一类新型的二氢查尔酮类化合物、制备方法及医药用途

1.本发明涉及药物化学，特别涉及一类新型的二氢查尔酮类化合物、制备方法及医药用途。


背景技术：

2.黑色素是一种动植物中存在的一种生物色素，主要负责人的皮肤、眼睛和头发的色素沉着，它决定了我们的种族和表型外观。黑色素在保护人类皮肤免受紫外线辐射的有害影响以及清除有毒药物和化学药品的影响方面起着重要作用。然而，黑色素的过量累积会引起诸多皮肤病问题，例如雀斑、日晒斑疹和黄褐斑，以及癌症和炎后黑皮病等。此外，多个研究报告表明，黑色素生成障碍与神经退行性疾病有关，包括帕金森症，阿尔茨海默症和亨廷顿病。
3.黑色素生成涉及复杂的合成途径，包括酶和化学催化反应的结合，其中酪氨酸酶为黑色素合成过程中的关键限速酶。在黑色素合成过程中，酪氨酸酶的活性位点处于三种状态，分别为还原态(met)、氧化态(oxy)以及去氧化态(deoxy)，它们的主要区别在于铜离子的氧化态不同。在单酚氧化酶活性中(l-酪氨酸被氧化为l-dopa)，脱氧酪氨酸酶(e
deoxy
)与氧气结合形成氧化态酪氨酸酶(e
oxy
)，然后e
oxy
与l-酪氨酸结合，进一步催化生成l-dopa。在此过程中，酪氨酸酶最终以e
deoxy
的形式循环进一步与两个氧原子结合。在双酚氧化酶活性中(l-dopa被氧化为dq)，e
oxy
失去一个氧原子，形成还原态酪氨酸酶(e
met
)，在活性位点，两个紧邻的铜离子由水(羟基)配体桥连。酪氨酸酶主要以e
met
形式存在，其不能氧化单酚类化合物如l-酪氨酸，需要在酪氨酸氧化开始之前通过l-dopa将其还原为e
deoxy
。这表明e
met
对l-dopa的亲和力更高，因此e
met
被视为发现酪氨酸酶抑制剂的重要靶标。酪氨酸酶不仅在黑色素合成中起限速酶作用，而且仅由黑色素细胞表达，故靶向酪氨酸酶可抑制细胞中黑色素的生成而没有毒副作用，因此，靶向酪氨酸酶是寻找发现黑色素生成抑制剂的有效策略。
4.目前已经发现了大量的天然或合成来源的酪氨酸酶抑制剂，这些美白药物，如氢醌、熊果苷、曲酸、l-抗坏血酸、壬二酸以及鞣花酸等被广泛用于化妆工业中。越来越多的研究者进行具有成药性的酪氨酸酶抑制剂的研发。由于从双孢蘑菇中提取的酪氨酸酶(mtyr)纯度较高，性质稳定，且商业可得，因此常被用作人类酪氨酸酶的模型，用于筛选酪氨酸酶抑制剂。目前已经研发了大量的具有酪氨酸酶抑制活性的化合物，从结构来看，可以分为白藜芦醇类似物、苯硫脲类似物、多肽类、联苯类化合物以及黄酮类化合物等。氢醌对哺乳动物细胞有毒，会产生一系列的副作用，包括接触性皮炎，刺激性和栗子斑等，欧盟已经禁止氢醌作为美白药物。曲酸存在致癌性和不稳定性问题，l-抗坏血酸易降解，鞣花酸的生物利用度差，由于这些缺点使他们的应用受到诸多限制。
5.本发明基于间苯二酚的结构，发现了一种具有酪氨酸酶抑制活性的二氢查尔酮类衍生物，在抑制黑色素累积方面具有很大的应用潜力。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的是提供一类具有酪氨酸酶抑制能力、抑制黑色素过度累积能力的新型的二氢查尔酮类化合物。
7.本发明的另一目的是提供所述新型的二氢查尔酮类化合物的制备方法及用途。
8.技术方案：所述的通式i所示的新型的二氢查尔酮类化合物或其药学上可接受的盐：
[0009][0010]
其中：
[0011]
r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7各自独立地选自氢、c
1-c4的烷基、苯基、甲氧基、卤素、三氟甲基、硝基、氰基、酯基、酰胺基、羧基、醛基或羟基；
[0012]
x选自co、so、so2、seo或seo2；
[0013]
所述卤素为f、cl、br或i。
[0014]
进一步地，
[0015]
r1选自氢、甲基、羟基、卤素；
[0016]
r2选自氢、甲基、羟基、甲氧基；
[0017]
r3选自氢、羟基、甲氧基、卤素、异丙基、苯基；
[0018]
r4选自氢、甲基、羟基、甲氧基；
[0019]
r5选自氢、羟基、甲氧基、硝基；
[0020]
r6选自氢、羟基、甲氧基；
[0021]
r7选自氢、甲氧基；
[0022]
x选自co；
[0023]
所述卤素为f、cl、br或i。
[0024]
进一步地，本发明的通式i的化合物优选为如下具体化合物：
[0025][0026]
[0027]
本发明通式i所示的化合物可用下列方法制备得到：
[0028][0029]
其中，r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7与上文通式i中的定义相同。
[0030]
包括以下步骤：
[0031]
步骤a：不同取代的苯乙酮(若含有酚羟基则需用苄基保护)与不同取代的苯甲醛(若含有酚羟基则需用苄基保护)在氢氧化钠的作用下，于无水乙醇溶液中回流2-4h，用薄层色谱板检测反应，当反应完全后，在减压条件下将乙醇旋干，用乙酸乙酯萃取，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后减压条件下除去溶剂，用石油醚/乙酸乙酯进行柱层析色谱法纯化粗品，生成中间体(iii)。
[0032]
所述酚羟基的苄基保护步骤为，将需要保护的苯甲醛或苯乙酮溶于甲醇中，向其中加入碳酸钾(当量由需要保护的酚羟基数目决定，保护一个酚羟基加入1.5当量的碳酸钾)和溴苄(当量由需要保护的酚羟基数目决定，保护一个酚羟基加入2当量的溴苄)，然后在80℃下回流搅拌2h，通过tlc板检测反应，反应完全时，在减压条件下去除溶剂甲醇，用乙酸乙酯萃取，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，然后在减压条件下除去溶剂，用石油醚/乙酸乙酯进行柱层析色谱法纯化粗品，得到相应的中间体(i)或(ii)。
[0033]
步骤b：将中间体(iii)溶于乙醇中，向其中加入联硼酸频那醇酯(3当量)和碳酸铯(0.2当量)，在120-150℃条件下反应12-24h，反应液逐渐由黄色变为透明。用薄层色谱板监测反应，当反应结束后，将密封管从油浴中取出，冷却到室温。如有白色固体析出，直接抽滤，冷乙醇洗，烘干即得到化合物。如果无固体析出，则在减压条件下将乙醇旋干，乙酸乙酯萃取，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压条件下除去溶剂，用石油醚/乙酸乙酯进行柱层析色谱法纯化粗品，得到中间体(iv)。
[0034]
