一种载白藜芦醇的介孔二氧化硅纳米粒子及其应用

1.本发明具体涉及一种载白藜芦醇的介孔二氧化硅纳米粒子。


背景技术：

2.牙周炎是一种常见的口腔疾病，临床表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙周附着丧失、牙槽骨吸收、牙齿松动、脱落等。糖尿病是一种以高血糖为主要特征的全身代谢性疾病，其发病可累及多个器官，已成为致残率、死亡率仅次于肿瘤和心血管病的第三大疾病。最新研究表明，糖尿病与牙周炎之间存在明确的双向关系，牙周炎被视为糖尿病的第六大并发症。糖尿病患者牙周炎患病率更高，且炎症状况更加严重，另一方面，牙周炎会导致患者的胰岛素耐受性增加，降低机体的血糖代谢能力，从而显著提升糖尿病及一些非口腔类并发症的发病几率。
3.白藜芦醇(resveratrol,rsv)是含苯环和酚羟基结构的一种天然小分子，具有强大的抗氧化功能，可通过调节内源性抗氧化应激通路诱导产生一系列重要的抗氧化酶，比如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等等，促进自由基清除，在治疗糖尿病牙周炎方面具有应用前景。此外rsv还表现出可靠的抗炎作用，对心肌炎、气管炎、结肠炎等疾病具有一定治疗效果，可以降低il-6和tnf-α等炎症因子表达，另一方面，rsv可通过多种途径改善机体血糖代谢能力，rsv对糖尿病及其并发症如糖尿病性的心血管疾病、肾病、视网膜病变等均具有良好的治疗效果，但rsv存在水溶性差、代谢迅速和血浆半衰期短等缺点，限制了它在临床上的应用，因此需要通过特殊载药手段提升其稳定性，加强其药理作用。
4.专利cn104367552公开了一种载rsv的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒，仅提高了rsv的载药量和生物利用度，但对白藜芦醇的稳定性和缓释效果提升仍不理想。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种载rsv的介孔二氧化硅纳米粒子(rsv-loaded mesoporous silica nanoparticles,msn-rsv)，所述msn是经氨基化、羧基化的msn；所述rsv通过酯化反应固定于msn中。
6.进一步地，所述msn的粒径小于500nm，优选80nm。
7.本发明还提供了一种前述的msn-rsv在制备治疗牙周炎的药物中的用途。
8.进一步地，所述药物是治疗糖尿病型牙周炎的药物。
9.本发明还提供了一种前述msn-rsv的制备方法，它包括如下步骤：
10.1)氨基化介孔二氧化硅纳米粒子(msn-nh2)
11.取msn，分散于甲苯中，加3-氨丙基三乙氧基硅烷搅拌，离心，取沉淀，加入含3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中反应，收集固体，醇洗，离心，干燥，即得msn-nh2；
12.2)羧基化介孔二氧化硅纳米粒子(msn-cooh)
13.取步骤1)所得msn-nh2，加甲苯搅拌匀，再加琥珀酸反应，过滤，收集固体，醇洗，干燥，即得msn-cooh；
14.3)msn-rsv
15.取步骤2)所得msn-cooh，分散于二甲亚砜中，n,n'-羰基二咪唑反应，再加4-二甲氨基吡啶和rsv反应，离心，取固体，用pbs溶液洗涤，干燥，即得。
16.进一步地，步骤1)所述msn、甲苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和含3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯的质量体积比为0.5～5g：80ml：0.75ml：80ml；所述含3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为50μl/ml。
17.进一步地，步骤1)所述搅拌的温度为60℃，时间为20h；所述反应的条件为：先60℃反应12h，再70℃反应2h；所述干燥的温度为80℃。
18.进一步地，步骤2)所述msn-nh2、甲苯和琥珀酸的质量体积比为0.5～5g：80ml：150mg。
19.进一步地，步骤2)所述拌匀的温度为50℃；所述反应的温度为25～30℃，时间20～30h；所述干燥为真空干燥。
20.进一步地，步骤3)所述msn-cooh、二甲亚砜、n,n'-羰基二咪唑、4-二甲氨基吡啶和rsv的质量体积比为1g：60ml：0.4g：0.5g：1.5g；所述加n,n'-羰基二咪唑反应的条件为：60℃搅拌4h；所述加4-二甲氨基吡啶和白藜芦醇反应的条件为25～30℃搅拌24h；所述干燥为冷冻干燥。
