以手术切除为主，辅以放射治疗及化学治疗，而免疫治疗效果尚不确定。目前，临床上广泛使用的化疗药物疗效有限，毒性作用较大，易发生耐药。因此，对于低毒高效的化疗药物的研发需求仍然是一个相当迫切且严峻的挑战。
3.中药因其天然低毒广受青睐，从传统中药提取的抗肿瘤药物如紫杉醇、喜树碱等药物已在临床上广泛应用。我们实验室也一直致力于治疗脑瘤的中药单体的筛选。因此，从中寻找抗肿瘤活性成分是肿瘤化疗药物研发的重要来源，这也是当今肿瘤治疗研究领域的热点之一。
4.中国是蚕桑业的起源地，桑科植物在中国也具有悠久的栽培历史，其多个部位都具有较好的入药价值。桑根酮c(sanggenon c,san c)是一类从桑科植物中提取的黄酮类化合物，主要存在于其根部。桑根酮c在中药桑白皮中含量丰富，具有抗炎、降血脂、抗氧化等药理作用，但其抗肿瘤活性方面的报道不多。目前，桑根酮c在人前列腺癌细胞pc3、人结肠癌细胞ht-29人白血病细胞k562进行初步的抗肿瘤活性的研究，但在胶质母细胞瘤中还发现有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种桑根酮c在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用，为临床治疗神经胶质细胞瘤提供候选靶标药物，同时也为研发高附加值的蚕桑产物提供参考。
6.本发明的技术方案是：
7.桑根酮c在制备治疗脑瘤药物中的应用。
8.所述脑瘤为胶质母细胞瘤。
9.所述桑根酮c抑制胶质瘤细胞系u-87mg和ln-229的生长增殖。
10.所述桑根酮c通过kdm4b调控myc信号通路抑制周期蛋白的表达。
11.所述桑根酮c的浓度为10μmol
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l-1
～20μmol
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。
12.本发明所述桑根酮c存在于桑树的根、枝干中以及大量存在于中药桑白皮中。桑根酮c系桑属植物中的黄酮类的diels-akder加合物，其属于查耳酮与异戊二烯基黄酮(或异
戊二烯基黄酮醇)的加合物(参见图1)；该类加合物具有较好的生物活性，例如抗菌、抗病毒、抗高血压、抗氧化和抗肿瘤等作用，本发明所述桑根酮c是常用的中药材，安全性较高。纯品的桑根酮c为淡黄色粉末状化合物，性质稳定，可溶于甲醇、乙醇、丙酮和dmso，但难溶于水，苯、氯仿等。
13.申请人采用mtt实验、brdu标记实验检测san c对胶质母细胞瘤细胞生长增殖能力的影响；采用流式细胞术检测san c对肿瘤细胞周期的影响；采用软琼脂实验检测san c对肿瘤细胞形成克隆和自我更新能力的影响；采用western blot和生物信息学分析初步探究san c的抗肿瘤活性的作用机制。申请人实验验证，在san c的作用下，mtt实验表明桑根酮c以剂量和时间依赖性的方式显著地抑制肿瘤细胞的生长增殖；brdu标记实验显示桑根酮c可显著减弱肿瘤细胞核内dna复制的活性；流式细胞术则证实桑根酮c将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于g0/g1期；软琼脂克隆形成实验揭示桑根酮c显著减弱肿瘤细胞的克隆形成和自我更新的能力；gsea基因富集分析表明桑根酮c通过影响myc信号通路进而抑制肿瘤细胞分裂周期；western实验表明桑根酮c是通过kdm4b调控myc信号通路抑制周期蛋白的表达，最终抑制神经胶质母细胞瘤细胞的生长增殖和自我更新。
14.因此，桑根酮c可通过靶标kdm4b-myc轴抑制神经胶质母细胞瘤细胞生长增殖和自我更新的能力，表现出其具有抗肿瘤活性。
附图说明
15.图1为桑白皮和桑根酮c的化学结构示意图，其中，a.中药桑白皮；b.桑根酮c分子化学式的示意图；
16.图2为桑根酮c抑制gbm细胞的生长增殖，其中，a.经不同浓度san c处理后ln-229细胞的生长曲线；b.经不同浓度san c处理后u87 mg细胞的生长曲线；
17.注：与未加药的dmso组相比，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001.；
18.图3为桑根酮c抑制gbm细胞的核内复制活性，其中a为经san c处理48h后u87 mg细胞的细胞核内dna复制的状况及统计分析；b而经san c处理48h后ln-229细胞的细胞核内dna复制的状况及统计分析；
19.图4为桑根酮c阻滞gbm细胞周期于g0/g1期，其中，a为经san c处理48h后u87 mg细胞的细胞周期分布状况及统计分析；b为经san c处理48h后ln-229细胞的细胞周期分布状况及统计分析；
20.图5为桑根酮c抑制gbm细胞的自我更新能力，其中a.经san c处理后u87 mg细胞的软琼脂克隆形成状况及统计分析；b.经san c处理后ln-229细胞的软琼脂克隆形成状况及统计分析；