步骤c(若中间体含有苄基保护的酚羟基)：向两颈瓶中加入中间体(iv)和五甲基苯(当量由需要脱除的苄基数目决定，脱除一个苄基加入1.5当量的五甲基苯)，用干燥的二氯甲烷溶解反应物，并用氩气置换掉反应瓶中的空气。在0℃(中间体不含甲氧基)或者-78℃(中间体含甲氧基)，氩气保护下，将1m三氯化硼(当量由需要脱除的苄基数目决定，脱除一个苄基加入1.5当量的三氯化硼)注射入反应瓶中，反应液变为橙色，反应20min，用薄层色谱监测反应，若反应完全，向其中加入水淬灭反应，旋干二氯甲烷，用乙酸乙酯萃取，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压条件下除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇进行柱层析色谱法纯化粗品，得到目标化合物(v)。
[0035]
本技术公开的化合物或其可药用的盐在制备酪氨酸酶靶点抑制剂药物中的应用。
[0036]
本技术公开的化合物或其可药用的盐在制备治疗黑色素过度积累导致的疾病的药物中的应用也在本发明的保护范围内。
[0037]
所述黑色素过度积累导致的疾病属于但不限于雀斑、日晒斑疹、黄褐斑、皮肤癌或炎后黑皮病等疾病。
[0038]
本发明还公开了一种药物组合物，其包含化合物i及药学上可接受的载体。
[0039]
所述药物组合物在制备酪氨酸靶点抑制剂药物中的应用，以及在制备治疗黑色素过度积累导致的疾病的药物中的应用也在本发明的保护范围内。
[0040]
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
[0041]
本技术所述的二氢查尔酮类衍生物为一类具有全新骨架结构的化合物，其创新性地运用药效团融合策略，引入含间苯二酚单元的二氢查尔酮类结构，首次实现了该类骨架结构在抑制酪氨酸酶以起到抑制黑色素过度累积的作用。通过药理实验可见，所述二氢查尔酮类衍生物对于酪氨酸酶具有明显的抑制作用。其中14个化合物的酪氨酸酶抑制活性优于阳性对照曲酸，ic
50
达到纳摩尔水平。化合物3和13显示出最优的酪氨酸酶抑制活性，ic
50
分别为0.05μm和0.054μm(底物为酪氨酸时)。动力学分析和对接研究表明，化合物3和13通过作用于活性位点以外的氨基酸残基发挥酪氨酸酶抑制活性，为非竞争型抑制剂。进一步的实验结果表明，化合物3和13具有中等的抗氧化活性和较低的细胞毒性，能剂量依赖性地抑制b16f10细胞内的酪氨酸酶活性和黑色素生成。综上所述，化合物3和13可作为低毒有效的酪氨酸酶抑制剂进一步开展后续研究。
[0042]
说明书附图
[0043]
图1为化合物3和13在经α-msh刺激的b16f10黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶抑制活性测试，该细胞分别用0、5、10、25μm的3和13或者25μm的曲酸处理，“*”表示两列之间的显着性差异：*，p＜0.05；**，p＜0.01；
[0044]
图2为化合物3和13对α-msh刺激的b16f10黑色素瘤细胞中的黑色素含量抑制活性测试，该细胞分别用0、5、10、25μm的3和13或者25μm的曲酸处理，“*”表示两列之间的显着性差异：*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；
[0045]
图3蛋白质印迹结果图，化合物3和曲酸对b16f10细胞中酪氨酸酶和mitf水平的影响；
[0046]
图4化合物3对紫外线诱导豚鼠皮肤色素沉着的预防作用，a、紫外线照射前(左)和后(右)豚鼠背部的图像；b、从右侧豚鼠的四个方形区域各取一个活检标本，用fontana-masson染色试剂盒进行银染，bars＝50μm；c、fontana-masson染色阳性细胞百分比，阳性细胞的比例是同一视野中阳性细胞数与表皮细胞数的比值，每个皮肤样本有10张不同的图像。*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001；
[0047]
图5化合物3修复紫外线诱导豚鼠皮肤色素沉着的能力，a、紫外线照射后(左)和紫外线照射和治疗后(右)豚鼠背部的图像；b、从右侧豚鼠的四个方形区域各取一个活检标本，用fontana-masson染色试剂盒进行银染，bars＝50μm；c、fontana-masson染色阳性细胞百分比，阳性细胞的比例是同一视野中阳性细胞数与表皮细胞数的比值，每个皮肤样本有10张不同的图像，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。
具体实施方式
[0048]
实施例13-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮(1)的合成
[0049][0050]
1.1 2，4-双(苄氧基)苯甲醛的合成
[0051][0052]
将化合物2，4-双(羟基)苯甲醛(1eq.)溶于甲醇中，向其中加入k2co3(3eq.)和溴苄(4eq.)，然后在80℃下回流搅拌2h，通过tlc板检测反应，反应完全时，在减压条件下去除溶剂甲醇，用ea萃取(150ml
×
3)，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，用无水na2so4干燥，然后在减压条件下除去溶剂，用pe：ea＝10∶1进行柱层析色谱法纯化粗品，得到白色固体3-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮，收率为86.77％。
[0053]
1.2(e)-3-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮的合成
[0054][0055]
将化合物3-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮(1eq.)溶于乙醇中，向其中加入4-甲氧基苯乙酮(1.05eq.)和naoh(5eq.)，在80℃下回流2-4h，用tlc板检测反应，当反应完全后，在减压条件下将乙醇旋干，用ea萃取(75ml
×
3)，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水na2so4干燥，然后减压条件下除去溶剂，用pe/ea进行柱层析色谱法纯化粗品，以较好的产率得到黄色固体(e)-3-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮。
[0056]
1.33-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮的合成
[0057][0058]
