新白叶藤碱衍生物在制备治疗结直肠癌药物中的应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种新白叶藤碱衍生物在制备治疗结直肠癌药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌对人类生命健康造成了较大的威胁。目前结直肠癌治疗方法较多，其中化学疗法依旧是临床常用的治疗手段。但是，化学疗法也存在着副作用大，预后差，容易产生耐药性等问题。因此，很有必要去寻找新的治疗结直肠癌的药物来解决这些问题。
3.新白叶藤碱是一种从传统非洲草药中分离出来的生物碱，其广泛的生物活性在过去几十年中得到了阐明，也有报道可引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。化合物衍生物往往可能具有更好的活性。
4.本发明发现新白叶藤碱衍生物z49对其他癌症细胞的抑制效果较差，仅能够特异性的抑制结直肠癌细胞的增殖，并促进结直肠癌细胞的凋亡；而且新白叶藤碱衍生物z49治疗结直肠癌的效果优于临床常用药物5-fu；其对正常肠上皮细胞毒性也较小，安全性较好。因此新白叶藤碱衍生物z49可用于制备治疗结直肠癌药物，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种新白叶藤碱衍生物在制备治疗结直肠癌药物中的应用。具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用，所述新白叶藤碱衍生物的结构式如下式(ⅰ)所示：
[0007][0008]
优选地，所述新白叶藤碱衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
[0009]
优选地，所述剂型包括片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0010]
优选地，所述新白叶藤碱衍生物的制备方法为：将5-氯-2-(甲氨基)苯甲醛、6-甲氧基吲哚、p-tsa在无水乙醇中回流反应12h；冷却至室温，将反应物用naoh洗涤，并将水层用二氯甲烷萃取，合并有机层用无水硫酸镁干燥，浓缩、纯化即得。
[0011]
优选地，所述5-氯-2-(甲氨基)苯甲醛的制备方法为：0℃，将过氧化氢和6-氯-1-甲基碘化喹啉的混合物加到氢氧化钾水溶液和1，2-二氯乙烷中，反应30分钟；将所得混合物在室温搅拌48h，然后分离有机层，并将水层用二氯甲烷萃取；合并的有机层用无水硫酸
镁干燥；减压浓缩有机层，得5-氯-2-(甲氨基)苯甲醛。
[0012]
优选地，所述6-氯-1-甲基碘化喹啉的制备方法为：在氮气条件下，将6-氯喹啉和ch3i 在异丙醇中的混合，90℃加热反应3h，冷却至室温，用异丙醇/乙酸乙酯的混合物洗涤，得 6-氯-1-甲基碘化喹啉。
[0013]
本发明的有益效果是：本发明意外发现，新白叶藤碱衍生物z49可浓度时间依赖性地抑制结直肠癌细胞的增殖，并促进结直肠癌细胞的凋亡；而且新白叶藤碱衍生物z49治疗结直肠癌的效果优于临床常用药物5-fu，其对正常肠上皮细胞毒性也较小。因此新白叶藤碱衍生物z49可用于制备治疗结直肠癌药物，具有良好的应用前景。
附图说明
[0014]
图1新白叶藤碱衍生物z49的合成路线；
[0015]
图2mtt方法检测新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞的抑制作用；
[0016]
图3新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞hct116迁移的影响；
[0017]
图4细胞克隆实验z49对结直肠癌细胞的克隆形成抑制作用；
[0018]
图5hoechst33258染色实验分析新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞hct116凋亡的影响；
[0019]
图6流式细胞仪分析新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞hct116凋亡的影响；
[0020]
图7新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞hct116活性氧生成的影响。
具体实施方式
