三种植物源生物碱类化合物抗PEDV的活性筛选及应用

三种植物源生物碱类化合物抗pedv的活性筛选及应用
技术领域
1.本发明属于植物源抗病毒药物活性筛选技术领域，具体为3种植物源生物碱类化合物体外抗pedv活性筛选及应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起猪的一种接触性急性肠道传染病，以消化道(粪口)为主要传播途径，也可经呼吸道传染，可发生于任何年龄的猪，其主要特征为初生仔猪呕吐、腹泻、脱水，致死率极高。
3.ped于1971年首次在英国被发现，80年代后期开始在国内蔓延开来，1995年开始使用二联灭活苗或弱毒苗进行猪传染性胃肠炎和ped的联合预防。但由于冠状病毒是单链rna病毒，在很多条件下，该病毒会变异或基因重组，导致ped呈现了新的流行特征，表现为猪只死亡率极高(90-100％)、疫苗防控效果很差，免疫过的猪群照常暴发pedv。2010年底，全国大部分地区的猪场开始大规模暴发ped，其中一周龄内仔猪发病率可达100％，死亡率高达80-100％，全国仔猪死亡估计有上千万头，致使我国猪肉价格不断上涨。2013年，美国首次发现pedv变异毒株，在短短几个月内迅速蔓延至16个州，造成至少700万头猪只的死亡和9-18亿美元的经济损失。pedv已由东南亚迅速蔓延至全球，给全世界养猪业的疾病防控带来了严峻的挑战。我国学者2017年对325个规模猪场425份粪便或肠道样品进行检测，pedv阳性检出率为40.94％(174/425)，表明pedv仍是危害规模猪场的常见病原。
4.由于pedv毒株易发生变异，用疫苗控制ped的效果不是很理想。目前，防控ped尚无有效的临床药物，而对于发病的仔猪又亟需有效的药物进行治疗，因此，开发抗pedv药物具有重要的现实意义。
5.cho等从柠檬清风藤叶中分离得到已知结构酚类化合物sabphenol a、sabphenol b均表现出很强抗pedv活性，其机理是抑制pedv复制，其ic50分别为7.5和8.0μm。yang等从山茶花中分离得到4个齐墩果烷型五环三萜化合物，它们对pedv复制表现出很强的抑制作用，主要通过抑制pedv基因编码的n蛋白、s蛋白和m蛋白合成来影响病毒复制，此项研究表明这4个化合物可作为有前途的化学结构骨架通过抑制病毒复制来治疗pedv感染。李中华证实槲皮素可以有效地抑制pedv感染，该化合物可通过结合pedv 3c样蛋白酶并抑制其活性。xu等证实体外vero和ipec-j2细胞(猪小肠上皮细胞)实验中，16mg/ml芦荟提取物能够使pedv完全失活，其抑制机制是在病毒生命周期后期，但不作用于病毒基因组和s1蛋白。小鼠毒性实验证实芦荟提取物在100mg/kg浓度相对安全，它能降低猪肠道病毒载量和病理改变，保护新生仔猪免受高致病性pedv变异株gds01感染的致死性攻击，说明芦荟提取物能有效抑制pedv在体内的感染。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.国内外植物源天然产物抗pedv的活性研究相对较少，且其活性筛选主要在细胞水平，目前还没开发出有效的抗pedv药物，亟需继续深入开展植物源天然产物抗pedv的活性筛选和应用研究。
8.(二)技术方案
9.本发明的目的为提供一种植物源化合物抗pedv的药物筛选，其步骤如下：
10.(a)非洲绿猴肾细胞(vero细胞)的培养；
11.(b)病毒(pedv-dr13
att
、rpedv-δorf3-gfp)的制备；
12.(c)生物碱化合物的准备；
13.(d)抗pedv活性筛选及其结果(包括si值、对pedv增殖的影响、pedv感染不同时期化合物抗pedv病毒效果等)；
14.(e)抗pedv活性的初步作用机制研究。
15.优选的，所述vero细胞在培养时，需在37℃水浴中预热生长培养基、pbs和胰蛋白酶消化液。胰酶终止消化时间判断：镜检观察，待细胞圆缩，贴壁细胞即将脱落时，弃掉胰酶终止消化；并加适量生长培养液将之稀释成约2
×
105个/ml细胞悬液，分瓶，放入37℃、5％的co2培养箱中培养。培养液中加入100μg/ml链霉素和青霉素(invitrogen)用以防止细菌感染。