在密封管中，将中间体(e)-3-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮溶于乙醇中，向其中加入联硼酸频那醇酯(3eq.)和cs2co3(0.2eq.)，在120-150℃条件下反应12-24h，反应液逐渐由黄色变为透明。用tlc板监测反应，当反应结束后，将密封管从油浴中取出，冷却到室温。在减压条件下将乙醇旋干，ea萃取(50ml
×
3)，水洗。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水na2so4干燥，减压条件下除去溶剂，用pe/ea进行柱层析色谱法纯化粗品，以适中的产率得到白色固体3-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮。
[0059]
1.43-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮的合成
[0060][0061]
向两颈瓶中加入化合物3-(2，4-双(苄氧基)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙烷-1-酮
318.9976；purity：99.254％(by hplc).
[0070]
实施例6 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(邻甲苯基)丙基-1-酮(6)的合成
[0071]
按照实施例1的操作，得黄色油状，产率为89.7％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.09(d，j＝3.8hz，1h)，7.61(dd，j＝7.6，3.6hz，1h)，7.31(dd，j＝7.8，4.1hz，1h)，7.22-7.14(m，2h)，6.87(dd，j＝8.2，3.9hz，1h)，6.38(dd，j＝4.1，2.5hz，1h)，6.35-6.24(m，1h)，5.35(s，1h)，3.34-3.15(m，2h)，2.98-2.76(m，2h)，2.41(d，j＝4.1hz，3h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ204.7，157.0，156.3，138.6，137.2，132.0，131.5，130.5，128.9，126.3，117.9，106.3，102.9，41.9，25.0，21.0；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o3[m-h]-255.1026，found 255.1025；purity：98.650％(by hplc).
[0072]
实施例7 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-羟基苯基)丙基-1-酮(7)的合成
[0073]
按照实施例1的操作，得无色油状，产率为66.9％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.49(s，1h)，7.89(d，j＝9.0hz，2h)，7.20(s，1h)，6.96-6.76(m，3h)，6.36(d，j＝2.6hz，1h)，6.29(dd，j＝8.2，2.6hz，1h)，5.11(s，1h)，3.37-3.19(m，2h)，2.92-2.77(m，2h)；
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ201.1，164.1，155.6，131.3，130.8，129.1，120.3，113.8，107.9，104.6，40.3，22.9；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h14
o4[m-h]-257.0819，found 257.0815；purity：98.107％(by hplc).
[0074]
实施例8 1-(2，4-二氯苯基)-3-(2，4-二羟基苯基)丙基-1-酮(8)的合成
[0075]
按照实施例1的操作，得粉色油状，产率为48.2％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.54-7.42(m，2h)，7.35-7.30(m，1h)，6.96(d，j＝8.1hz，1h)，6.46-6.34(m，2h)，5.08(s，2h)，3.36(t，j＝6.2hz，2h)，2.95(t，j＝6.3hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ203.7，155.5，155.1，138.1，136.3，132.6，131.3，130.7，130.6，127.4，119.4，108.0，104.1，44.5，23.3；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h12
cl2o3[m-h]-309.0090，found 309.0094；purity：97.929％(by hplc).
[0076]
实施例9 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)丙基-1-酮(9)的合成
[0077]
按照实施例1的操作，得粉色固体，产率为34.7％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.72(s，1h)，9.24(s，1h)，8.99(s，1h)，7.88(d，j＝8.8hz，1h)，6.85(d，j＝8.2hz，1h)，6.55-6.49(m，1h)，6.47(d，j＝2.4hz，1h)，6.28(d，j＝2.4hz，1h)，6.12(dd，j＝8.1，2.4hz，1h)，3.82(s，3h)，3.22-3.13(m，2h)，2.74(t，j＝7.7hz，2h)；
13
c nmr(101mhz，dmso-d6)δ205.4，166.0，164.7，157.1，156.3，133.0，130.6，117.7，113.8，107.7，106.4，102.9，101.3，56.2，40.0，25.3；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o5[m-h]-287.0925，found 287.0924；purity：99.140％(by hplc).