[0021]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
[0022]
以下实施例中所述的人结直肠癌细胞系hct116来源于atcc。
[0023]
实施例1新白叶藤碱衍生物z49的合成
[0024]
新白叶藤碱衍生物z49的合成路线如图1所示，具体合成方法为：
[0025]
(1)6-氯-1-甲基碘化喹啉的合成：在氮气下，将6-氯喹啉(7.7mmol)和ch3i(11.6mmol) 在异丙醇(1m)中的混合物在90℃下加热3h，将反应冷却至室温。通过真空过滤分离得到的沉淀，用异丙醇/乙酸乙酯(1:1)的混合物洗涤，并真空干燥，所得黄色固体即为6-氯-1
‑ꢀ
甲基碘化喹啉；
[0026]
(2)5-氯-2-(甲氨基)苯甲醛的合成：将过氧化氢(6.4ml，35％)和上述(1)获得的目标化合物2(6-氯-1-甲基碘化喹啉，在15ml水中的浓度15mmol)的混合物在0℃下加到含0.148mol氢氧化钾的水溶液(30ml)和1，2-二氯乙烷(30ml)中，超过30分钟。将所得混合物在室温搅拌48h，然后分离有机层，并将水层用二氯甲烷(30ml
×
3)萃取。合并的有机层用无水硫酸镁干燥。减压浓缩有机层，得到5-氯-2-(甲氨基)苯甲醛，为黄色油状物；
[0027]
(3)新白叶藤碱衍生物z49的合成：在50ml圆底烧瓶中加入上述(2)中合成的5-氯
ꢀ‑
2-(甲氨基)苯甲醛(5mmol)以及6-甲氧基吲哚(5mmol)和p-tsa(5mmol)，加入无水乙醇(10ml)混合，在空气中搅拌回流12小时。冷却至室温后，将反应混合物用1m的naoh (50ml)洗涤，并将水层用二氯甲烷(3
×
80ml)萃取。然后将合并的有机层用无水硫酸镁干燥。减压浓缩有机层，残余物通过硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(2:1)除去杂质，然后用二氯
甲烷/甲醇(40:1)洗脱，得到白叶藤碱衍生物z49，化合物为红色固体，产率62％；谱图为red solid,m.p.180.11-181.23℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.64(s,1h),8.14(s, 1h),7.97(d,j＝7.1hz,1h),7.94(d,j＝8.0hz,1h),7.78(d,j＝9.1hz,1h),7.13(s,1h),6.77 (d,j＝8.4hz,1h),4.26(s,3h),3.87(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ161.77,157.96, 156.50,134.85,129.84,128.39,128.35,126.27,125.57,122.78,122.06,117.39,117.16,107.93, 102.17,55.74,33.34.ms-esi m/z:calcd for c
17h13
cln2o[m h]

:297.1528；found:297.1531。
[0028]
结构式如下式(ⅰ)所示：
[0029][0030]
实施例2新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞的抑制作用
[0031]
分别用新白叶藤碱衍生物z2-z48以及本技术所述的新白叶藤碱衍生物z49处理过后的hct116细胞，加入10μl的5mg/ml的mtt溶液，在细胞培养箱中继续孵育4h；孵育完成后，将96孔板中的液体吸出，每孔加入100μl的dmso溶液，在摇床上设置转速120r/min 孵育30min。
[0032]
用酶标仪测量490nm处吸光度值，计算不同新白叶藤碱衍生物对hct116细胞ic
50
。
[0033]
其中新白叶藤碱衍生物z2-48的结构式如下所示：
[0034]
[0035][0036]
不同新白叶藤碱衍生物对hct116细胞ic
50
结果如下表1所示，其中新白叶藤碱衍生物 z2-48对hct116细胞的抑制效果较差，只有本技术所述的新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞具有显著的抑制活性，其ic
50
仅为0.35
±
0.04μm。
[0037]
表1新白叶藤碱衍生物对结直肠癌细胞hct116的ic
50