16.优选的，所述的病毒(pedv-dr13
att
、rpedv-δorf3-gfp)在制备时，使用病毒维持液将moi为0.1-0.01的病毒接种到培养24h长成单层的vero细胞中，吸附2h后，吸弃接种液，在细胞瓶中补加适量的病毒维持液，待培养至80％-90％细胞病变时，反复冻融3次，离心(1500rpm，5min)收集上清，最后将病毒储存在-80℃环境下以留备用。
17.优选的，所述母液在进行制备时，先查阅文献，后对购买的千金藤素(cepharanthine，cep)、汉防己甲素(tetrandrine，tet)、防己诺林碱(fangchinoline，fan)等3种植物源生物碱类化合物标准品通过dmso进行溶解，配置成20mm的母液，最后储存在-80℃环境下以留备用。
18.优选的，抗pedv活性筛选方法为mtt法，先将vero细胞接种到96孔板中(100μl/孔)培养24h，使用实验浓度范围为1～40μm的待测化合物处理细胞，不同浓度6个复孔，同时设置dmso对照组，继续培养3d，采用mtt法检测化合物的细胞毒性。根据类似的方法，10
3.5
tcid
50
的pedv-dr13
att
吸附细胞2h，pbs清洗2次，在无细胞毒性的浓度范围内加入待测化合物处理细胞3d，采用mtt法检测化合物的抗病毒活性。cep、tet和fan的ec
50
分别为2.53、3.50和6.69μm，其cc
50
分别为29.92、24.78和30.19μm，其si分别为11.83、7.08和4.51。
19.优选的，10-20μm cep、tet和fan抗pedv效果较好，且20μm cep更能有效地在体外抑制pedv增殖。
20.优选的，在rpedv-δorf3-gfp感染细胞的不同时期，将20μm cep、20μm tet和20μmfan分别处理vero细胞或与病毒孵育：分为活性化合物预处理细胞对pedv增殖的影响(exp.1)，活性化合物与病毒同时加入细胞对pedv增殖的影响(exp.2)，活性化合物与病毒孵育混合物对pedv增殖的影响(exp.3)，病毒吸附细胞后活性化合物对pedv增殖的影响(exp.4)，病毒进入细胞后活性化合物对pedv增殖复制的影响(exp.5)。
21.优选的，将不同浓度的cep、tet和fan分别对rpedv-δorf3-gfp在感染前24h预处理，病毒吸附后共处理及感染后24h后处理，考察化合物在pedv感染不同时期抗病毒效果。
结果化合物在一定浓度范围内，随着3种药物浓度的提高，抗病毒效果逐渐增强，均呈现出药物抗pedv的剂量依赖性。高浓度的cep和tet预处理及共处理能基本完全抑制pedv的增殖；高浓度的fan预处理、共处理及后处理三个阶段抗pedv效果为70％左右。进一步探讨了上述化合物抗pedv作用机制，研究发现20μm cep、tet、fan通过预处理细胞、与病毒同时加入细胞、与病毒孵育后感染等三种给药方式均能显著影响pedv的增殖。
22.优选的，筛选获得千金藤素、汉防己甲素、防己诺林碱3种植物源生物碱类化合物所表现的抗pedv活性及其预防治疗的作用机制，表明上述3种化合物是抗病毒药物开发中的一类重要化合物。
23.(三)有益的效果
24.本发明的有益效果在于：
25.(1)3种植物源生物碱类化合物抗pedv的活性筛选，通过vero细胞的培养、病毒(pedv-dr13
att
、rpedv-δorf3-gfp)的制备、生物碱化合物的准备、抗pedv活性筛选(mtt法)和作用机制研究等，且在筛选体系的各个环节中均涉及到了具体的实验步骤以及对实验结果的对比印证，首次发现3个生物碱化合物具有抗pedv活性，且进一步揭示了其抗病毒作用机制，结果可信度高，体现了本筛选方法的科学性和结果创新性。
26.(2)cep、tet和fan均具有很好的抗pedv活性，其ec
50
分别为2.53、3.50和6.69μm，其cc
50
分别为29.92、24.78和30.19μm，其si分别为11.83、7.08和4.51。10-20μm cep、tet和fan抗pedv效果较好，且20μm cep更能有效地在体外抑制pedv增殖。
