一种基于白细胞滤器的PBMC回收方法及系统与流程

一种基于白细胞滤器的pbmc回收方法及系统
技术领域
1.本发明涉及一种pbmc收集方法，尤其是一种基于白细胞滤器的pbmc回收方法及系统。


背景技术：

2.白细胞是血液的主要成分之一，主要分类包括：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单个核细胞(pbmc，peripheral blood mononuclear cell，全称为外周血单个核细胞)，白细胞若在输血过程中进入患者体内可能会导致输血反应，因此白细胞对于临床使用的血液制品是一种不需要的成分。医疗机构采集的临床献血，以及血站采集获得的无偿献血，在进入临床回输应用前，均需要进行血液成分分离，通过分离去除血液中的白细胞，通常是利用一次性去白细胞滤器过滤去除白细胞。而这些被过滤的白细胞则和滤器一起成为医疗废品被丢弃，造成医疗资源的浪费。
3.目前针对许多疾病的研究中，以白细胞作为靶向或者治疗手段的研究越来越多。而以通用性car-t为对象的产品在市场上越来越广泛关注，因为通用型car-t是同种异体细胞疗法，实现通用即无需从患者自身体内分离免疫细胞，直接使用健康人t细胞，通过基因编辑技术改造后进行大规模培养，最终回输到患者体内。通用型免疫细胞治疗无需配型，“现货”存储，即时使用，能显著缩短治疗周期，一位健康捐献者可制备成百上千人份“现货”，极大降低细胞治疗成本，所以针对白细胞资源的科研需要，在许多医疗企业或者在产品研发中建立从白细胞滤器的回收方法是当前的迫切需求。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种通过无菌接管机将白细胞滤器无菌接管到离心管路中，并通过清洗液将白细胞冲洗出进行离心分离得到pbmc的基于白细胞滤器的pbmc回收系统及其回收方法。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于白细胞滤器的pbmc回收方法，其特征在于，包括：
6.检测白细胞滤器、pbmc分离试剂、血液细胞分离耗材和无菌接管机的就绪状态；放置好无菌接管机便于后面无菌接管机直接对管路进行无菌的热接过程；
7.检测到就绪状态合格后，启动无菌接管机，通过无菌接管机将白细胞滤器接管到血液细胞分离耗材对应的管路中；接管时先将白细胞滤器和现有的血压细胞分离耗材上对应的管路剪开，再进行重组热接。
8.通过血液细胞分离耗材的管路将分离液加入到血液细胞分离耗材的离心杯内；
9.通过pbmc分离试剂中的滤器清洗液对白细胞滤器进行冲洗，同时将白细胞滤器中的血细胞混合液冲入到离心杯内进行离心处理；热接过后的白细胞滤器便和血压细胞分离耗材的管路形成了连通，便可通过管路中提前设置在滤器清洗液对白细胞滤器中的包细胞进行冲洗。
10.通过血液细胞分离耗材的管路将离心处理后的pbmc液抽出离心杯，并将离心杯内的剩余细胞混合液排至废液袋；
11.将抽出的pbmc液回输到离心杯中，并通过pbmc分离试剂中的清洗液对回输的pbmc液进行清洗；
12.将清洗好的pbmc液收集至最终产品袋。
13.作为上述技术方案的改进，所述分离液通过血液细胞分离耗材的管路加入到血液细胞分离耗材的离心杯内后便开启离心杯的高速离心，所述pbmc分离试剂中的清洗液将白细胞滤器中的血细胞混合液冲入到正在进行高速离心的离心杯内。血细胞混合液流入正在高速离心的离心杯后，可以及时的利用淋巴细胞分离液对血细胞混合液的细胞进行分离，使血细胞混合液的各类型细胞在密度梯度离心的原理下在液体中分出多层，这样高速的离心下进行分层能够更好的、更快地分层，提高细胞离心的效率。