(μm)结果
[0038][0039]
实施例3新白叶藤碱衍生物z49对结直肠癌细胞的抑制作用
[0040]
1.mtt法检测新白叶藤碱衍生物对hct116等细胞的抑制作用
[0041]
分别用不同浓度的新白叶藤碱衍生物z49和阳性药5-fu孵育hct116细胞48h，之后在 96孔板中每孔加入10μl的5mg/ml的mtt溶液，在细胞培养箱中继续孵育4h。孵育完成后，将96孔板中的液体吸出，每孔加入100μl的dmso溶液，在摇床上以120r/min转速孵育30min。然后用酶标仪在490nm测量吸光度值，计算其抑制率。
[0042]
分别用不同浓度的新白叶藤碱衍生物z49孵育caco-2，ags，panc-1，smmc7721， hiec细胞48h，其他操作同上，并计算ic
50
。
[0043]
z49和5-fu对hct116的mtt实验结果如图2所示，其中左侧为本发明所述化合物新白叶藤碱衍生物z49，右侧为阳性药5-fu，在同浓度下对hct116细胞抑制率z49显著强于 5-fu。另外，z49对不同细胞的mtt实验结果显示，z49对结直肠癌hct116和caco-2细胞毒性很强，ic
50
分别为0.35和0.54μm，而对胃癌细胞ags的ic
50
为27μm，对人胰腺癌细胞panc-1，人肝癌细胞smmc7721，长上皮细胞hiec的ic
50
则均大于50μm。结果表明，化合物z49能够显著抑制结肠癌细胞，而对其他癌细胞和正常细胞毒性则较弱，甚至与正常细胞的ic
50
相近，基本不具有抑制作用。综上所述，本发明所述化合物新白叶藤碱衍生物z49 能够选择性地抑制结直肠癌细胞的增殖，其效果显著优于阳性药5-fu，且对正常肠上皮细胞毒性较小，表现出了高效低毒的特点。
[0044]
2.细胞迁移实验
[0045]
(1)hct116细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的rpmi培养基(hyclone， usa)中，置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养，当细胞密度达到80％-90％时，将细胞从细胞培养箱中拿出，用pbs将细胞洗涤两次，每次2ml；加入2ml胰酶，放入培养箱中
进行消化；
[0046]
(2)用含有1％胎牛血清的完全培养基将新白叶藤碱衍生物z49母液稀释为浓度为0.2μm 和0.4μm的溶液，将细胞密度调整为5
×
104cell/孔，每孔加入含有新白叶藤碱衍生物z49的细胞悬液100μl，将细胞悬液加入到24孔板小室的上室；
[0047]
(3)在24孔板小室的下室加入600μl含有20％的胎牛血清的完全培养基。将24孔板放入细胞培养箱中继续培养48h；
[0048]
(4)将24孔板上室和下室中的培养基小心吸出，用pbs清洗2次，在下室加入500μl 的4％的多聚甲醛固定液，在室温固定30min；
[0049]
(5)将固定液吸出，用pbs清洗两次，加入0.1％的结晶紫染液300μl，进行染色，染色20min；
[0050]
(6)用pbs溶液清洗小室至溶液澄清，将小室晾干，置于倒置显微镜下观察细胞的染色情况。
[0051]
结果如图3所示，本发明所述的新白叶藤碱衍生物z49能够显著抑制结直肠癌细胞的迁移。
[0052]
3.细胞克隆实验
[0053]
(1)当hct116细胞密度达到80％-90％时，按照上述步骤进行消化，以1000cell/孔的密度进行铺板(24孔板)，将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右。
[0054]
(2)分别用50nm，100nm，200nm新白叶藤碱衍生物z49处理细胞；
[0055]
(3)新白叶藤碱衍生物z49处理细胞7-10天，每隔2天更换一次含药的培养基；
[0056]
(4)弃去培养基，用pbs小心清洗24孔板；
[0057]
(5)加入300μl 4％多聚甲醛固定细胞，室温固定30min；
[0058]
(6)将固定液吸出，用pbs清洗24孔板，随后加入0.1％的结晶紫染液染色，持续20min；
[0059]
(7)弃去结晶紫染液，用pbs清洗24孔板至澄清，将24孔板晾干，观察克隆细胞的数量。
[0060]
结果如图4所示，本发明所述的新白叶藤碱衍生物z49能够显著抑制结直肠癌细胞的克隆。
[0061]
4.hoechst33258染色实验