[0078]
实施例10 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-异丙基苯基)丙基-1-酮(10)的合成
[0079]
按照实施例1的操作，得黄色油状，产率为81.8％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.43(s，1h)，7.95(d，j＝7.8hz，2h)，7.35(s，2h)，7.32(d，j＝5.6hz，1h)，6.99(d，j＝8.1hz，1h)，6.48(d，j＝2.4hz，1h)，6.41(d，j＝8.3hz，1h)，5.37(d，j＝13.3hz，1h)，3.43(t，j＝5.9hz，2h)，3.01-2.97(m，2h)，1.30(d，j＝7.0hz，6h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ202.3，155.6，155.4，154.5，133.9，131.3，128.7，126.8，120.2，107.9，104.6，40.6，34.3，23.6，22.8；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
18h20
o3[m-h]-283.1339，found 283.1334；purity：98.016％(by hplc).
[0080]
实施例11 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基-1-酮(11)的合成
[0081]
按照实施例1的操作，得白色固体，产率为51.6％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.37(s，1h)，9.20(s，1h)，8.98(s，1h)，7.48(dd，j＝8.4，2.1hz，1h)，7.35(d，j＝2.2hz，1h)，6.99(d，j＝8.5hz，1h)，6.83(d，j＝8.2hz，1h)，6.27(d，j＝2.3hz，1h)，6.11(dd，j＝8.1，2.4hz，1h)，3.83(s，3h)，3.06(t，j＝7.6hz，2h)，2.69(t，j＝7.7hz，2h)；
13
c nmr(101mhz，meod)δ200.8，156.4，155.8，152.2，146.2，130.1，121.5，118.6，114.2，113.5，110.3，106.0，102.2，55.0，38.6，25.2；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o5[m-h]-287.0925，found 287.0926；purity：98.408％(by hplc).
[0082]
实施例12 3-(2，4-二羟基苯基)-1-苯基丙基-1-酮(12)的合成
[0083]
按照实施例1的操作，得粉色固体，产率为52.9％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.25(s，1h)，8.03-7.98(m，2h)，7.61(t，j＝7.4hz，1h)，7.49(d，j＝7.6hz，2h)，7.46(s，1h)，6.99(d，j＝8.2hz，1h)，6.49(d，j＝2.5hz，1h)，6.42(dd，j＝8.2，2.6hz，1h)，3.43(t，j＝5.9hz，2h)，2.99(t，j＝6.0hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ202.6，155.7，155.3，136.1，133.8，131.3，128.7，128.4，119.9，108.0，104.5，40.6，23.0；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h14
o3[m-h]-241.0870，found 241.0866；purity：98.017％(by hplc).
[0084]
实施例13 3-(2，4-二羟基苯基)-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙基-1-酮(13)的合成
[0085]
按照实施例1的操作，得粉色固体，产率为63.2％；1h nmr(300mhz，meod)δ7.57(d，j＝7.7hz，2h)，6.84(dd，j＝11.8，8.1hz，2h)，6.29(d，j＝2.4hz，1h)，6.20(dd，j＝8.2，2.4hz，1h)，3.89(s，3h)，3.15(t，j＝7.7hz，2h)，2.85(t，j＝7.7hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，meod)δ200.7，156.4，155.8，152.3，147.65，130.2，128.6，123.3，118.6，114.5，110.8，106.0，102.1，54.9，38.7，19.5；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o5[m-h]-287.0925，found 287.0922；purity：95.521％(by hplc).
[0086]
实施例14 1-([1，1
′‑
联苯]-4-基)-3-(2，4-二羟基苯基)丙基-1-酮(14)的合成
[0087]
按照实施例1的操作，得黄色固体，产率为49.8％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ8.15(s，1h)，7.92(s，1h)，6.98(d，j＝8.4hz，2h)，6.74(d，j＝8.3hz，2h)，6.69-6.64(m，2h)，6.42(d，j＝7.6hz，2h)，6.15(d，j＝7.4hz，1h)，5.90(d，j＝7.4hz，1h)，5.80(d，j＝8.2hz，1h)，5.22(d，j＝2.4hz，1h)，2.15(t，j＝7.6hz，2h)，1.70(t，j＝7.6hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ199.44，156.50，155.81，144.41，138.98，135.50，130.23，129.13，128.69，128.39，127.01，126.93，117.58，105.96，102.41，38.74，24.49；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
21h18
o3[m-h]-317.1183，found 317.1182；purity：97.843％(by hplc).
[0088]
实施例15 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2，3-二甲氧基苯基)丙基-1-酮(15)的合成
[0089]
按照实施例1的操作，得白色固体，产率为54.1％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ12.76(s，1h)，7.67(d，j＝8.6hz，1h)，6.99(d，j＝7.5hz，1h)，6.82(d，j＝8.1hz，2h)，6.35(s，2h)，5.83(s，1h)，3.86(d，j＝3.8hz，6h)，3.18(d，j＝8.3hz，2h)，3.09-2.95(m，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ204.2，165.2，164.7，152.8，147.1，134.7，133.4，124.3，122.0，112.9，111.5，108.7，102.9，60.5，56.0，25.0，20.7；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
17h18
o5[m-h]-301.1081，found 301.1082；purity：99.767％(by hplc).