27.(3)在一定浓度范围内，随着3种药物浓度的提高，抗病毒效果逐渐增强，均呈现出药物抗pedv的剂量依赖性。高浓度的cep和tet预处理及共处理能基本完全抑制pedv的增殖；高浓度的fan预处理、共处理及后处理三个阶段抗pedv效果为70％左右。进一步探讨了上述化合物抗pedv作用机制，研究发现20μm cep、tet、fan通过预处理细胞、与病毒同时加入细胞、与病毒孵育后感染等三种给药方式均能显著影响pedv的增殖。
附图说明
28.图1为三种生物碱类化合物的细胞毒性
29.图2为三种生物碱类化合物的抗病毒活性
30.图3为千金藤素在细胞水平抑制pedv增殖
31.图4为三种生物碱类化合物抑制vero细胞中pedv n蛋白的表达
32.图5为pedv感染不同时期千金藤素对pedv增殖的影响
33.图6为千金藤素处理组上清液中的病毒m蛋白的mrna水平和病毒载量
34.图7为活性化合物预处理细胞对pedv增殖的影响
35.图8为活性化合物与病毒同时加入细胞对pedv增殖的影响
36.图9为活性化合物与病毒孵育混合物对pedv增殖的影响
37.图10为病毒吸附细胞后活性化合物对pedv增殖的影响
38.图11为病毒进入细胞后活性化合物对pedv增殖复制的影响。
具体实施方式
39.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1千金藤素细胞毒性的测定
41.在96孔板中以100μl/孔接种2
×
105个/ml的vero细胞悬液，待培养24h后长成单层细胞。用病毒维持液将各化合物的母液进行系列稀释。细胞培养24h后，弃培养液，用pbs按100μl/孔清洗2次，轻轻拍干。再以200μl/孔加入不同浓度的化合物进行孵育，每个浓度6个复孔，设置细胞对照组和溶剂对照组，将细胞板置于37℃co2培养箱中进行培养，每日镜检观察细胞状态。培养3d后，向培养板中避光加入mtt溶液20μl/孔(5mg/ml)，培养作用4h，弃反应液，以150μl/孔沿侧壁轻柔加入dmso，室温摇晃作用10min，置于酶标仪上测定490nm波长处的吸光度，并根据以下公式(1)计算细胞存活率，利用spss20软件计算化合物的半数中毒浓度(cc
50
)。
[0042][0043]
三种生物碱的细胞毒性结果见图1。千金藤素在0.5～60μm实验浓度范围内的细胞毒性如图1a所示，结果发现千金藤素在0.5～30μm浓度范围内基本无毒，而在30～40μm范围内其细胞毒性急剧加大，当浓度处于50μm及以上时则完全致死；综合以上结果分析，千金藤素的最大无毒浓度(cc0)为20μm，其cc
50
为29.92μm。汉防己甲素在1～40μm实验浓度范围内的细胞毒性(图1b)，其cc0为20μm，在20～30μm范围内其细胞毒性急剧加大，当浓度达到30μm时则具有很强的细胞毒性，其cc
50
为24.78μm。防己诺林碱在1～40μm实验浓度范围内的细胞毒性(图1c)，其cc0为20μm，cc
50
为30.19μm，在30～40μm范围内其细胞毒性急剧加大，40μm时则完全致死。
[0044]
实施例2千金藤素抗病毒活性的测定
[0045]
在96孔板中以100μl/孔接种2
×
105个/ml的vero细胞悬液，待培养24h后长成单层细胞。弃培养液，以100μl/孔加入10
3.5
tcid
50
的pedv-dr13
att
吸附细胞2h。用病毒维持液将各化合物的母液进行系列稀释。病毒感染细胞2h后，弃病毒液，用pbs按100μl/孔清洗2次，轻轻拍干。再以200μl/孔加入不同浓度的化合物进行处理，每个浓度6个复孔，并设置细胞对照组、病毒对照组和溶剂对照组，继续在37℃co2培养箱中进行培养，每日镜检观察细胞状态。培养3d后，向96孔板中以20μl/孔避光加入5mg/ml的mtt溶液，培养作用4h，弃反应液，以150μl/孔沿侧壁轻柔加入dmso，室温摇晃作用10min，置于酶标仪上测定490nm处的吸光度，并根据以下公式(2)计算病毒抑制率，利用spss20软件计算化合物的半数有效浓度(ec