14.作为上述技术方案的进一步改进，所述无菌接管机在进行接管时将白细胞滤器的输出接口与滤器清洗液的接口进行热合连接，将白细胞滤器的输入接口与耗材的管路中的一个输入管路口通过无菌接管机进行热合连接。
15.作为上述技术方案的进一步改进，所述滤器清洗液将白细胞滤器中的血细胞混合液冲入到离心杯内时采用蠕动泵驱动，启动蠕动泵正转，使滤器清洗液进入白细胞滤器中冲出白细胞，并从白细胞滤器中流进管路中。除了蠕动泵，血液细胞分离耗材的管路中还设置有控制阀，控制阀与蠕动泵相结合可以对管路中不同的管道流动方向和流动时间进行自动化控制。
16.作为上述技术方案的进一步改进，所述离心处理后的pbmc液抽出离心杯，并将离心杯内的剩余细胞混合液排至废液袋后还需要用管路清洗液将离心杯冲洗干净。在将离心杯中离心后的材料分别抽出后，对离心杯进行清洗保证了pbmc在离心杯中再次进行处理时的纯度。
17.作为上述技术方案的进一步改进，所述离心杯在进行pbmc的转移、排废料和冲洗时均采用蠕动泵对管路进行控制，蠕动泵反转，并通过控制阀对不同的管路通道进行控制。
18.作为上述技术方案的进一步改进，所述pbmc分离试剂中的清洗液对pbmc液进行清洗时，采用滤器清洗液清洗两遍，并进行浓缩。最后对pbmc液进行清洗和浓缩的过程也是在血液细胞分离耗材的管路中，通过蠕动泵和控制阀进行自动化的无菌处理过程。
19.以及一种基于白细胞滤器的pbmc回收系统，包括白细胞滤器、pbmc分离试剂、血液细胞分离耗材、无菌接管机和用于执行上述的基于白细胞滤器的pbmc回收方法的控制模块，；
20.进一步的，所述血液细胞分离耗材包括离心杯，所述无菌接管机用于将白细胞滤器与pbmc分离试剂之间的管路以及白细胞滤器与血液细胞分离耗材之间的管路的接通，所述控制模块与无菌接管机和血液细胞分离耗材连通，通过所述控制模块控制所述无菌接管机将所述pbmc分离试剂与白细胞滤器连通，以及将所述白细胞滤器与血液细胞分离耗材连通，并通过pbmc分离试剂将白细胞滤器中的白细胞冲入离心杯中；并通过所述控制模块控制血液细胞分离耗材进行离心；经过外周血过滤的富含pbmc的白细胞滤器是外周血流过白细胞过滤器过滤后获得，过滤后的白细胞滤器富含有所需的白细胞，通常在血站里面会进行丢弃，通过对白细胞过滤器的回收利用，可以大大减少白细胞的收集成本和购买成本。
21.作为上述技术方案的改进，所述血液细胞分离耗材还包括一套与离心杯连通的管路系统，所述管路系统中还设置有蠕动泵，所述蠕动泵用于控制管路中的液体流动。除了蠕动泵，血液细胞分离耗材的管路中还设置有控制阀，控制阀与蠕动泵相结合可以对管路中不同的管道流动方向和流动时间进行自动化控制。
22.作为上述技术方案的进一步改进，所述pbmc分离试剂包括分离液和清洗液，所述分离液用于对白细胞中的pbmc分离使用，所述清洗液用于试剂和管路的清洗。清洗液除了具备清洗的作用还能直接冲洗白细胞滤器，将白细胞滤器中的白细胞冲出。
23.作为上述技术方案的进一步改进，所述清洗液包括滤器清洗液和管路清洗液，所述管路清洗液用于pbmc分离中管路和离心杯的清洗，所述滤器清洗液用于白细胞滤器的清洗。