21.进一步地，步骤1)所述msn是以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源制备而成。
22.本发明中所述的msn-rsv，通过氨基化-羧基化-酯化将rsv接枝于msn中，呈现椭圆、球形形态，粒径约80nm。接枝成功的msn-rsv具有稳定的自由基清除能力和抗炎效果，且作用时间较长，有效克服了rsv不稳定，作用时间短的缺点，优于直接使用rsv，以及现有技术中的基于msn包载rsv纳米体系，具备实际推广应用价值。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1 msn-rsv制备过程
26.图2 msn、msn-nh2、msn-cooh、msn-rsv的sem外观形貌(比例尺＝500nm)
27.图3 msn及msn-rsv的tem外观形貌(比例尺a1、b1为400nm，a2、b2为200nm)
28.图4粒子中rsv的保留率
29.图5 rsv和msn-rsv的自由基清除能力
30.图6分别诱导糖尿病牙周炎一周、两周，对照组、msn-cooh、rsv和msn-rsv组牙槽骨形态变化(a)和骨参数分析(b)
31.图7诱导糖尿病牙周炎一周、两周，对照组、msn-cooh、rsv和msn-rsv组牙周组织形态学变化的he染色结果
32.图8诱导糖尿病牙周炎一周、两周，对照组、msn-cooh、rsv和msn-rsv组牙周组织形
态学变化的masson染色结果
具体实施方式
33.实施例1本发明msn-rsv的制备
34.(1)制备msn
35.以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯。具体方法为：
36.称取1g十六烷基三甲基溴化铵溶解于480ml超纯水，搅拌，澄清后，加入3.5ml naoh溶液加热至80℃，再以1100转/分转速在磁力搅拌机上搅拌30min，之后滴加正硅酸乙酯5ml，使其充分反应2h，冷却后，离心取白色固体；量取150ml无水乙醇，加入3ml浓盐酸，混匀后与白色固体一起放入烧瓶，连接冷凝装置，70℃回流12h，离心取沉淀，重复3次，乙醇洗涤后80℃真空干燥12h。
37.经试验确认，市售购买的msn也能达到相同的效果。
38.(2)制备msn-nh239.称取1.0g msn超声分散于80ml无水甲苯溶液，随后加入0.75ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，将混合体系置于60℃恒温加热磁力搅拌器中搅拌20h，离心收集沉淀。调整3-氨丙基三乙氧基硅烷在无水甲苯中浓度为50μl/ml，体积80ml，将沉淀再次溶解，60℃反应12h后并70℃加热2h，此二次氨基化可进一步提高成功率。收集固体后乙醇清洗，离心，80℃干燥过夜获得msn-nh2。
40.(3)制备msn-cooh
41.将1g msn-nh2加入到80ml无水甲苯中，在50℃条件下搅拌混匀，然后加入150mg琥珀酸酐，室温反应24h，过滤分离出固体，用乙醇洗涤，80℃真空干燥12h。
42.(4)制备msn-rsv
43.将1g msn-cooh分散在60ml二甲亚砜溶液中，加入0.4g n，n'-羰基二咪唑，在60℃条件下搅拌4h，冷却到室温后，避光加入0.5g 4-二甲氨基吡啶和1.5g rsv，室温下搅拌反应24h，离心后用pbs溶液洗涤，﹣50℃冻干，即得。
44.以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
45.试验例1本发明msn-rsv的应用研究
46.(1)msn-rsv的表征
47.1、方法
48.1.1 sem和tem方法表征
49.取按实施例1制备(图1)的msn、msn-nh2、msn-cooh、msn-rsv，通过sem和tem方法表征。具体方法为：称量10mg纳米粒子，加入乙醇超声分散30min，分别滴加到硅片和超薄碳膜铜网上，硅片上样品喷金后用sem扫描，超薄碳膜铜网上样品用红外灯干燥后用tem扫描测试。
50.1.2稳定性测试
51.取按实施例1制备的msn-rsv，通过测量rsv的释放来表征rsv的接枝稳定性(图1)。具体方法称取5mg msn-rsv溶解于10ml pbs溶液，放置于摇床上摇晃，依次于0、2、6、12、24、36、48、60、72、96、120、144和168h时离心，每次取上清2ml，在306nm处测od值，之后又补足2ml pbs。根据标曲方程计算每个时间点rsv累计释放量(cumulative release，cr)，接枝稳