50
)。
[0046][0047]
三种生物碱的抗病毒活性结果见图2。cep、tet和fan等3种化合物的抗病毒活性cc
50
、ec
50
和si见表1。
[0048]
表1抗病毒活性化合物cc
50
、ec
50
和si
[0049][0050]
实施例3千金藤素体外抑制pedv增殖
[0051]
不同浓度的cep分别与pedv共同处理vero细胞，作用36h后，检测上清培养液中病毒m蛋白的mrna水平，并滴定上清培养液中的病毒感染力，结果见图3(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05)。cep作用36h后的上清培养液经qpcr检测(图3a)，仅添加溶剂dmso的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为10
5.37
copies/μl，10μm cep处理组的拷贝数为10
4.37
copies/μl，15μm cep处理组为10
3.89
copies/μl，20μmcep处理组拷贝数为10
3.21
copies/μl，与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比，这三种浓度的cep处理组的m蛋白mrna水平均存在显著差异，均能抑制pedv增殖；同时，随着cep浓度逐渐升高，上清培养液中的m蛋白mrna水平逐渐降低，抑制病毒增殖能力逐渐增强，表明cep对病毒的抑制作用呈剂量依赖性。在处理组病毒滴度的检测中(图3b)，仅添加溶剂dmso的病毒对照组的病毒滴度为10
7.17
tcid
50
/ml，10μm、15μm和20μm cep处理组的病毒滴度分别为10
5.5
tcid
50
/ml、105tcid
50
/ml，和10
4.83
tcid
50
/ml，与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比，这三种浓度的cep处理组的病毒滴度均存在显著差异；同时，随着cep浓度逐渐升高，上清培养液中的病毒滴度逐渐降低，抑制病毒增殖能力逐渐增强，与m蛋白mrna检测水平呈现一致性。
[0052]
另外，通过免疫荧光分析法(ifa)检测化合物对pedv的抑制作用。cep作用24h后，固定细胞，然后进行免疫荧光实验，采用兔抗pedv n蛋白抗体作为一抗，alexa fluor 488标记山羊抗兔igg(h l)作为二抗检测化合物处理后细胞内病毒n蛋白的表达水平。结果见图4，cep作用24h后，蓝色荧光表明仅添加溶剂dmso的细胞对照组内细胞数量与正常细胞对照组的细胞数量无明显差异，说明化合物溶剂dmso无细胞毒性。感染病毒的细胞分别经5、10、20μm cep处理后，绿色荧光表明病毒蛋白的表达水平远低于仅添加溶剂dmso的病毒对照组，说明cep具有很强的抗病毒效果；同时，随着cep浓度的升高，n蛋白表达水平逐渐降低，表明cep对病毒的抑制作用呈剂量依赖性，与前文cep处理组病毒滴度检测及m蛋白mrna水平的结果相一致，表明cep在细胞水平上能显著抑制pedv的增殖。
[0053]
实施例4pedv感染不同时期千金藤素对pedv增殖的影响
[0054]
千金藤素(cep)对细胞进行预处理、共处理及后处理后对pedv增殖的影响见图5(a为pedv感染后3天的荧光图片，其中绿色荧光表示病毒增殖量；b为在pedv感染后4天不同处理组的病毒抑制率)。与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比，图5a显示在预处理阶段，cep低剂量(1μm、5μm)对pedv增殖的影响不大，1μm cep基本不能影响pedv增殖，而随着剂量的增大，逐渐呈现对pedv的抑制作用，5μm cep处理组与对照相比，荧光量已经减少，10μm cep抗pedv效果较佳，15μm和20μm cep基本上能完全抑制pedv增殖；经mtt分析得到的病毒抑制率数据(5b)也证实了上述的结果，不同浓度的cep预处理对pedv的增殖呈现剂量依赖性，20μm cep能100％抑制pedv的增殖。当pedv感染时，用cep同时处理细胞，发现随着cep剂量的增大，对病毒的抑制效果增强，20μm cep基本上能完全抑制pedv增殖。当pedv感染细胞24h(24h.p.i)后，用不同浓度的cep处理细胞，随着cep剂量的增大，对病毒的抑制效果增强，但效果不理想，20μm的cep不能完全抑制pedv增殖，病毒抑制率只有51％。