21.图6桑根酮c抑制gbm细胞周期的分子机制，其中，a.采用western blot检测san c对细胞周期相关蛋白的影响；b.采用western blot检测san c影响myc信号通路的作用机制。
具体实施方式
22.一.试剂和材料
23.人gbm细胞系ln-229，u87mg(美国型培养物收藏atcc，usa)；
24.桑根酮c(sanggenon c，宝鸡辰光生物科技有限公司)；
25.dmem高糖基础培养基(上海生工06-1055-57-1acs)；甲醇(上海生工，a506806)；多聚甲醛(上海生工生物工程有限公司，e672002-0500)；
26.胎牛血清fbs(thermo fisher，10099-141)；青霉素/链霉素(thermo fisher，15070063)；胰蛋白酶(thermo fisher，25300120)；
27.二甲基亚砜(dmso)(sigma，v900090)；
28.mtt(上海碧云天生物技术有限公司，c0009)；dapi染色液(上海碧云天生物技术有限公司，c1005)；bsa(上海碧云天生物技术有限公司，st023)；一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司，p0023a)；5
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loading buffer(上海碧云天生物技术有限公司，p0015)；bca蛋白质浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，p0010s)；hrp山羊抗兔igg(h l)(上海碧云天生物技术有限公司，a0208)；hrp山羊抗小鼠igg(h l)(上海碧云天生物技术有限公司，a0216)；
29.brdu(sigma，b5002)；碘化丙啶(sigma，p4864)；
30.transwell小室(corning，3422)；matrigel(corning，356234)；
31.脱脂奶粉(biofroxx，1172gr5000；
32.聚偏二氟乙烯膜(roche，3010040001)；
33.蛋白质marker(bio-rad，161-0394)；
34.兔抗人kdm4b抗体(cst，8639s)；
35.小鼠抗人tubulin抗体(武汉三鹰，66031-1-ig)；小鼠抗人h3k9me3抗体(武汉三鹰，39286)；mmp2抗体(武汉三鹰，10373-2-ap)；
36.snail兔抗(cell signaling，3879)；e-cadherin兔抗(cell signaling，3195)；n-cadherin兔抗(cell signaling，13116)；c-myc兔抗(cell signaling，18583)。
37.二.具体实施方法
38.实施例1药物的配置
39.将桑根酮c放入二甲基亚砜(dmso试剂中进行溶解，溶解均匀后，储存于-80℃冰箱备用，储存浓度为50mmol
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40.实施例2细胞培养
41.将冷冻的状态良好的人gbm细胞系ln-229和u87 mg细胞，从液氮罐中取出，迅速放入提前预热至37℃的水浴锅中2-3min，待细胞液完全融化后离心去除冻存液后，转移至含有10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃、5％co2培养箱中培养,并定期观察细胞。
42.实施例3 mtt测定法检测细胞增殖
43.取对数生长期的ln-229和u87 mg细胞以2 000个细胞/孔接种到96孔板中。37℃恒温培养箱内培养24h，待细胞贴壁后，以指定浓度的桑根酮c(0、10、15、25μmol
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)继续孵育0、1、2、3、4、5d，每孔加入20μl mtt，37℃下孵育4h；将培养基吸尽后每孔加入150μl dmso溶解甲臜。然后将96孔板放在酶标仪上检测波长560nm时的吸光度(a)，所有数据采集完毕后，在graphpad软件中作图分析。实验结果显示，桑根酮c对u-87mg和ln-229细胞系均有抑制生长作用，且呈现出药物浓度和处理时间依赖性(参见图2)。在u-87mg和ln-229细胞系中，10μmol
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的桑根酮c均可显著的抑制现象，u-87mg细胞需要处理5d，而ln-229细胞只需要处理4d；15μmol
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和20μmol
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的桑根酮c对神经胶质母细胞瘤细胞系u-87mg和