定率以rsv保留率(rsv retention rate)表示，具体计算如下：
[0052][0053]
接枝率(grafting ratio，gr)计算公式如下：
[0054][0055]
其中m
t
为接枝上的rsv质量，即体系中rsv总质量减去游离的rsv质量。m0为体系中rsv的总质量。
[0056]
接枝量(grafting content，gc)计算公式如下：
[0057][0058]
其中mn为msn-cooh的总质量。
[0059]
2、结果
[0060]
2.1 sem和tem结果
[0061]
sem外观形貌结果见图2。msn、msn-nh2、msn-cooh和msn-rsv外观形貌无明显差异，表明各步骤修饰未对粒子形貌造成显著影响。所有纳米粒子呈现较均匀的球形或椭球形形状,平均粒径约为80nm。
[0062]
tem外观形貌结果见图3。msn在电镜下呈现经典的mcm-41介孔硅类型，特点为孔道呈六方有序排列。载药后六方介孔结构未明显改变，表现为粒径约80nm的椭球形状，与msn相比无明显差异。
[0063]
2.2 rsv保留率结果
[0064]
msn-rsv的载药量和接枝率分别为(33.73
±
0.61)％、(65.51
±
1.26)％。msn-rsv分散在ph值与人体接近的pbs溶液中(ph约7.4)。从图4可见：在最初2h，大约6％左右的rsv迅速释放，推测可能是游离rsv从粒子孔隙中扩散出来。随着时间的延长，甚至在168h后，都未能在上清中检测到明显游离药物，保留率为(93.33
±
0.15)％，说明大部分rsv成功接枝到了msn上，msn-rsv的接枝稳定性很高，这为后续材料能够长时间维持作用奠定了基础。
[0065]
(2)msn-rsv的抗氧化性测定
[0066]
1、方法
[0067]
采用dpph清除实验检测。dpph是一种性质比较稳定氮中心自由基，被甲醇或者乙醇溶解后呈现紫色。抗氧化剂能与自由基发生反应，加入到dpph醇溶液后可见紫色变浅，经过比色测量可以定量表征抗氧化能力的强弱。本实验具体操作如下：称量10mg rsv和接枝了10mg rsv的msn-rsv，分别用10ml乙醇溶液溶解，超声30min备用。称取1mg的dpph粉末溶于24ml无水乙醇，超声混匀。然后将dpph溶液分别和rsv、msn-rsv溶液按照体积比3:1混合，空白对照组添加等量的无水乙醇。上述步骤均要避光，并置于4℃冰箱保存。分别于0、1、2、3、4、5和6d后离心，吸取2ml上清到比色皿，在517nm处测od值。
[0068]
dpph清除率(radical scavenging activity，sa)计算公式如下：
[0069]
[0070]adpph
和a
sample
分别是空白对照管与样本管在517nm的od值。
[0071]
2、结果
[0072]
具体结果见图5：rsv的dpph清除率为(88.49
±
4.1)％，而msn-rsv组一开始未观察到明显的颜色变化，定量分析结果提示1天后清除率为(53.7
±
4.5)％。继续观察可见，rsv随后的5天清除率基本为0，说明rsv由于半衰期过短，与自由基反应后迅速分解。而msn-rsv表现出一种持续的清除能力，第二天清除10％左右的自由基，第三天清除量约5％，共5天左右，这说明在msn保护作用下，药物作用可长期维持。此外，msn-rsv总体清除率为(72.56
±
1.79)％。
[0073]
(3)msn-rsv的治疗效果
[0074]
1、方法
[0075]
首先通过联合应用高糖高脂饲料喂养和小剂量链脲霉素注射的方法建立大鼠糖尿病模型，再采用丝线结扎大鼠上颌第二磨牙的方法诱导牙周炎发生。通过在牙周袋局部注射给药(对照pbs溶液、msn-cooh、rsv、msn-rsv)治疗后1w和2w，借助micro-ct和组织学检测手段，评估msn-rsv的抗炎效果，具体操作如下：
[0076]
micro-ct分析：动物安乐死，剪开口角皮毛，分离肌肉，取出上颌骨，轻轻去除结扎丝线，生理盐水清洗，放在多聚甲醛中固定24h。通过micro-ct扫描大鼠上颌骨并进行三维重建，扫描精度为14μm。利用skyscan data viewer软件分析dicom数据：测量第二磨牙釉牙骨质界(cementoenamel junction，cej)到牙槽嵴顶(alveolar bone crest，abc)的距离(cej-abc)，每颗牙齿测量位点包括颊侧和舌侧的近中、中部和远中，记录这6个位点的平均值用以评价骨丧失程度(bone loss)。同时分析第二磨牙牙周的骨参数(不含牙根)：骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n)和骨小梁平均厚度(tb.th)。