287.0925，found 287.0939；purity：98.746％(by hplc).
[0100]
实施例21 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙基-1-酮(21)的合成
[0101]
按照实施例1的操作，得白色固体，产率为66.9％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.61(s，1h)，7.83(d，j＝8.9hz，1h)，6.58(s，2h)，6.36(d，j＝8.8hz，1h)，6.25(s，1h)，3.74(s，6h)，3.61(s，3h)，3.27(s，2h)，2.86(t，j＝7.9hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ204.2，165.2，164.7，153.2，137.2，136.1，133.6，113.0，108.6，106.1，102.8，60.4，56.2，39.9，30.7；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
18h20
o6[m-h]-331.1187，found 331.1188；purity：96.984％(by hplc).
[0102]
实施例22 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙基-1-酮(22)的合成
[0103]
按照实施例1的操作，得淡黄色固体，产率为67.3％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.63(s，1h)，10.65(s，1h)，7.82(d，j＝8.9hz，1h)，6.87(d，j＝10.1hz，1h)，6.82(s，1h)，6.76(d，j＝8.2hz，1h)，6.36(d，j＝8.8hz，1h)，6.30-6.16(m，1h)，3.73(s，3h)，3.70(s，3h)，3.29-3.22(m，2h)，2.86(t，j＝7.6hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ204.3，165.2，164.7，149.1，147.6，133.9，133.5，120.6，113.0，112.8，112.3，108.6，102.9，56.0，55.8，39.95，30.0；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
17h18
o5[m-h]-301.1081，found 301.1085；purity：98.183％(by hplc).
[0104]
实施例23 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3-硝基苯基)丙基-1-酮(23)的合成
[0105]
按照实施例1的操作，得淡黄色固体，产率为60.2％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.49(s，1h)，10.66(s，1h)，8.19(s，1h)，8.14-8.03(m，1h)，7.84(d，j＝8.9hz，1h)，7.78(d，j＝7.7hz，1h)，7.59(t，j＝7.9hz，1h)，6.36(dd，j＝9.0，2.3hz，1h)，6.25(d，j＝2.3hz，1h)，3.42-3.34(m，2h)，3.07(t，j＝7.4hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ203.4，165.2，164.5，148.2，144.0，136.0，133.5，130.1，123.6，121.5，113.0，108.6，102.8，39.9，29.5；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h13
no5[m-h]-286.0721，found 286.0720；purity：98.228％(by hplc).
[0106]
实施例24 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2-羟基苯基)丙基-1-酮(24)的合成
[0107]
按照实施例1的操作，得黄色固体，产率为55.6％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.66(d，j＝2.3hz，1h)，10.63(d，j＝2.4hz，1h)，9.42(d，j＝2.5hz，1h)，7.88-7.76(m，1h)，7.10(d，j＝7.5hz，1h)，6.99(d，j＝8.0hz，1h)，6.78(d，j＝7.7hz，1h)，6.71(d，j＝7.8hz，1h)，6.35(d，j＝8.8hz，1h)，6.29-6.18(m，1h)，3.17(d，j＝7.8hz，2h)，2.85(d，j＝9.2hz，2h)；
13
c nmr(101mhz，dmso-d6)δ204.7，165.2，164.8，155.6，133.4，130.3，127.6，127.4，119.4，115.3，112.9，108.6，102.9，38.1，25.7；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h14
o4[m-h]-257.0819，found 257.0819；purity：95.704％(by hplc).
[0108]
实施例25 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(邻甲苯基)丙基-1-酮(25)的合成
[0109]
按照实施例1的操作，得淡黄色固体，产率为88.1％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.66-12.55(m，1h)，10.62(s，1h)，7.82(d，j＝8.8hz，1h)，7.19(d，j＝6.2hz，2h)，7.14-7.08(m，2h)，6.39-6.32(m，1h)，6.28-6.22(m，1h)，3.23(t，j＝7.8hz，2h)，2.90(t，j＝7.7hz，2h)，2.29(s，3h)；
13
c nmr(101mhz，dmso-d6)δ204.1，165.3，164.7，139.6，136.2，133.5，133.5，130.4，129.0，126.4，113.0，108.6，102.9，38.2，27.6，19.4；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o3[m-h]-255.1026，found 255.1029；purity：96.578％(by hplc).
[0110]
实施例26 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3-甲氧基苯基)丙基-1-酮(26)的合成
[0111]
按照实施例1的操作，得淡黄色固体，产率为82.3％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.59(d，j＝9.8hz，1h)，10.64(d，j＝10.0hz，1h)，7.82(t，j＝9.7hz，1h)，7.18(d，j＝9.9hz，1h)，6.84(d，j＝10.0hz，2h)，6.75(d，j＝11.3hz，1h)，6.33(d，j＝9.7hz，1h)，6.27-6.18(m，1h)，3.73(s，3h)，3.30-3.19(m，2h)，2.88(d，j＝9.3hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ203.8，165.1，163.1，159.6，142.5，132.3，129.7，120.9，114.3，113.6，111.6，108.1，103.6，55.3，39.6，30.4；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o4[m-h]-271.0976，found 271.0978；purity：98.791％(by hplc).