24.有益效果是：本发明的pbmc回收系统和回收方法是对白细胞滤器进行回收，白细胞滤器是在成分细胞制备过程中，pbmc经白细胞滤器过滤后处理的医疗垃圾，pbmc回收法利用血站收集血浆后产生的富含pbmc的滤器，通过冲洗的方式将其中的pbmc液回收。提高细胞制备效率和降低成本，是未来发展的趋势。本发明的自动化高效回收白细胞滤器pbmc的方法，可以实现全封闭、自动化和应用场景广的功能，达到节省人工、无菌和细胞质量稳定的目的。
25.其次，将白细胞滤器的通过无菌接管机与血液细胞分离耗材的管路进行热合连接，即能让滤器清洗液通过连通后的管路将白细胞滤器反冲出含有白细胞的混合液，从而顺着管路流向输入至离心杯中，并通过控制模块进行控制，无需手动热合，完全实现了自动化操作。
附图说明
26.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
27.图1是本发明流程示意图；
28.图2是本发明一种实施例结构示意图；
29.图3是本发明另一种实施例结构示意图。
30.1、白细胞滤器；2、无菌接管机；3、离心杯；4、管路；5、蠕动泵；6、废液袋；7、分离液；8、滤器清洗液；9、管路清洗液。
具体实施方式
31.以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。另外，专利中涉及到的所有联接/连接关系，并非单指构件直接相接，而是指可根据具体实施情况，通过添加或减少联接辅件，来组成更优的联接结构。本发明创造中的各个技术特征，在不互相矛盾冲突的前提下可以交互组合。
32.参照图2，一种回收白细胞滤器1中pbmc的系统，包括白细胞滤器1、pbmc分离试剂、血液细胞分离耗材、无菌接管机2和控制模块；
33.进一步的，所述血液细胞分离耗材包括离心杯3，通过所述控制模块控制所述无菌接管机2将所述pbmc分离试剂与白细胞滤器1连通，以及将所述白细胞滤器1与血液细胞分离耗材连通，并通过pbmc分离试剂将白细胞滤器1中的白细胞冲入离心杯3中；并通过所述控制模块控制血液细胞分离耗材进行离心；经过外周血过滤的富含pbmc的白细胞滤器1是外周血流过白细胞过滤器过滤后获得，外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。过滤后的白细胞滤器1富含有所需的白细胞，通常在血站里面会进行丢弃，通过对白细胞过滤器的回收利用，可以大大减少白细胞的收集成本和购买成本。
34.进一步的，所述无菌接管机用于将白细胞滤器1与pbmc分离试剂之间的管路以及白细胞滤器与血液细胞分离耗材之间的管路的接通，所述控制模块与无菌接管机2和血液细胞分离耗材连通。无菌接管机2对白细胞滤器1的管路4和血细胞分离耗材之间的管路4进行连接，避免了人工的连接操作过程，不仅实现了自动化的连接结构还保证了在连接过程中的无菌环境。
35.作为本技术的一种实施方式控制模块与无菌接管机2和血液细胞分离耗材之间的关系为：通过与无菌接管机2中的rs232接口与血液细胞分离耗材的控制结构连接，然后通过rs232接口在控制模块和无菌接管机2之间进行通信协议的传输，可以进行无菌接管机2运行状态的传输和控制。如此，便可无需进行手动热合，完全实现了自动化操作。
36.作为上述技术方案的改进，所述血液细胞分离耗材还包括一套与离心杯3连通的管路4系统，所述管路4系统中还设置有蠕动泵5，所述蠕动泵5用于控制管路4中的液体流动。除了蠕动泵5，血液细胞分离耗材的管路4中还设置有控制阀，控制阀与蠕动泵5相结合可以对管路4中不同的管道流动方向和流动时间进行自动化控制。具体的，pbmc分离试剂装在多个液体袋内，液体袋上连接有管路4系统，多个液体袋对应多条管路4，且每条管路4上都设置有控制阀，通过控制阀可以控制每条管路4的开合。而管路4系统上还连接有离心杯3和蠕动泵5，蠕动泵5可以设置在离心杯3和液体袋之间，这样可以在离心杯3和液体袋之间对离心杯3和液体袋分别进行控制，结合控制模块的控制，实现了整个管路4系统的自动化、无菌的运行过程。