[0077]
he染色：固定完成后，将大鼠颌骨样本转移到脱钙液中，每周换液两次，持续2-3周。之后经酒精梯度脱水，最后用石蜡将样本包埋。在石蜡切片机上将标本切成4μm厚薄片，捞片、晾干，在烤片机上烤30min，之后放入55℃孵箱过夜。染色前，60℃烤片半小时。二甲苯脱蜡20min后，依次通过无水、95％、80％和75％梯度酒精脱水5min并用pbs缓冲液清洗。将片架放入装有苏木素的染缸浸染3min，多余染液用自来水冲洗掉，放进盐酸酒精分化5s，快速冲洗后再放入氨水中返蓝3s。在显微镜下确定染色深度，酌情调整。然后把片子放入伊红染缸染色5min，清理掉多余染液，依次放入95％、无水酒精快速脱水(约2s)，置入烘箱烤干，二甲苯透明处理，中性树胶封片。
[0078]
masson染色：石蜡切片烤片、脱蜡和脱水处理同h&e染色。后续处理如下：
①
用weigert铁苏木素对细胞核染色，时间3min，之后滴加酸性乙醇液分化10s。
②
返蓝处理：使用masson蓝化液浸染3min后倾去，用纯水冲洗。
③
向切片上滴加丽春红品红染色液染色20s，该染料分子量小，能够穿透致密组织。之后用试剂盒弱酸工作液洗涤片子1min。
④
经过磷钼酸分化1min后，再次弱酸冲洗。
⑤
在切片上滴加苯胺蓝染色20s，该染料分子量大，主要浸染疏松组织区域。染色后用弱酸工作液洗涤1min。
⑥
95％、无水乙醇快速脱水。
⑦
二甲苯透明，中性树胶封片。
[0079]
2、结果
[0080]
micro-ct扫描结果展示了骨量的变化。从图6可见，对照组和msn-cooh组牙根大面积暴露，牙槽骨明显吸收，说明载体组没有明确的抗炎作用；另一方面，rsv组和msn-rsv组
骨量得以保留，表明了两者均具有抗炎治疗的效果，且msn-rsv组牙槽骨的完整性更高，说明相比于rsv，msn-rsv治疗效果更显著。我们通过牙齿冠状位ct图像观察牙槽骨吸收的细节，并在近颊、中颊、远颊、近腭、中腭和远腭6个位点用横线标明了cej和abc的位置。从两者距离测量数据的统计结果来看：在各个时间点，对照组骨吸收程度最明显，虽然msn-cooh有抑制骨吸收的趋势，但是定量结果与对照组相比差异不具有统计学意义；在第一周的时候，rsv和msn-rsv都能明显缓解骨吸收(p《0.05)，但两者治疗效果无明显差别；随着结扎时间的延长，当到了第二周时，在持续炎症刺激下，rsv骨丧失程度高于第一周，说明在第二周rsv的治疗效果基本消失，而msn-rsv仍保留最低的骨丧失值，具体为(0.8733
±
0.092)mm，说明长期炎症刺激下，msn-rsv仍能继续发挥显著的骨组织保存作用。对bv/tv、tb.n和tb.th骨参数表征结果与上述结果变化趋势一致，进一步表明msn-rsv能够在较长的时间段内发挥药理作用：结扎1周后，msn-cooh与对照组比较差异没有统计学意义，表明载体本身对牙槽骨吸收过程不会产生影响。在第一周，msn-rsv和rsv与对照组相比有较高的bv/tv值(p《0.05)，表明两组样本都能有效留存骨量和缓解骨吸收进展，并且msn-rsv的tb.n值、tb.th值最高，表明msn-rsv治疗效果最佳。当牙周炎诱导两周，仅有msn-rsv组能够持续地实现留存骨量和缓解骨吸收的效果，bv/tv、tb.n和tb.th值显著高于对照组。
[0081]
从图7可见：对照组的h&e切片上有大量的炎性细胞浸润，胶原纤维受到炎症破坏，排列紊乱，形成了大小不一的裂隙，结扎诱导两周后，牙槽骨可见比较大的吸收陷窝。msn-cooh组同样也观察到了炎性细胞浸润和骨吸收陷窝的形成。rsv和msn-rsv处理后干预了炎症的进展，炎性渗出和组织破坏程度减轻，胶原纤维排列规律，相对粗壮，表明两者具备有抗炎治疗的能力。
[0082]
从图8可见：牙周韧带由较粗的胶原纤维束构成，环绕牙根，起到联结牙齿与牙槽骨的作用。masson染色方法是经典的纤维显色法之一。通过masson切片，我们更清晰看到1周时rsv组纤维疏松、排列紊乱，而msn-rsv组纤维密集，排列具有方向性；2周的结果显示rsv组出现了组织崩解，而msn-rsv组仍保留更多的牙周纤维，表明msn-rsv组具有更稳定和更长时间的作用效果。