[0112]
实施例27 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3，4-二羟基苯基)丙基-1-酮(27)的合成
[0113]
按照实施例1的操作，得黄色固体，产率为62.8％；1h nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.68(s，1h)，10.67(s，0h)，8.75(s，1h)，7.82(d，j＝8.8hz，1h)，7.31-7.09(m，1h)，6.68-6.62(m，2h)，6.55-6.48(m，1h)，6.39(dd，j＝8.9，2.4hz，1h)，6.28(d，j＝2.4hz，1h)，3.21(t，j＝7.6hz，2h)，2.78(t，j＝7.6hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso)δ203.98，165.12，164.51，145.15，143.51，133.06，132.00，119.12，115.99，115.63，112.61，108.42，102.64，39.41，29.42；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
15h14
o5[m-h]-273.0768，found 273.0776；purity：99.871％(by hplc).
[0114]
实施例28 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2，4-二甲氧基苯基)丙基-1-酮(28)的合成
[0115]
按照实施例1的操作，得黄色油状，产率为76.5％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.80(d，j＝8.4hz，1h)，7.38(d，j＝3.7hz，1h)，7.35(s，1h)，6.89(d，j＝8.2hz，1h)，6.54(d，j＝2.2hz，1h)，6.51(dd，j＝8.4，2.2hz，1h)，6.44(d，j＝2.4hz，1h)，6.37(dd，j＝8.2，2.5hz，1h)，3.83(s，3h)，3.72(s，3h)，3.33-3.26(m，2h)，2.97-2.90(m，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso)δ204.20，164.79，164.40，159.19，157.98，132.92，129.97，120.75，112.49，108.20，104.36，102.48，98.33，55.29，55.11，37.93，24.73；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
17h18
o5[m-h]-301.1081，found 301.1104；purity：98.515％(by hplc).
[0116]
实施例29 3-(2，4-二甲氧基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙基-1-酮(29)的合成
[0117]
按照实施例1的操作，得粉色油状，产率为72.3％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.98(d，j＝8.9hz，2h)，7.12(d，j＝8.1hz，1h)，6.94(d，j＝8.9hz，2h)，6.48(d，j＝2.4hz，1h)，6.44(dd，j＝8.1，2.4hz，1h)，3.88(s，3h)，3.83(s，3h)，3.81(s，3h)，3.23-3.15(m，2h)，3.02-2.94(m，2h)；
13
c nmr(75mhz，dmso)δ197.9，163.0，159.1，158.0，130.2，129.9，129.6，121.1，113.9，104.3，98.3，55.5，55.3，55.1，38.1，24.4；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
18h20
o4[m h]

301.1435，found 301.1284；purity：99.215％(by hplc).
[0118]
实施例30 1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2-羟基苯基)丙基-1-酮(30)的合成
[0119]
按照实施例1的操作，得白色固体，产率为69.3％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.66(dd，j＝8.4，0.9hz，1h)，7.14-7.10(m，2h)，6.89(s，1h)，6.86(d，j＝1.0hz，1h)，6.40(s，2h)，3.82(s，3h)，3.39-3.34(m，2h)，3.02(t，j＝6.3hz，2h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ204.8，166.5，165.4，154.3，131.8，130.6，128.0，127.5，120.8，116.9，113.2，108.2，100.9，55.6，39.3，25.0；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o4[m-h]-271.0976，found 271.0968；purity：96.474％(by hplc).
[0120]
实施例31 3-(2-羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙基-1-酮(31)的合成
[0121]
按照实施例1的操作，得无色油状，产率为75.7％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.44(s，1h)，8.01(d，j＝8.9hz，2h)，7.18-7.12(m，2h)，6.99-6.93(m，3h)，6.91(dd，j＝7.3，1.3hz，1h)，3.91(s，3h)，3.49-3.42(m，2h)，3.10-3.04(m，2h)；
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ200.6，164.1，154.7，130.7，130.6，129.1，128.0，128.0，120.6，117.5，113.8，55.5，40.1，25.0；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o3[m-h]-255.1026，found 255.1023；purity：99.693％(by hplc).
[0122]
实施例32 1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(4-羟基苯基)丙基-1-酮(32)的合成
[0123]
按照实施例1的操作，得黄色固体，产率为56.8％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ12.85(s，1h)，7.63(d，j＝9.6hz，1h)，7.10(d，j＝8.4hz，2h)，6.77(d，j＝8.4hz，2h)，6.45-6.33(m，2h)，3.83(s，3h)，3.24-3.14(m，2h)，3.02-2.91(m，2h)；
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ204.0，166.1，165.3，154.2，132.8，131.6，129.5，115.5，113.4，107.8，101.0，55.6，40.0，29.6；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o4[m-h]-271.0976，found 271.0977；purity：99.733％(by hplc).
[0124]
实施例33 3-(4-羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)丙基-1-酮(33)的合成
[0125]
按照实施例1的操作，得黄色油状，产率为79.2％；1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.03-7.93(m，2h)，7.16-7.09(m，2h)，7.01-6.93(m，2h)，6.86-6.78(m，2h)，3.90(s，3h)，3.26(t，j＝7.7hz，2h)，3.02(t，j＝7.6hz，2h)；
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ199.5，163.7，154.5，132.8，130.6，129.8，129.5，115.6，113.9，55.5，40.5，29.7；hr-ms(esi)m/z：calcd for c
16h16
o3[m-h]-255.1026，found 255.1022；purity：98.584％(by hplc).