37.参照图3，所述pbmc分离试剂包括分离液7和清洗液，所述分离液7用于对白细胞中的pbmc分离使用，所述清洗液用于试剂和管路4的清洗。清洗液除了具备清洗的作用还能直接冲洗白细胞滤器1，将白细胞滤器1中的白细胞冲出。分离液7和清洗液都可以通过液体袋预设在血液细胞分离耗材的管路4中，使用时只需要开通相应的控制阀，再利用蠕动泵5的转动便可对相应的液体袋内的液体进行引流。这样便可以通过控制模块与血细胞分离耗材的连接，然后通过控制模块对相应的控制阀和蠕动泵5进行控制，实现分离液7和清洗液在不同步骤、不同时间、不同方向的自动化流通，保证了整个系统在应用过程中的无菌清洁。
38.作为本技术的一种实施方式，所述清洗液包括滤器清洗液8和管路清洗液9，所述管路清洗液9用于pbmc分离中管路4和离心杯3的清洗，所述滤器清洗液8用于白细胞滤器1的清洗。对于滤器清洗液8和管路清洗液9通常选择用细胞生物学试剂，如cellotion细胞清
洗液，还可以采用生理盐水等试剂。
39.另外管路4中还设置有废液袋6，废液袋6通过废液管路4与离心杯3或者pbmc分离试剂连接，用于在清洗后或者在对白细胞进行离心分离后进行废料的排出。
40.参照图1，采用上述结构进行回收pbmc的一种回收白细胞滤器1中pbmc的回收方法，包括以下步骤：
41.准备好白细胞滤器1、pbmc分离试剂、血液细胞分离耗材、无菌接管机2和控制模块，并检测白细胞滤器、pbmc分离试剂、血液细胞分离耗材和无菌接管机的就绪状态；具体的，将无菌接管机2放置在接管位置；放置好无菌接管机2便于后面无菌接管机2直接对管路4进行无菌的热接过程；
42.检测到就绪状态合格后，启动无菌接管机2，用无菌接管机2将白细胞滤器1接管到血液细胞分离耗材对应的管路4中；接管时先将白细胞滤器1和现有的血压细胞分离耗材上对应的管路4剪开，再进行重组热接。
43.作为本方案的一种实施方式，将白细胞滤器1的原本输出接口与滤器清洗液8的接口通过无菌接管机2进行热合连接，将白细胞滤器1的原本输入接口与耗材的管路4中的一个输入管路4口通过无菌接管机2进行热合连接，然后便可通过滤器清洗液8将白细胞滤器1反冲出白细胞，从而顺着管路4流向输入至离心杯3中。
44.作为本方案的一种实施方式，热合过程为：首先，通过对无菌接管机2的位置调整，使无菌接管机2的两个管保持部将白细胞滤器1的原本输出接口与装有滤器清洗液8的液体袋的接口夹起。之后，分别将白细胞滤器1的原本输出接口与滤器清洗液8的接口通过无菌接管机2进行热合连接，将白细胞滤器1的原本输入接口与耗材的管路4中的一个输入管路4口通过无菌接管机2进行热合连接。白细胞滤器1的原本输入接口和原本输出接口是无菌封装，滤器清洗液8的接口也是无菌封装，保证了整个接管过程是在无菌的环境下进行，避免材料受到污染。