[0055]
综合比较后发现：cep在上述三个处理阶段给药，在一定浓度范围内，随着cep浓度的升高，细胞内病毒增殖逐渐减少，抗病毒效果逐渐增强，均呈现出cep抗pedv的剂量依赖性。比较三个处理阶段cep的抗病毒效果，在一定浓度范围内，预处理组cep能更有效抑制pedv，共处理组效果次之，后处理组则不能完全抑制pedv增殖。
[0056]
实施例5cep抗pedv增殖机制的初步探索
[0057]
(1)cep预处理细胞对pedv增殖的影响
[0058]
cep与长成单层的vero细胞孵育1h后，吸弃药物，感染rpedv-δorf3-gfp(moi＝0.01)，于36h.p.i和60h.p.i分别进行gfp的检测，结果见图7(cep)，并检测60h.p.i培养上清液中病毒m蛋白的拷贝数，结果见图6a(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05))的exp.1；检测60h.p.i上清液中的病毒滴度，结果见图6b的exp.1。与仅添加dmso溶剂的病毒对照组相比，cep处理组在36h.p.i和60h.p.i均无明显绿色荧光(gfp图像)，且细胞形态正常(亮场图像)，表明cep预处理细胞1h能抑制pedv增殖。60h.p.i上清液中，dmso溶剂的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为105copies/μl，病毒滴度为10
4.74
tcid
50
/ml，cep处理组的m蛋白mrna拷贝数为10
2.83
copies/μl，病毒滴度为102tcid
50
/ml，经统计分析，cep预处理组能显著地抑制pedv的增殖。
[0059]
(2)cep与病毒同时加入对pedv增殖的影响
[0060]
将20μm cep与rpedv-δorf3-gfp(moi＝0.01)同时加入长成单层的vero细胞，病毒吸附2h后，弃病毒与cep的混合物，继续培养36h、60h分别进行gfp的检测，并检测60h.p.i培养上清液中病毒m蛋白的拷贝数及上清液中的病毒滴度，结果见图8(cep)及图6(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05))的exp.2。与仅添加dmso溶剂的病毒对照组相比，cep与pedv共同加入组在36h.p.i和60h.p.i均无明显绿色荧光(gfp图像)，且细胞形态正常(亮场图像)，表明cep与pedv共同加入细胞进行吸附，cep能抑制pedv增殖。在60h.p.i上清液中，仅添加dmso溶剂的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为105copies/μl，病毒滴度为10
4.74
tcid
50
/ml，cep处理组的m蛋白mrna拷贝数为10
3.36
copies/μl，病毒滴度为10
2.83
tcid
50
/ml，经统计分析，cep与pedv共同加入细胞进行吸附，能显著降低pedv的增殖滴度及m蛋白mrna水平。
[0061]
(3)cep与病毒孵育混合物对pedv进入细胞的影响
[0062]