[0126]
实施例34
[0127]
片剂
[0128][0129][0130]
取上述配方，用常规方法制备成片剂。
[0131]
药理活性实验实施例
[0132]
实施例1部分化合物对酪氨酸酶体外酶活抑制实验
[0133]
1.1实验方法
[0134]
将化合物用dmso溶解，配制成10mm的母液备用，用0.067m ph 6.8的pbs梯度稀释至所需浓度(每个化合物设置8个浓度梯度)。酪氨酸酶冻干粉末和底物(l-多巴和l-酪氨酸)分别溶解在pbs中，配制成300u/ml的酪氨酸酶溶液和2mm的l-多巴溶液或1mm的l-酪氨酸溶液。反应总体系为200μl，即将80μl的pbs，20μl的样品以及60μl酪氨酸酶溶液加入到96
孔板中，在37℃下预培育20min，然后向其中加入40μl的底物溶液，再次在37℃下预培育5min(l-多巴)或者10min(l-酪氨酸)，立刻用酶标仪在490nm处测其吸光度，以pbs溶剂为空白对照，平行测量三次。
[0135]
1.2实验结果
[0136]
表1本发明部分化合物对酪氨酸酶的抑制活性
[0137][0138][0139]
a ic
50
指抑制50％时的浓度(至少三次实验的均值
±
sd值)。
[0140]
从l-tyr为底物的测试结果可以看出，当b环为2’，4
’‑
二羟基苯环时，所有目标化合物的酪氨酸酶抑制活性为纳摩尔级；当b环上的2，4-二羟基变为2’，3
’‑
二羟基或者2
’‑
羟基以及4
’‑
羟基时，其活性均急剧下降。当b环上的2’，4
’‑
二羟基被甲基化时，其活性也大大降低。这些结果表明b环为2’，4
’‑
二羟基苯环对于酪氨酸酶抑制活性是必须的。在这些化合物中，当a环为2，4-二羟基和3-甲氧基-4-羟基苯基即化合物3(l-tyr ic
50
＝0.050μm；l-dopa ic
50
＝0.064μm)和13(l-tyr ic
50
＝0.054μm；l-dopa ic
50
＝0.165μm)具有最优的酪氨酸酶抑制活性，a环上的取代基为3
’‑
羟基-4
’‑
甲氧基时其活性次之(l-tyr ic
50
＝0.069μm；l-dopa ic
50
＝0.245μm)。当a环为烷基或者卤素基团取代时，其活性略有下降，且当烷基取代基团体积较大时，如4
’‑
苯基取代，其活性下降较为明显。根据酪氨酸酶测试结果，其构效关系总结如下：1.b环为间苯二酚结构对于活性是必须的；2.对于a环而言，2，4-二羟基苯基
和3-甲氧基-4-羟基苯基活性最优，2-羟基-4-甲氧基次之，当为大位阻烷基取代时会使活性大大降低。
[0141]
实施例2部分化合物的细胞毒性实验
[0142]
2.1实验方法
[0143]
b16f10细胞用于代表化合物3和13的细胞毒性分析。在含有10％胎牛血清的dmem高糖培养基中培养细胞，将处于对数生长期的细胞进行消化、细胞计数、重悬，以3
×
103个/well的数量接种到96孔板中培养。培养24h以后，向其中加入样品(5μm，10μm和50μm)，在37℃、5％co2孵育箱中继续培育72h，向其中加入20μl的5mg/l的mtt。在孵育箱中培育4h后，将培养液吸去，用150μl的dmso溶解甲瓒，用酶标仪测其在490nm处的吸光度。
[0144]
2.2实验结果
[0145]
表2化合物3和13对b16f10的细胞毒性作用
[0146][0147]
结果显示，即使是在高浓度(50μm)下，与对照组相比，化合物3和13的细胞毒性都可以忽略。这表明化合物3和13是较为安全的酪氨酸酶抑制剂。
[0148]
实施例3部分化合物的抗氧化活性测定
[0149]
3.1实验方法
[0150]
在96孔板中，将180μl的dpph甲醇溶液(0.2mm)和20μl的代表化合物(用dmso将化合物配置成100μm)混合。l-抗坏血酸用作标准参考物质，空白组加入20μl的dmso。然后将96孔板在黑暗条件下孵育1 h。使用酶标仪在517nm下测量吸光度，所有实验均重复三次。使用以下公式计算代表化合物的dpph自由基清除活性：自由基清除率％＝[(ac-as)/ac]
×
100。ac指空白组的吸光度，as指测试组的吸光度。
[0151]
3.2实验结果
[0152]
表3实施例1-14在100μm时的抗氧化活性测试结果
[0153]
[0154]
结果表明化合物1-14具有适中的dpph自由基清除能力，我们推测化合物1-14的dpph自由基清除作用是其抑制黑色素生成作用的一部分。
[0155]
实施例4部分化合物对细胞内的酪氨酸酶抑制活性测试
[0156]
4.1实验方法
[0157]
将处于对数生长期的b16f10细胞进行消化、重悬、计数后，以3
×
104个/孔的数量接种到24孔板中，在37℃，5％co2的孵育箱中培育24h。向空白对照组、阳性对照组和实验组加入1μm的α-msh，阳性对照组用25μm的曲酸处理，实验组用5、10和25μm的3和13处理，空白组加入dmso(＜0.3％)。在孵育箱中孵育24h后，将细胞收集到离心管中，用1ml pbs洗涤细胞两次，再向其中加入100μm的1m naoh，在60℃下孵育1h，取上层清液至96孔板中，用酶标仪测试其在405nm下的吸光度。实验重复三次。黑色素含量％＝od
实验组
/od
控制组
×
100％。
[0158]
4.2实验结果见图1。
[0159]