45.对于无菌接管机2的控制，通过与无菌接管机2中的rs232接口与血液细胞分离耗材的控制结构连接。然后通过rs232接口在控制模块和无菌接管机2之间进行通信协议的传输，可以进行无菌接管机2运行状态的传输和控制，向无菌接管机2发送预热指令。首先使无菌接管机2进入预热状态，当需要连接的管上升至一定的温度后，检测到预热完成，发送热合指令。移动其中一个管保持部，切开原本两个管路4，然后交错地热合两个管路4的接口，并保持预热温度一段时间，让接口之间的热合完全接缝上；最后，读取到热合完成的指令后，从无菌接管机2中取出热合后的管，同理将白细胞滤器1的原本输入接口与耗材的管路4中的一个输入管路4口进行热合。
46.作为本方案的一种实施方式，在采用无菌接管机2进行接管时，无菌接管机2的优选使用环境为环境温度10～40℃、相对湿度30～85％。但只要能够对各管t1、t2的端部进行加压熔接，并不特别限制使用环境。预热的温度是为了让管子达到热合的温度，让管子内和周边的环境温度达到热合的温度即可，优选70度，达到70度范围的时候就能让管子变软容易切开，再让不同管路4之间进行熔接在一起，做到切换管路4的目的。
47.通过血液细胞分离耗材的管路4将分离液7加入到血液细胞分离耗材的离心杯3内；
48.作为本技术的一种实施方式，在将分离液7加入到血液细胞分离耗材中时，先开启
淋巴细胞的分离液7相对应的控制阀，让分离液7进入管路4中，并通过开启部分控制阀，然后通过蠕动泵5的转动运送管路4中的液体，分离液7便会随着设定好的管路4路径流入离心杯3中。离心杯3是用于pbmc分离的容器，检测到预设体积的分离液7流入离心杯3后，关闭控制阀，然后旋转离心杯3，以高速旋转的方式让分离液7在离心杯3中形成一个外环层，例如2500rpm或者3000rpm。
49.作为本方案的另一种实施方式，所述分离液7通过血液细胞分离耗材的管路4加入到血液细胞分离耗材的离心杯3内后便开启离心杯3的高速离心，所述pbmc分离试剂中的清洗液将白细胞滤器1中的血细胞混合液冲入到正在进行高速离心的离心杯3内。血细胞混合液流入正在高速离心的离心杯3后，可以及时的利用淋巴细胞分离液7对血细胞混合液的细胞进行分离，使血细胞混合液的各类型细胞在密度梯度离心的原理下在液体中分出多层，这样高速的离心下进行分层能够更好的、更快地分层，提高细胞离心的效率。
50.通过pbmc分离试剂中的滤器清洗液8对白细胞滤器1进行冲洗，同时将白细胞滤器1中的血细胞混合液冲入到离心杯3内进行离心处理；热接过后的白细胞滤器1便和血压细胞分离耗材的管路4形成了连通，便可通过管路4中提前设置在滤器清洗液8对白细胞滤器1中的包细胞进行冲洗。
51.作为本方案的一种实施方式，所述清洗液将白细胞滤器1中的血细胞混合液冲入到离心杯3内时采用蠕动泵5驱动，除了蠕动泵5，血液细胞分离耗材的管路4中还设置有控制阀，控制阀与蠕动泵5相结合可以对管路4中不同的管道流动方向和流动时间进行自动化控制。开启控制滤器清洗液8的所对应的控制阀，然后，启动蠕动泵5正转，使滤器清洗液8进入白细胞滤器1中冲出白细胞，并从白细胞滤器1中流进管路4中，自动加入到高速离心的离心杯3内。
52.作为本方案的一种实施方式，滤器清洗液8为设置在液体袋内的生理盐水，也可以在液体袋内设置其他滤器清洗液8。通过开启滤器清洗液8相对应的控制阀，启动蠕动泵5正转，让滤器清洗液8进入白细胞滤器1中反冲出白细胞，并从白细胞滤器1的流出掺杂有白细胞的生理盐水一起流进管路4中，自动加入到高速离心的离心杯3内。