ln-229均具有几乎同样的抑制作用。
44.后续实验中均采用10μmol
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和15μmol
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浓度梯度进行药物实验。
45.实施例4 brdu标记实验
46.将生长状态良好的ln-229和u87 mg细胞消化重悬，以20 000个/孔的密度接种到24孔板中，使其过夜贴壁。用10μmol
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和15μmol
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的桑根酮c进行加药处理，对照组加入含同浓度的dmso培养基，培养48h后，每孔按照1：100的比例加入brdu(5-bromodeoxyuridinc)于培养箱继续孵育2h，孵育结束后用4％多聚甲醛固定细胞15min，然后用0.3％triton x-100处理20min。每孔加入500μl 10％山羊血清于37℃培养箱中封闭1h。吸出血清，每孔加入500μlbrdu一抗，置于4℃冰箱孵育过夜，次日回收一抗，pbs摇洗3次，每次10min，再向每孔中加入200μl稀释好的二抗，避光孵育2h；用pbs以1：500的比例对dapi进行稀释,每孔200μl，细胞核染色30min后，在荧光显微镜下进行荧光信号的观察与拍照。
47.本实施例采用10μmol
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和15μmol
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浓度梯度的桑根酮c对u-87mg和ln-229细胞处理48h后，再进行brdu和dapi双染实验。实验结果显示，u-87mg的dmso组的阳性率，与10μmol
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组和15μmol
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组的阳性率相比，分别具有极显著性差异(p《0.001，见图3a)；同样地，ln-229的dmso组的阳性率，与10μmol
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组和15μmol
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组的阳性率相比，都具有极显著性差异(p《0.001，见图3b)。实验结果证实了桑根酮c可显著抑制神经胶质母细胞瘤u-87mg和ln-229细胞增殖期的核内dna复制活性。
48.因此，桑根酮c影响神经胶质母细胞瘤细胞的分裂周期。
49.实施例5流式细胞术检测细胞周期实验
50.采用流式细胞术对药物处理后的细胞进行周期检测。观察细胞状态，在ln-229和u87 mg细胞长至60％左右时，用10μmol
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和15μmol
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浓度的桑根酮c进行加药处理，空白对照组加入同等浓度的dmso，置于5％co2培养箱中连续培养48h后，胰酶消化收集细胞，再加入1ml 75％的乙醇重悬，放4℃冰箱静置固定24h。固定完成后，800rpm、4℃条件下离心5min，弃上清，用pbs轻轻清洗2次，每次在相同条件下离心。避光条件下将pi和rnase分别加入pbs中配制成细胞周期检测试剂。每管细胞加入200μl该试剂，并轻轻重悬。于37℃孵育30min后用流式细胞仪检测细胞周期，收集结果并分析。
51.实验结果显示，10μmol
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l-1和15μmol
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l-1浓度梯度的桑根酮c处理48h后，u-87mg和ln-229细胞的细胞周期均被阻滞于g0/g1期(见图4)。经过统计分析，在u-87mg细胞中，dmso组处于g0/g1期的细胞数量与10μmol
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l-1
组的相比，具有极显著性差异(p《0.01)，而与15μmol
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l-1组的相比具有极其显著性差异(p《0.001，图4a)；在ln-229细胞中，dmso组处于g0/g1期的细胞数量与10μmol