结果说明化合物3和13能剂量依赖性地抑制细胞内的酪氨酸酶的活性，且在25μm的给药浓度下，其均具有优于阳性对照曲酸(79.1％)的酪氨酸酶抑制潜力。
[0160]
实施例5部分化合物对细胞内的黑色素含量抑制活性测试
[0161]
5.1实验方法
[0162]
将处于对数生长期的b16f10细胞进行消化、重悬、计数后，以3
×
104个/孔的数量接种到24孔板中，在37℃，5％co2的孵育箱中培育24h。向空白对照组、阳性对照组和实验组加入1μm的α-msh，阳性对照组用25μm的曲酸处理，实验组用5、10和25μm的3和13处理，空白组加入dmso(＜0.3％)。在孵育箱中孵育24h后，将细胞收集到离心管中，用1ml pbs洗涤细胞两次，再向其中加入含0.1mm的pmsf的100μm的1％的triton x-100(用50mm，ph＝6.8的pbs配置)裂解细胞。在-80℃孵育30min后，让其在室温融化，然后在-4℃，12
×
103rpm高速离心15min后，取上清液80μl加入到96孔板中，再向96孔板中加入20μl的底物l-dopa(2mm)，将其转移到37℃中反应1h，用酶标仪每间隔10min测其在490nm的吸光度。实验重复三次。酪氨酸酶活性％＝od
实验组
/od
控制组
×
100％。
[0163]
5.2实验结果见图2。
[0164]
结果显示，在用25μm的3和13处理后，b16f10细胞中的黑色素含量分别为65.1％和65.7％，而用相同浓度的曲酸处理后，细胞中的黑色素含量为70.0％。这些数据说明，化合物3和13均能浓度依赖性地减少细胞内的黑色素含量，且略优于阳性对照曲酸。
[0165]
实施例6化合物3抗黑素活性的分子机制
[0166]
6.1实验方法
[0167]
b16f10细胞(2
×
105细胞/孔)在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素(v/v)的dmem培养基中培养24小时，随后在六孔板中与不同浓度的化合物或dmso培养72小时。用凉的pbs洗涤细胞两次，在ripa裂解缓冲液中刮取(beyotime，中国)。细胞颗粒在冰上裂解30分钟，然后在4℃下离心30分钟(13000转/分)，上清液用bca试剂盒(beyotime，中国)定量。使用的特异性一级抗体包括酪氨酸酶抗体(1∶1000，abcam，cambs，uk)、mitf抗体(1∶100；cell signaling technology，beverly，ma)和gapdh抗体(1∶10000；proteintech，中国武汉)。二级抗体为hrp结合山羊抗兔igg(1∶10000；biosharp，中国北京)。使用ecl plus(弗德生物技术，中国杭州)和bio-rad versadoc(tanon，中国上海)通过增强化学发光显示免疫反应带。
[0168]
6.2实验结果见图3
[0169]
mitf是酪氨酸酶的上游转录因子，在酪氨酸蛋白酶基因的转录中起重要作用。western blotting表明，经化合物3处理的b16f10细胞中酪氨酸酶和mitf的蛋白水平均呈剂量依赖性下降，而与化合物3相比，经曲酸处理的b16f10细胞的酪氨酸蛋白酶和mitf蛋白水平的抑制相对较弱。
[0170]
实施例7化合物3对紫外线诱导的豚鼠皮肤色素沉着的治疗
[0171]
7.1实验方法
[0172]
动物实验都是根据中国药科大学伦理审查委员会的批准和指南(动物实验伦理审查受理号2022-06-012)，以及《动物福利法》和《实验动物护理和使用指南》中规定的原则进行的。雌性豚鼠(dunkin-hartley菌株，10周龄，350-500g，中国南京)作为实验对象。在豚鼠背部，剃去四个单独的区域(2
×
2cm2)，并接受紫外线灯(sh1-b，sigma，中国上海)的紫外线照射，总紫外线剂量为30mj/cm2/天。每个单独的区域用不同的配方处理，添加或不添加不同剂量的化合物。根据色素沉着模型，采用两种不同的给药方法检查化合物的效果：1)每天紫外线照射前6小时局部给药，持续2周；或2)连续两周暴露于紫外线灯5天/周后局部给药。最后一次手术后三天，两组动物均被处死，并通过手术取出皮肤样本。对皮肤样品进行组织切片、染色和拍照，使用fontana-masson试剂盒(solarbio，中国北京)评估黑色素含量。阳性细胞的比例是同一视野中阳性细胞数与表皮细胞数的比值，每个皮肤样本有10张不同的图像。
[0173]
7.2实验结果
[0174]
采用两种不同的方法评估紫外线诱导的豚鼠模型皮肤色素沉着中的体内抗黑色素作用：作为预防剂(图4a)和作为修复治疗(图5a)。从防止色素形成的结果来看，每天使用化合物3以剂量依赖的方式抑制黑色素的生成，如图4b和c所示，用0.5mm化合物3的丙二醇(pg)溶液处理的皮肤中，fontana-masson染色阳性细胞的比例高于用1mm化合物3的丙二醇溶液处理的皮肤。同时，不同剂型的化合物3对黑色素的抑制作用不明显，pg和卡波姆(cp)水凝胶中化合物3均降低了黑色素水平。经化合物3处理后，所有皮肤样本的表皮和真皮均保持正常(图4b和c)。在这批修复实验中，不同配方的化合物3在接受紫外线辐射2周后施用。可以得出类似的结论，化合物3能够以剂量依赖性降低的方式治疗晒伤的皮肤，并且各种溶剂对实验结果的影响有限(图5b和c)。