[0062]
(1)将直径为12mm圆形盖玻片浸泡在75％乙醇中，充分消毒后用1640培养基润洗，将盖玻片置于24孔板中，放置在超净工作台中备用；
[0063]
(2)当hct116细胞密度达到80％-90％时，按照上述步骤进行消化，以10
×
104cell/孔的密度进行铺板，将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右；
[0064]
(3)分别用0.2μm，0.4μm，0.8μm浓度新白叶藤碱衍生物z49处理细胞48h；
[0065]
(4)将24孔板中的培养基吸出，加入300μl的4％的多聚甲醛溶液，室温固定30min；
[0066]
(5)将24孔板中的固定液吸出，用pbs洗涤两次，用pbs将hoechst 33258染色液 (1mg/ml)稀释100倍，每孔加入300μl稀释过后的hoechst33258染色液，摇床孵育5分钟；
[0067]
(6)吸出hoechst33258染色液，用pbs洗涤3次，每次5min；
[0068]
(7)将盖玻片置于载玻片上，用荧光显微镜观察细胞，凋亡细胞的细胞核呈致密亮荧光，或呈碎块状致密亮荧光。
[0069]
结果如图5所示，用不同浓度的化合物z49处理hct116细胞48h后，随着化合物浓度的增加，hct116细胞出现了明显的细胞核皱缩，强蓝色荧光的细胞数目增加，并呈现出浓度依赖性。
[0070]
5.细胞凋亡实验
[0071]
(1)当hct116细胞密度达到80％-90％时，按照之前所述步骤进行消化，以6
×
105cell/ 孔的密度进行铺板，将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右；
[0072]
(2)分别用0.2μm，0.4μm，0.8μm浓度的新白叶藤碱衍生物z49处理细胞48h；
[0073]
(3)将6孔板中的培养基转移至10ml离心管中，用1ml pbs洗涤细胞，将洗涤液收集到10ml离心管中；
[0074]
(4)用不含edta的胰酶消化细胞，消化时间为1min，加入收集的培养基混匀细胞， 1000r/min，5min；
[0075]
(5)弃上清，加入1ml4℃预冷的pbs，重悬细胞，离心收集细胞。
[0076]
(6)弃上清，用去离子水按照1：3稀释结合缓冲液，6孔板中每孔加入300μl，调节其浓度为1-5
×
106cell/ml；
[0077]
(7)取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl annexinv/alexa fluor 488混匀后于室温避光孵育5分钟；
[0078]
(8)检测前再加入10μl 20μg/ml的碘化丙啶溶液(pi)，并加400μl pbs并混匀，立刻进行流式检测，用flowjo软件进行数据分析。
[0079]
分析结果如图6所示，新白叶藤碱衍生物z49作用于hct116细胞后，其凋亡细胞的比例从4.9％增加到52.9％，可以明显引起细胞的凋亡，并且具有浓度依赖关系。
[0080]
6.ros活性氧实验
[0081]
(1)当hct116细胞密度达到80％-90％时，按照之前所述步骤进行消化，以6
×
105cell/ 孔的密度进行铺板，将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h左右至细胞完全贴壁；
[0082]
(2)分别用0.2μm，0.4μm，0.8μm浓度的新白叶藤碱衍生物z49处理细胞48h；
[0083]
(3)用不含edta的胰酶消化细胞，消化时间为1min，加入1640培养基混匀细胞， 1500r/min，5min离心并弃上清；
[0084]
(4)加入不含血清的1640培养基，1500r/min，5min离心并弃上清，加入稀释1000倍的dcfh-da荧光探针0.5ml在37℃避光条件下孵育20min；
[0085]
(5)1500r/min，5min离心并弃上清,pbs洗涤两次，1500r/min，5min离心并弃上清；
[0086]
(6)加入0.5ml pbs重悬细胞并上机进行流式检测，用flowjo软件进行数据分析。
[0087]
分析结果如图7所示，新白叶藤碱衍生物z49作用于hct116细胞后，其dcf相对荧光强度从1上升到5.02，表明细胞活性氧含量明显上升并且具有浓度依赖关系。