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组和15μmol
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l-1组的相比，均具有极其显著性差异(p《0.001，图4b)。实验数据显示实验组的g0/g1期的细胞数量均显著多于对照组的，而s期和g2/m期的细胞数量则均显著少于对照组的。
52.因此，桑根酮c通过阻滞肿瘤细胞由g0/g1期向s期的转化，进而抑制肿瘤细胞生长增殖。
53.实施例6 western blot实验
54.收集用不同浓度的桑根酮c(10、15μmol
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)处理48h的细胞，空白对照组加入同等浓度的dmso，用ripa裂解液裂解细胞30min；4℃和12 000rpm离心15min，然后取细胞上清
液于新的离心管中，置于冰上进行蛋白浓度测定。根据蛋白浓度分装蛋白，100℃水浴锅煮蛋白15min得到细胞蛋白样品。按照每孔上样30μg蛋白进行sds-page凝胶电泳，然后再将凝胶中的蛋白湿转到pvdf膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜，tbst洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育2h,tbst洗膜3次，每次10min，使用ecl发光液显色,凝胶成像系统成像。
55.实施例7软琼脂实验
56.将1.5ml的1.2％agarose溶液和1.5ml的2
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dmem培养基混匀后，迅速向六孔板中的两个孔中分别加入1ml混合液，均匀覆盖后静置待其凝固，以此类推，将所需要的孔铺上溶液，平放在室温下缓缓凝固，下层胶制备完成。凝固期间，取对数生长期的ln-229和u87 mg细胞进行消化重悬。取1.5ml的含有桑根酮c的2
×
dmem培养基与1.5ml的1.2％agarose溶液迅速混匀，再加入3ml细胞悬液迅速混匀，按每孔1.5ml加到下层琼脂上，待琼脂培养基完全凝固后将细胞板放入培养箱，孵育15天。取出6孔板于倒置显微镜下观察单细胞克隆群，随机选择视野并拍照，然后加入mtt进行染色，细胞培养箱中再孵育30min后置于扫描仪上扫描。
57.采用soft agar assay检测；采用0、10、15μmol
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三个不同浓度的桑根酮c对神经胶质母细胞瘤细胞自我更新能力的影响。结果显示，在u-87mg细胞中，dmso组形成的克隆数量与10μmol
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组和15μmol
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l-1组的相比，均具有极其显著性差异(p《0.001，见图5a)；相似地，在ln-229细胞中，dmso组形成的克隆数量与10μmol
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组和15μmol
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l-1组的相比，均具有极其显著性差异(p《0.001，见图5b)
58.实验结果：桑根酮c处理后的肿瘤细胞，形成的克隆数量和体积明显减小，且呈现浓度依赖性。
59.因此，桑根酮c可显著抑制胶质母细胞瘤的克隆形成能力和自我更新的能力。
60.实施例8桑根酮c抑制胶质瘤细胞活性的分子机制
61.采用western blot实验检测经过不同浓度桑根酮c处理48h后的周期相关蛋白的变化，尤其是g0/g1期向s期转化过程中的周期蛋白。实验结果显示，经过桑根酮c处理后，细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和细胞周期蛋白cyclin e1均有显著的下调，而细胞周期蛋白，而细胞周期蛋白依赖性激酶cdk6和细胞周期蛋白cyclin d1则无显著变化(图6a)。
62.同样地，western blot实验结果显示，经过桑根酮c处理后，myc的表达量显著地降低。另外，实验结果还揭示桑根酮c可显著抑制组蛋白去甲基化酶kdm4b的表达，同时上调组蛋白h3k9me3的水平(图6b)。因此，桑根酮c通过抑制kdm4b的表达，进而上调了h3k9me3的水平，抑制c-myc的表达，最终达到抑制肿瘤细胞增殖和自我更新的能力。
63.本发明实施例采用graphpad软件进行实验数据分析，采用student t-test进行统计学分析，数据均表示为以p《0.05为差异具有统计学意义。