53.可通过两次清洗的方式反冲出白细胞，第一次清洗方式为蠕动泵5转速引起流速为200m/s，流过的容量50ml。第二次清洗方式为蠕动泵5转速引起流速为90m/s，流过的容量为30ml。从而能够彻底将白细胞滤器1中的白细胞无损伤、保持白细胞活性的方式让白细胞流入管路4中(由于白细胞滤器1中混有血细胞，所以会形成血细胞混合液流入)，通过开启其他部分的控制阀，以运用蠕动泵5运送管路4中的液体随着设定好的管路4路径(与分离液7的流入路径会大部分重合)流入离心杯3中。此时的离心杯3仍在高速离心中，流入离心杯3后，利用淋巴细胞分离液7对血细胞混合液的细胞进行分离，使血细胞混合液的各类型细胞(红细胞、pbmc、血小板等)在密度梯度离心的原理下在液体中分出多层，这样高速的离心下进行分层能够更好的、更快地分层，提高细胞离心的效率。
54.通过血液细胞分离耗材的管路4将离心处理后的pbmc液抽出离心杯3，并将离心杯3内的剩余细胞混合液排至废液袋6；
55.作为本方案的一种实施方式，所述离心杯3在进行pbmc液的转移、排废料和冲洗时均采用蠕动泵5对管路4进行控制，蠕动泵5反转，并通过控制阀对不同的管路4通道进行控制。
56.具体的抽取pbmc液和排废料的方法为：开启空液体袋相对应的控制阀，以及部分抽取管路4所需的控制阀，让蠕动泵5反转，对离心杯3中的pbmc分离出的pbmc液(在分层中的某一层t细胞层)进行抽取，抽取到空的液体袋中。
57.作为本方案的另一种实施方式，所述离心处理后的pbmc液被抽出离心杯3，并将离心杯3内的剩余细胞混合液排至废液袋6后还需要用管路清洗液9将离心杯3冲洗干净。在将离心杯3中离心后的材料分别抽出后，对离心杯3进行清洗保证了pbmc液在离心杯3中再次进行处理时的纯度。具体的清洗过程为：抽取完后切换控制阀，将空液体袋对应的控制阀关闭，打开排废管路4所对应的控制阀，进而实现管路4的切换，切换至排废管路4。然后控制蠕动泵5反转，将剩余在离心杯3中的混合液进行抽取并排至废液袋6。最后再关闭排废管路4所对应的控制阀，再次切换至切换至入管路清洗液9的控制阀，利用管路清洗液9将离心杯3清洗干净。管路清洗液9有多种，优选地，采用生理盐水作为清洗离心杯3和管路4的清洗液。
58.将抽出的pbmc液加入到离心杯3中，并通过pbmc分离试剂中的清洗液对pbmc液进行清洗；
59.作为本方案的一种实施方式，所述pbmc分离试剂中的清洗液对pbmc液进行清洗时，采用滤器清洗液8清洗两遍，并进行浓缩。最后对pbmc液进行清洗和浓缩的过程也是在血液细胞分离耗材的管路4中，通过蠕动泵5和控制阀进行自动化的无菌处理过程。
60.具体地，对pbmc的清洗过程为：开启装有pbmc液的液体袋所对应的控制阀，使液体袋中的pbmc液随着设定的管路4流入离心杯3中，并用管路清洗液9清洗两遍，优选地，管路清洗液9可以采用生理盐水。最后还需要对清洗后的pbmc液进行浓缩。具体的，采用在离心杯3中进行离心和抽取的方式不断浓缩至所需的密度。
61.在进行浓缩时，可以在每次浓缩之后对pbmc液进行取样检测，然后进行密度计算，直至得到所需要的浓度。
62.最后将清洗好的pbmc液收集至最终产品袋。
63.作为本方案的一种实施方式，进行制剂的过程为：打开重悬液液体袋所对应的控制阀，开启蠕动泵5，将重悬液液袋中的200ml重悬液溶液通过管路4进入离心杯3，之后关闭所有阀，开始离心杯3正转和反转的混匀；
64.最后开始分装和收集最终产品，具体操作为：启动离心杯3，转速升至50rpm，通过管夹的开关，依次收集最终产品至最终产品袋中，打开最终产品袋相应的控制阀，开启蠕动泵5，将离心杯3中的终产品样品通过流道进入50ml最终产品袋，之后关闭所有阀。
65.以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。