将20μm cep与rpedv-δorf3-gfp(moi＝0.01)共同孵育的混合物加入至长成单层的vero细胞，吸附2h后，弃混合物，继续培养36h、60h，分别进行gfp的检测，并检测60h.p.i培养上清液中病毒m蛋白的mrna水平及上清液中的病毒滴度，结果见图9(cep)及图6(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05))的exp.3。与仅添加dmso溶剂的病毒对照组相比，cep与pedv共同孵育的混合物在36h.p.i和60h.p.i均无明显绿色荧光(gfp图像)，且细胞形态正常(亮场图像)，表明cep与pedv孵育的混合物加入细胞进行吸附，cep能抑制pedv增殖。在60h.p.i上清液中，仅添加dmso溶剂的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为105copies/μl，病毒滴度为10
4.74
tcid
50
/ml，cep与pedv共同孵育混合物组的m蛋白mrna拷贝数为10
3.03
copies/μl，病毒滴度为10
3.33
tcid
50
/ml，经统计分析，cep与pedv共同孵育后，cep能显著降低pedv的增殖滴度及m蛋白mrna水平。
[0063]
(4)病毒吸附细胞后cep对pedv增殖的影响
[0064]
将rpedv-δorf3-gfp(moi＝0.01)感染长成单层的vero细胞，于4℃冰箱吸附2h
后，再加入cep，于37℃培养箱孵育1h后弃cep，继续培养36h、60h，分别进行gfp的检测，并检测60h.p.i培养上清液中病毒m蛋白的拷贝数及上清液中的病毒滴度，结果见图10(cep)及图6(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05))的exp.4。与仅添加dmso溶剂的病毒对照组相比，cep处理组在36h.p.i和60h.p.i均无明显绿色荧光(gfp图像)，且细胞形态正常(亮场图像)，表明cep影响pedv吸附后增殖。在60h.p.i上清液中，仅添加dmso溶剂的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为105copies/μl，病毒滴度为10
4.74
tcid
50
/ml，cep处理组的m蛋白mrna拷贝数为10
3.75
copies/μl，病毒滴度为10
3.67
tcid
50
/ml，经统计分析，pedv吸附后，cep能显著降低pedv的增殖滴度及m蛋白mrna水平，表明pedv吸附后，cep能够影响pedv后续过程或增殖。
[0065]
(5)病毒进入细胞后cep对pedv增殖复制的影响
[0066]
将rpedv-δorf3-gfp(moi＝0.01)吸附细胞后，加入cep，继续培养36h、60h，分别进行gfp的检测，并检测60h.p.i培养上清液中病毒m蛋白的拷贝数及上清液中的病毒滴度，结果见图11(cep)及图6(*表示与仅添加溶剂dmso的病毒对照组相比有显著差异，p＜0.05))的exp.5。与仅添加dmso溶剂的病毒对照组相比，cep处理组在36h.p.i和60h.p.i均有少量的荧光(gfp图像)，表明cep能抑制pedv增殖，但与前四种处理方式相比，在pedv进入细胞后的增殖阶段，cep的作用效果会差一些。在60h.p.i上清液中，仅添加dmso溶剂的病毒对照组的m蛋白mrna拷贝数为105copies/μl，病毒滴度为10
4.74
tcid
50
/ml，cep处理组的m蛋白mrna拷贝数为10
4.09
copies/μl，病毒滴度为10
4.17
tcid
50
/ml，经统计分析，pedv进入细胞后，cep处理组能显著降低pedv的增殖滴度及m蛋白mrna水平，表明病毒进入细胞后，cep可以影响pedv复制与增殖。
[0067]
综上，从cep的五部分实验的结果看出，经cep处理的五个实验阶段均能显著抑制pedv增殖(p《0.05)。对五个实验阶段的pedv m蛋白mrna水平进行统计分析，发现pedv吸附阶段的三个实验(exp.1-exp.3)pedv增殖量均显著低于pedv吸附后，再用cep处理(exp.5)的病毒增殖量(p《0.05)，表明cep主要通过影响pedv的吸附进入影响pedv增殖。
[0068]
尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。